LC-SIM-Orbitraq測定無土栽培水芹不同器官中有機酸含量

劉杰 劉吉祥 常雅軍 陳婷 劉曉靜 孫林鶴 姚東瑞

摘? ? 要：以水面無土栽培水芹品種金陵1號為材料，通過液相色譜串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜法（LC-SIM-Orbitraq）測定不同器官中的有機酸種類和含量。經(jīng)過色譜條件的優(yōu)化，25種有機酸得到較好的分離，在1×10-3～10 μg·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.991 0～0.999 9之間；在0.5、5、20 μg·mL-1的添加質(zhì)量濃度下，加標回收率在50.39%～125.32%之間；樣品穩(wěn)定性較好，日內(nèi)穩(wěn)定性在0.28%～3.99%之間，日間穩(wěn)定性在0.41%～6.63%之間。結(jié)果表明，金陵1號水芹不同器官中有機酸以草酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、奎尼酸和莽草酸為主，其中，根中草酸含量（w）最高，達（32 094.08 ± 1 600.77） μg·g-1，這可能是水芹環(huán)境適應(yīng)性強的主要原因之一；而莖、葉中蘋果酸、琥珀酸和檸檬酸含量較高，說明莖、葉口感風味更佳；此外，奎尼酸和莽草酸在莖、葉中含量相對較高，可將水芹用于奎尼酸和莽草酸的提取或功能保健食品的開發(fā)，具有較大的資源化利用潛力。

關(guān)鍵詞：水芹；無土栽培；液相色譜串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜法（LC-SIM-Orbitraq）；有機酸；含量

中圖分類號：S636.9 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2023）09-080-07

Determination of organic acids in different organs of soilless cultivated Oenanthe javanica by LC-SIM-Orbitraq

LIU Jie1， LIU Jixiang2， CHANG Yajun2， CHEN Ting1， LIU Xiaojing2， SUN Linhe2， YAO Dongrui2

（1. Nanjing Wondux Environmental Protection Technology Co.， Ltd.， Nanjing 211122， Jiangsu， China; 2. Jiangsu Engineering Research Center of Aquatic Plant Resources and Water Environment Remediation/Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences （Nanjing Botanical Garden Mem. Sun Yat-sen）， Nanjing 210014， Jiangsu， China）

Abstract： The species and content of organic acids in different organs of soilless cultivated water dropwort jinling No. 1 were determined by liquid chromatography single ion monitor orbitraq （LC-SIM-Orbitraq）. After the optimization of chromatographic conditions， 25 organic acids were well separated， and the linear relationship was good within the mass concentration range of 1×10-3-10 μg·mL-1， and the correlation coefficient was between 0.991 0 and 0.999 9. At the added concentration of 0.5， 5， and 20 μg·mL-1， the recovery rates of add standard were in the range of 50.39%-125.32%. The samples have a superior stability，the intra-day stability ranged from 0.28% to 3.99% and the inter day stability ranged from 0.41% to 6.63%. The results show that the major parts of organic acids in water dropwort jinling No. 1 are oxalic acid， succinic acid， malic acid， shikimic acid， citric acid and D-（-）-quinic acid. The oxalic acid in the root was the highest， reaching （32 094.08 ± 1 600.77） μg·g-1， which may be one of the main reasons for the strong environmental adaptability of water dropwort. The proportions of malic acid，succinic acid and citric acid in stems and leaves were higher than roots， indicating that stems and leaves had better taste and flavor. Moreover，the contents of D-（-）-quinic acid and shikimic acid in stems and leaves is higher than roots. Therefore， water dropwort can be used for D-（-）-quinic acid and shikimic acid extraction or functional health food development， and has great potential for resource utilization.

