314例初次獻(xiàn)血者Colton血型系統(tǒng)基因表型初步分析

李美霖,李琳琳,王 鵬,鐘思程,張燕華

(北京市通州區(qū) 中心血站,北京101100)

Colton血型系統(tǒng)(CO,ISBT 015)包含一個(gè)高頻等位基因和一個(gè)低頻等位基因,分別表現(xiàn)為Coa和Cob抗原[1-2]。第三個(gè)抗原Co3存在于除缺失型Co(a-b-)之外所有的細(xì)胞上。Colton抗體多為免疫抗體,因輸血或懷孕所誘發(fā)?？?Coa抗體可導(dǎo)致嚴(yán)重的新生兒溶血病和遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)。抗-Cob抗體常與其他血型抗體形成補(bǔ)體結(jié)合型抗Cob,引起速發(fā)性和遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)[3-5]。本研究對(duì)314名初次獻(xiàn)血者Colton血型系統(tǒng)進(jìn)行基因表型檢測(cè),并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源在2019年9月至2020年5月,隨機(jī)選取本站采集的無(wú)血緣關(guān)系的314名初次獻(xiàn)血者EDTA-K2 抗凝全血標(biāo)本5 ml。

1.2 試劑與儀器基因組DNA 提取試劑盒(杭州博日,批號(hào):20190601),人類(lèi)紅細(xì)胞血型Miltenburger,Diego,Colton,Yt(PCR-SSP法)(天津秀鵬,批號(hào):191021001)。高速離心機(jī)(SIGMA1-14,美國(guó)SIGMA),渦旋混勻器(VDRTEX-5,其林貝爾),電泳儀和紫外分析儀(JY300C、JYO2S,北京君意東方),凝膠電泳槽(DYCP44P,北京六一),9700型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI)。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法提取DNA。DNA使用濃度為30～100 ng/μL之間,最佳質(zhì)量濃度30～50 ng/μL,A260/280純度比值1.6～1.8。

1.3.2PCR-SSP及測(cè)序 PCR-SSP及測(cè)序均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。Colton 血型基因型分型核苷酸突變點(diǎn)及引物序列見(jiàn)表1。內(nèi)參質(zhì)控為根據(jù)人類(lèi)生長(zhǎng)激素基因(HGH)的保守片段設(shè)計(jì)內(nèi)參引物,存在于每個(gè)引物孔中,且在每次試驗(yàn)中運(yùn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下:96℃預(yù)變性2 min;96℃變性20 s,68℃ 60 s,5個(gè)循環(huán);96℃20 s,65℃ 45 s,72℃ 30 s,10個(gè)循環(huán);96℃ 20 s,62℃ 45 s,72℃ 30 s,15個(gè)循環(huán);72℃延伸3 min,4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統(tǒng)下檢測(cè),記錄結(jié)果。對(duì)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,與GenBank中的序列(ID:NG_007475.2)比對(duì),分析結(jié)果。

表1 Colton 血型基因型分型核苷酸突變點(diǎn)及引物序列

1.3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率,某基因頻率=某基因的純合子頻率+1/2雜合子頻率;基因型頻率=AA基因型的個(gè)體數(shù)/該二倍體群體總數(shù)。采用χ2檢驗(yàn)比較基因分布資料的觀察值與期望值,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析是否符合Hardy-Weinberg平衡法則。

2 結(jié)果

2.1 314名初次獻(xiàn)血者Colton血型系統(tǒng)基因分型及基因頻率篩選出Coa+b+表型2例、Coa+b-表型312例,未發(fā)現(xiàn)其他表型。2例Coa+b+表型中1例為歐洲人、1例為維吾爾族,漢族中未發(fā)現(xiàn)Cob。χ2檢驗(yàn)顯示觀察值與期望值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),符合Hardy-Weinberg分布,見(jiàn)表2。

表2 初次獻(xiàn)血者Colton血型系統(tǒng)基因分型及基因頻率

2.2 Coa+b+表型測(cè)序結(jié)果對(duì)2例表型為Coa+b+的樣本進(jìn)行DNA 提取后,對(duì)編碼AQP1基因的外顯子1測(cè)序結(jié)果顯示,134位堿基均發(fā)生雜合突變(134 C>C/T),見(jiàn)圖1。

圖1 1例Coa+b+基因測(cè)序的部分結(jié)果

3 討論

Colton是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的稀有血型系統(tǒng),位于aquaporin-1(AQP1),AQP1是一種紅細(xì)胞和腎細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白,存在于腎、肺、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦以及肝膽管、膀胱、眼。17kb的 AQP1基因包含4個(gè)外顯子,原位雜交方法將其定位于染色體7p14。Colton血型的多態(tài)性來(lái)自外顯子1上C134T的變化,是肽鏈第45位氨基酸不同所致,Coa及Cob為表現(xiàn)Ala45Val多樣性的對(duì)偶抗原。Coa在各種族都是高頻率抗原,白種人的分布頻率為99.7%。Cob在白種人的分布頻率為9.7%,在亞洲人群的頻率很低,在菲律賓、泰國(guó)等均未發(fā)現(xiàn)有Cob存在的報(bào)道[6]。Co3的位置未知,有Coa或Cob即會(huì)有Co3,Co3的分布幾乎為100%。

我國(guó)2008年開(kāi)始建立中國(guó)人群稀有血型庫(kù),針對(duì)Duffy、Kell、Kidd、MNS、Gerbich、Diego、Yt、Lutheran、Colton、Ok 以及ABO,Rh 血型系統(tǒng)中高頻抗原進(jìn)行篩選[7]。截至目前Colton血型的報(bào)道很少,其中新疆維吾爾族Cob基因頻率為0.005 9[8]、塔吉克族為0.04[9]、回族為0.006 8[10],西藏藏族為0.002 4[11],浙江漢族和畬族[12]、成都地區(qū)獻(xiàn)血人群[13]等均未檢出Cob。本次314名獻(xiàn)血者中發(fā)現(xiàn)2例Cob+,均不是漢族。Cob頻率為0.006 7,除去1例外籍獻(xiàn)血者,Cob頻率為0.003 3。Colton 血型系統(tǒng)基因頻率可能因地域和民族存在差異,其他地區(qū)和民族的分布還有待進(jìn)一步調(diào)查。

Colton 血型系統(tǒng)的檢測(cè)因稀有血清較難獲得,PCR 擴(kuò)增技術(shù)則具有高靈敏度。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置內(nèi)參引物作為質(zhì)控,因其存在于所有人類(lèi)的DNA樣本中,PCR 擴(kuò)增后在每個(gè)引物孔中穩(wěn)定出現(xiàn),可證明試驗(yàn)結(jié)果有效。本實(shí)驗(yàn)在PCR-SSP基因分型的基礎(chǔ)上,采用直接測(cè)序法對(duì)Coa+b+進(jìn)行基因測(cè)序,結(jié)果比較可靠。因北京地區(qū)獻(xiàn)血者中外來(lái)人群占比較高,進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量繼續(xù)對(duì)Colton 血型系統(tǒng)進(jìn)行篩選,有助于了解我國(guó)各民族Colton 血型的分布特點(diǎn),豐富中國(guó)紅細(xì)胞稀有血型庫(kù)。