山銀花莖葉與花化學(xué)成分和抗炎活性比較研究

蔡 榮，徐春芳，李 珊，夏伯候，李亞梅，劉 武，謝菁琛，張智敏*，林麗美*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.溆浦森鑫特色農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，湖南 懷化 419315

山銀花是忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.、紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、華南忍冬Lonicera confusa DC.、黃褐毛忍冬Lonicera fulvoto-mentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱[1]。 藥理研究發(fā)現(xiàn)，山銀花具有許多藥用特性，諸如抗病毒、抗氧化、抗菌和抗炎作用[2-4]。

忍冬是山銀花最早的藥用名稱，宋代及宋代以前多用忍冬的莖葉入藥，到了明代，逐漸發(fā)展至莖、葉、花并用，明代以后，強調(diào)用花。 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，山銀花富含酚酸、三萜等多種活性成分[5]，山銀花酚酸化合物主要包括綠原酸、咖啡酸、異綠原酸等[6]；山銀花中三萜成分主要為灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙等[7]。 酚酸和三萜是山銀花抗炎活性的有效成分[8-10]。 目前研究多集中于花，莖葉的研究相對較少。 金銀花的藥用部位是花和莖枝。 過去，金銀花葉并不常用于醫(yī)療，但最近其引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注[11-12]。 前人比較了金銀花不同組織的化學(xué)成分和抗炎作用，指出金銀花的葉和莖具有類似于花蕾的化學(xué)成分[13]和抗炎特性[14]，可能成為花蕾的替代或補充來源。在治療腫脹和疥瘡方面，金銀花的花、莖和葉具有相同功效[15]。

山銀花生長過程中，除花蕾外，葉資源豐富，多數(shù)情況下棄之不用，如若可以將莖葉進行綜合開發(fā)利用，則可實現(xiàn)莖葉的資源化。 因此，本研究首先表征山銀花莖葉與花中酚酸和三萜類成分的異同，然后利用巨噬細胞體外模型評價其抗炎作用，最后采用小鼠耳郭腫脹和足趾腫脹體內(nèi)抗炎模型研究其對小鼠耳郭、足趾腫脹度的影響，并測定足腫脹組織炎癥因子，為后續(xù)對山銀花莖葉的利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 藥材與試劑

山銀花莖葉與花于2021 年6 月采集自湖南省懷化市溆浦縣，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室龔力民副教授鑒定為灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的干燥莖葉與花蕾。

乙腈（色譜純，批號：JA109230，默克股份兩合公司）；磷酸（色譜純，批號：20100717，天津市光復(fù)精細化工研究所）；地塞米松（純度≥98%，批號：C12587834）、角叉菜膠（試劑級，批號：C12600607）、巴豆油（純度≥95%，批號：C12229973）均購自上海麥克林生化科技有限公司；綠原酸標準品（純度≥98%，批號：DSTDL002102）、咖啡酸標準品（純度≥98%，批號：DST200918-013）均購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；異綠原酸A 標準品（純度≥98%，批號：RFS-Y06802109007）、異綠原酸B 標準品（純度≥98%，批號：RFS-Y06911812012）、異綠原酸C 標準品（純度≥98%，批號：RFS-Y07011805016）、新綠原酸標準品（純度≥98%，批號：RFS-X01401903029）、隱綠原酸標準品（純度≥98%，批號：RFS-Y06701903029）、灰氈毛忍冬皂苷乙標準品（純度≥98%，批號：RFSH01411804026）、灰氈毛忍冬皂苷甲標準品（純度≥98%，批號：RFS-H07411804027）、川續(xù)斷皂苷乙標準品（純度≥98%，批號：RFS-C00511804026）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司。

DMEM 培養(yǎng)基（批號：WH0021D111）、胎牛血清（批號：SA210518）均購于武漢普諾賽生命科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）（批號：127M4029V，美國Sigma 公司）；CCK-8（批號：22005145，北京蘭杰柯科技有限公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號：022421210906，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）試劑盒（批號：M08014507）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（批號：M16014508）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號：M17014509）均購于武漢華美生物工程有限公司；前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）試劑盒（批號：A8KL9RWGU4，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

1.2 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；1510 型酶標儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市中天儀器科技有限公司）；P20-Y 型超純水儀（湖南科爾頓水務(wù)集團有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；microfuge 20R 型高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter 公司）；Synergy-HTX 型多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；ZWY-100H 型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；WT C6002 型電子天平（杭州萬特衡器有限公司）。

1.3 細胞株

小鼠巨噬細胞系（RAW264.7，目錄號：TCM13）購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.4 動物

180 只SPF 級雄性KM 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004，合格證號：430727221100100456。所有實驗動物均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF 級動物房中。 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由攝食，環(huán)境溫度24～26 ℃，相對濕度50%～60%，實驗全程按照動物倫理學(xué)標準進行（倫理批準號：LLBH-202112010001）

2 方法

2.1 提取物的制備

分別將山銀花干燥莖葉、花蕾加20 倍量蒸餾水煎煮3 次，第1 次煎煮1.5 h，第2 次和第3 次各煎煮1 h，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1，備用。