Key words： Soilless cultivated water dropwort; Liquid chromatography single ion monitor orbitraq （LC-SIM-Orbitraq）; Organic acids; Content

水芹[Oenanthe javanica（Bl.）DC.]，又名野芹、水英、楚葵等，為傘形科宿根性多年水生草本植物[1]。水芹是廣泛分布于我國各地的傳統(tǒng)特色蔬菜之一，以其鮮嫩的莖段和葉片為食，水芹口感清香，風味獨特，富含碳水化合物、可溶性糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素以及礦質(zhì)元素等人體所需的營養(yǎng)成分[1-3]，同時還含有豐富的膳食纖維、黃酮、揮發(fā)油、苯丙素、甾醇、脂肪酸等保健成分[4-7]，具有較高的營養(yǎng)價值和良好的保健功能[8]。此外，水芹還是一種傳統(tǒng)的藥用植物，具有增強免疫力[9]、抗炎[10]、抗肝損傷[11]等作用，臨床上具有降低血糖[12]、清熱利尿[3]等醫(yī)療功效。水芹已成為一種公認的藥食兩用的功能保健水生蔬菜，具有極大的資源化應(yīng)用潛力和開發(fā)價值[5]。目前，對水芹化學成分的研究主要集中于黃酮、總酚酸、揮發(fā)性油等藥用功能成分[3，5]，而對水芹中有機酸的研究鮮見報道。

有機酸是一種廣泛存在于生物體中的含有羧基的有機化合物，是水果和蔬菜中的酸味成分，會直接影響水果和蔬菜的口感、風味、營養(yǎng)以及加工產(chǎn)品的品質(zhì)[13]，同時，多種有機酸均具有一定的藥用功能以及特殊的功效[14]。蘋果酸和檸檬酸可以調(diào)節(jié)腸道功能，促進消化吸收[15]；還會促進三羧酸循環(huán)，具有抗疲勞的功效[16]。綠原酸具有預(yù)防酒精肝、改善炎癥反應(yīng)、抗糖尿病、抗氧化、抗菌等多種藥用功能[17-20]。此外，大量研究表明，熊果酸和齊墩果酸具有降低血脂和血糖、抗病毒、抗糖尿病等藥理作用[21-26]。因此，研究水果和蔬菜中有機酸的種類和含量對其口感風味和營養(yǎng)價值的了解以及藥理方面的應(yīng)用和功能保健食品的開發(fā)具有重要意義。

不同的栽培方式會顯著影響水果及蔬菜的品質(zhì)和營養(yǎng)價值[27-28]。水芹的栽培方式根據(jù)基質(zhì)可分為水面無土栽培和有土栽培，目前對水芹黃酮、揮發(fā)油、氨基酸等成分的研究主要基于土壤栽培，而對無土栽培水芹化學成分的研究較少[5，29]。近年來，大量氮、磷等營養(yǎng)元素進入水體，可為水生蔬菜提供生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)，且隨著土地面積逐漸減少，利用長江流域富營養(yǎng)化水體無土栽培水生蔬菜，對水體中過剩營養(yǎng)物質(zhì)的生態(tài)利用和土地資源節(jié)約具有重要意義[8]。因此，筆者的研究選取可修復(fù)富營養(yǎng)化水體的水芹品種金陵1號[1，30]，通過富營養(yǎng)化水體水面無土栽培方式，采用高效液相色譜串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜法（liquid chromatography single ion monitor orbitraq，LC-SIM-Orbitraq）對金陵1號水芹不同器官中的有機酸種類和含量進行測定，為水芹的資源化利用和功能性保健食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021年5—6月在江蘇省中國科學院植物研究所進行。供試水芹品種為金陵1號，以匍匐莖種植于江蘇省宿遷市漁樵專業(yè)合作社富營養(yǎng)化水體中。挑選長勢均一、狀態(tài)良好、無機械損傷的水芹植株，分別取500 g的新鮮根、莖、葉，每個部位3次重復(fù)，立即液氮速凍，粉碎備用。

丙酸、異丁酸、丁酸、草酸、乳酸、戊酸、異戊酸、丙二酸、己酸、異己酸、富馬酸、琥珀酸、苯甲酸、衣康酸、戊二酸、蘋果酸、水楊酸、辛酸、己二酸、酒石酸、庚二酸、莽草酸、檸檬酸、DL-異檸檬酸、奎尼酸等25種有機酸標準品購自Sigama公司，純度均>98%；甲醇和乙腈（HPLC級）、3-硝基苯肼（3-nitrophenylhydrazine，3NPH）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC），純度均>98%，均購自中國醫(yī)藥集團有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準品配制及衍生化 混標的制備：取900 μL的50%甲醇水溶液（HPLC級），裝入10 mL容量瓶中，依次加入標準品10 mg，加50%甲醇水溶液定容至10 mL，渦旋混勻，再用甲醇稀釋10倍后即可得標準儲備溶液A。標準儲備液中25種有機酸質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1。取上述儲備液按照0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10 μg·mL-1梯度稀釋，裝入1.5 mL的EP管中。

標準品衍生化：取適量標準品至離心管中，分別加入10 μL 0.1 mol·L-1 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）和10 μL 0.2 mol·L-1 3-硝基苯肼（3NPH），40 ℃孵育反應(yīng)30 min。

1.2.2 樣品提取及衍生化 精確稱取樣本0.1 g，加入300 μL提取液（V甲醇∶V氯仿=7∶3），充分混勻；冰上提取30 min；加入200 μL H2O，混勻；4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，重復(fù)提取1次；取40 μL樣品，按照標準品衍生化方法進行衍生。

1.2.3 儀器參數(shù) 采用LC-SIM-Orbitraq分析方法，對樣品中有機酸進行定性定量檢測，具體分析條件和分析方法如下：

色譜系統(tǒng)采用的是超高效液相系統(tǒng)（Vanquish UPLC，Thermo，Waltham，Massachusetts，USA），采用Waters BEH C18（50×2.1 mm，1.8 μm）（Waters，Milford，Massachusetts，USA）液相色譜柱進行分離，進樣量為2 μL，柱溫為40 ℃。流動相A（0.1%甲酸，乙腈），流動相B（0.1%甲酸，水）[31]（表1）。

質(zhì)譜系統(tǒng)采用四極桿-靜電場軌道阱復(fù)合質(zhì)譜儀（Q Exactive?，Thermo，Waltham，Massachusetts，USA）高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，配有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）和Xcalibur工作站。優(yōu)化后的質(zhì)譜分析條件為：鞘氣40 arb，輔助氣10 arb，離子噴霧電壓+3000 V（-2800 V），溫度350 ℃，離子傳輸管溫度320 ℃[32]。掃描模式為Fullms-ms2；掃描方式為負離子。一級掃描范圍m/z 120～1500。

將水芹樣品按1.2.2方法進行處理，在1.2.3色譜條件下對樣品中有機酸種類和含量進行測定，根據(jù)標準品回歸方程對樣品中有機酸濃度進行計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Xcalibur 4.1（Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）在Q-Exactive上采集數(shù)據(jù)，并使用TraceFinder? 4.1 Clinical（Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）進行處理，量化數(shù)據(jù)輸出為Excel格式。所有數(shù)據(jù)圖表均在WPS Office 2019及Origin 2021軟件中處理、繪制，采用SPSS 26.0對試驗結(jié)果進行單因素方差分析（Duancan）和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

采用外標法進行定量分析，按照1.2.3的色譜條件將不同濃度的混標溶液依次進樣分析（0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10 μg·mL-1），以標準品的濃度為橫坐標，以標準品的峰面積為縱坐標，擬合標準曲線的回歸方程，并進行相關(guān)系數(shù)分析，如表2所示。

由表2可知，這25種有機酸的標準曲線回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.991 0～0.999 9之間，表明有機酸組分的濃度和峰面積之間線性關(guān)系良好，可以采用該標準曲線計算金陵1號水芹中的有機酸含量。

2.2 質(zhì)譜參數(shù)分析

25種有機酸的質(zhì)譜參數(shù)明細如表3所示，結(jié)果顯示25種有機酸標準品保留時間與樣本保留時間的保留時間偏差在-0.03～0.02之間；標準品分子質(zhì)量與樣本分子質(zhì)量的偏差在-2.43～0.41之間，表明此質(zhì)譜條件下能直觀測定各有機酸的含量。

2.3 穩(wěn)定性和回收率檢測結(jié)果

在確定的試驗條件下進行檢測，以3倍信噪比（S/N）計算有機酸的檢出限，以10倍信噪比計算定量限，結(jié)果顯示，水芹樣品中25種有機酸的檢出限為（5×10-4～0.005） μg·mL-1，定量限為0.001～0.01 μg·mL-1。分別對水芹樣品中有機酸的日內(nèi)穩(wěn)定性（即樣品中的有機酸在正常試驗條件或適宜樣品保存的條件下放置一天的穩(wěn)定性）與日間穩(wěn)定性（即樣品中的有機酸在正常試驗條件或適宜樣品保存的條件下放置多天的穩(wěn)定性）進行檢測分析，結(jié)果顯示，水芹樣品中的25種有機酸的日內(nèi)穩(wěn)定性在0.28%～3.99%，日間穩(wěn)定性在0.41%～6.63%，說明供試水芹樣品穩(wěn)定性較好（表4）。同時，通過添加不同質(zhì)量濃度（0.5、5、20 μg·mL-1）的有機酸標準溶液，對水芹樣品的加標回收率進行測定和計算。結(jié)果顯示，經(jīng)過加標后，水芹樣品中25種有機酸的回收率在50.39%～125.32%，表明該方法準確度較高，適于水芹樣品中有機酸含量的測定。

2.4 有機酸含量測定結(jié)果

由表5可知，金陵1號水芹不同器官中均含有丙酸、異丁酸、丁酸、草酸、乳酸、戊酸、異戊酸、丙二酸、己酸、異己酸、富馬酸、琥珀酸、苯甲酸、衣康酸、戊二酸、蘋果酸、水楊酸、辛酸、己二酸、酒石酸、莽草酸、檸檬酸、DL-異檸檬酸、奎尼酸等24種有機酸，庚二酸僅在莖和葉中含有，不同器官中總有機酸的含量由高到低依次為根（35 754.38 μg·g-1）＞莖（8 245.21 μg·g-1）＞葉（4 991.77 μg·g-1）。比較水芹不同器官中單種有機酸含量發(fā)現(xiàn)，己二酸、莽草酸和水楊酸在葉中的含量顯著高于根，而在根和莖之間差異不顯著；衣康酸和檸檬酸在根中的含量顯著高于莖和葉，而在莖、葉間差異不顯著；戊酸和丙酸在葉中的含量顯著低于根和莖，而在根、莖間差異不顯著；異己酸和丁酸在根中的含量顯著高于葉，而在莖、葉間差異不顯著；琥珀酸在葉中的含量顯著高于根和莖，而在根、莖間差異不顯著；草酸在根中的含量顯著高于莖，在莖中的含量顯著高于葉；乳酸在葉中的含量顯著高于莖，而在根、莖間差異不顯著；丙二酸在莖中的含量顯著高于根和葉，而在根、葉間差異不顯著；戊二酸在葉中的含量顯著高于莖，在莖中的含量顯著高于根；DL-異檸檬酸在根中的含量顯著高于葉，而在葉中的含量顯著高于莖；苯甲酸在莖中的含量顯著高于葉，而在根、葉間差異不顯著；其他有機酸在不同器官中的含量差異不顯著。此外，草酸在金陵1號水芹根和莖中有機酸含量最高，分別為（32 094.08±1 600.77） μg·g-1和（5 935.07±437.55） μg·g-1，分別占根和莖中總有機酸含量的89.76%和71.98%；琥珀酸和蘋果酸在水芹葉片中均具有較高的含量，分別為（1 381.23±253.74） μg·g-1和（1 399.69±305.15） μg·g-1，分別占葉中總有機酸含量的27.67%和28.04%。

3 討論與結(jié)論

筆者通過HPLC-MS法對無土栽培水芹品種金陵1號不同器官中的有機酸種類和含量進行測定，在本研究的色譜條件下，樣品色譜圖峰形較好、分離度高、間距合理，能直觀反映樣品中的有機酸含量，且梯度濃度有機酸標準品溶液的回歸方程相關(guān)系數(shù)在0.991 0～0.999 9，說明各有機酸在濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，可通過該標準曲線計算水芹樣品中的有機酸含量；并對樣品中有機酸的日內(nèi)穩(wěn)定性和日間穩(wěn)定性以及加標回收率進行檢測分析，結(jié)果顯示，樣品中25種有機酸的日內(nèi)穩(wěn)定性在0.28%～3.99%，日間穩(wěn)定性在0.41%～6.63%，加標回收率在50.39%～125.32%，說明水芹樣品穩(wěn)定性較好，加標回收良好，表明該方法適于樣品中有機酸含量的測定。

測定結(jié)果顯示，在無土栽培金陵1號水芹不同器官中共含有25種有機酸，總有機酸含量由高到低依次為根（35 754.38 μg·g-1）＞莖（8 245.21 μg·g-1）＞葉（4 991.77 μg·g-1），可見金陵1號水芹中的有機酸種類豐富，含量較高。比較單種有機酸在各器官中的含量，發(fā)現(xiàn)根中含量最高的有機酸為草酸，高達（32 094.08 ± 1 600.77） μg·g-1，占根中總有機酸含量的89.76%，約為葉中草酸含量的107倍；莖中含量最高的有機酸也為草酸，高達（5 935.07 ± 437.55） μg·g-1，占莖中總有機酸含量的71.98%，其次為蘋果酸，含量高達（1 231.84 ± 212.25） μg·g-1，占比14.94%；葉中琥珀酸和蘋果酸均具有較高的含量，分別為（1 381.23 ± 253.74） μg·g-1和（1 399.69 ± 305.15） μg·g-1，占葉中總有機酸含量的27.67%和28.04%，說明水芹不同器官中有機酸組分各不相同。其中，根中草酸含量最高，可能是因為植物需要通過根系分泌草酸等有機酸，提高土壤中的可溶性磷含量和生物有效性[33]。其次，草酸在植物對外界脅迫環(huán)境的適應(yīng)以及抗逆過程中發(fā)揮著重要作用，而金陵1號水芹根系龐大，根中有機酸含量最高，這在一定程度上解釋了其對低溫等逆境環(huán)境適應(yīng)性的原因[1，34-35]。然而，草酸會與人體腸道中的Ca2+結(jié)合形成草酸鈣，阻礙對Ca2+的吸收，因此，草酸含量過高會影響蔬菜或者水果的品質(zhì)[36]。而莖中草酸含量較高，可能會降低水芹莖段的食用品質(zhì)，但水芹莖段中的可溶性糖、維生素C等營養(yǎng)成分豐富[1]，同時有機酸中蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸含量較高，使得莖段口感風味更佳且營養(yǎng)價值高[37]，而三者在葉中含量較高，使得葉片具有較好的口感，因此，這也是人們主要食用水芹莖段和葉片的原因之一[37]。此外，莽草酸和奎尼酸在金陵1號水芹莖葉中均有較高的含量，分別為（136.15 ± 13.78）、（196.63 ± 71.86）、（412.16 ± 51.81）、（1 018.15 ± 697.28） μg·g-1。研究表明，莽草酸具有抗血栓、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、治療飲食肥胖等豐富的藥用功效[38-41]，可用于合成去角質(zhì)劑、抗禽流感病毒藥物、抗酶活性劑等多種化學品[41-42]；而奎尼酸已被報道具有抗氧化、抗炎等功效[43-44]，此外，奎尼酸還可用作腫瘤化療藥物在人體內(nèi)運輸?shù)妮d體，促進藥物在體內(nèi)腫瘤中的分布，從而減少所需藥物的使用劑量和非特異毒性[41，45]。因此，可將金陵1號水芹用于提取奎尼酸和莽草酸或開發(fā)為相關(guān)功能保健食品，具有較大的資源化利用潛力。

綜上，筆者通過高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法對金陵1號水芹中的有機酸進行檢測，發(fā)現(xiàn)水芹中有機酸種類豐富且含量較高，莖葉中的蘋果酸、琥珀酸和檸檬酸使得水芹具有較好的口感和風味，同時具有豐富的可溶性糖、粗脂肪、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)成分[1]，因此，水芹的莖段和葉片成為人們?nèi)粘Ｊ秤玫闹饕糠帧８胁菟岷扛哌_（32 094.08 ± 1 600.77） μg·g-1，可能是水芹抗逆性好、適應(yīng)性強的主要原因之一。此外，水芹莖葉中莽草酸和奎尼酸的含量較高，可用于莽草酸和奎尼酸的提取和功能保健食品的開發(fā)，資源化利用潛力巨大。

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