取D101 大孔樹脂，用乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，用乙醇洗至流出液加適量蒸餾水后無白色混濁，再用蒸餾水洗至流出液無醇味。將預(yù)處理好的D101大孔樹脂濕法裝柱，分別加入上述山銀花莖葉或花的水提液，上樣流速為1 mL·min-1，靜置25 min 后，用4 倍柱體積蒸餾水洗滌至無色，棄去。用10 倍柱體積的85%乙醇進行洗脫，洗脫劑流速為1 mL·min-1。收集洗脫液，濃縮干燥，即得。

2.2 總酚酸和總?cè)坪康臏y定

2.2.1 總酚酸含量測定方法 以沒食子酸為對照品，采用福林酚法進行測定。精密稱取沒食子酸標準品4.1 mg 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得沒食子酸標準儲備液質(zhì)量濃度為0.41 mg·mL-1。 分別吸取沒食子酸標準儲備液0、125、250、375、500、625、750、875、1 000 μL 置于1 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成沒食子酸系列標準溶液。分別精密移取0.5 mL 沒食子酸系列標準溶液于10 mL 容量瓶中，加入福林酚溶液1.5 mL，振搖10 s，黑暗條件下放置10 min，再加入8%碳酸鈉溶液2 mL， 用蒸餾水定容至10 mL， 振搖10 s，密塞，置50 ℃中水浴加熱10 min，取200 μL 溶液置96 孔板中，于760 nm 處檢測吸光度。繪制沒食子酸標準溶液吸光度與其質(zhì)量濃度的標準曲線，擬合得線性回歸方程為Y=3.027 8X+0.009 9，R2=0.994 6。

精密稱取各設(shè)定條件下提取的山銀花莖葉與花提取物適量（相當0.2 g 生藥量），加入10 mL 甲醇，充分溶解后，0.22 μm 微孔濾膜濾過，得樣品溶液。精密移取樣品溶液0.2 mL，置于10 mL 具塞試管中，按“2.2.1”項下方法制備待測溶液，根據(jù)沒食子酸標準曲線求算出總酚酸濃度，并計算各處理的總酚酸含量和總酚酸得率。

2.2.2 總?cè)坪繙y定方法 以熊果酸為對照品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法進行測定。 精密稱取熊果酸標準品4.6 mg 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得熊果酸標準儲備液質(zhì)量濃度為0.46 mg·mL-1。 分別吸取熊果酸標準儲備液0、125、250、375、500、625、750、875、1 000 μL 置 于1 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成熊果酸系列標準溶液。 分別精密移取0.2 mL 熊果酸系列標準溶液于10 mL 具塞試管中，各試管加入新制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，振搖10 s，再向各試管中加入高氯酸1.8 mL，振搖10 s，密塞，置65 ℃水浴加熱25 min 后，室溫冷卻5 min，再向各試管加入冰醋酸2.5 mL，振搖10 s，取200 μL 溶液置96孔板中，于547 nm 處檢測吸光度。 繪制熊果酸標準溶液吸光度與其質(zhì)量濃度的標準曲線，擬合得線性回歸方程為Y=1.089 4X+0.149，R2=0.990 3。

精密稱取各設(shè)定條件下提取的山銀花莖葉與花提取物適量（相當0.2 g 生藥量），加入10 mL 甲醇，充分溶解后，0.22 μm 微孔濾膜濾過，得樣品溶液。精密移取樣品溶液0.2 mL，置于10 mL 具塞試管中，按“2.2.2”項下方法制備待測溶液，根據(jù)熊果酸標準曲線求算出總?cè)茲舛群涂側(cè)频寐省?/p>

2.3 HPLC 法測定山銀花莖葉與花中6 種酚酸和3種三萜的含量

2.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.4%磷酸溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序：0～5 min，8%～10%B；5～25 min，10%～12% B；25～37 min，12%～17%B；37～57 min，17%～20% B；57～70 min，20%～30%B；70～80 min，30%～35% B，流速1.0 mL·min-1，檢測波長210 nm，柱溫25 ℃，進樣體積10 μL。 所得的色譜圖見圖1。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱定綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、新綠原酸、隱綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、咖啡酸標準品適量，分別用85%乙醇配制成對照品儲備液，綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、新綠原酸、隱綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙、咖啡酸濃度分別為0.537、0.644、0.538、0.508、0.513、0.564、0.538、0.520、0.461、0.551 mg·mL-1。取5 支10 mL 容量瓶，分別精密吸取各對照品儲備液適量，用85%乙醇配制成5 個混合對照品溶液，其中綠原酸濃度為0.026 85、0.042 96、0.053 70、0.107 40、0.161 10 mg·mL-1，異綠原酸A 濃度為0.006 44、0.019 32、0.064 40、0.051 52、0.128 80 mg·mL-1，異綠原酸B 濃度為0.005 38、0.010 76、0.026 90、0.043 04、0.053 80 mg·mL-1，異綠 原 酸C 濃 度 為0.005 08、0.015 24、0.025 40、0.076 20、0.050 80 mg·mL-1，新綠原酸濃度為0.005 13、0.041 04、0.025 65、0.051 30、0.010 26 mg·mL-1，隱 綠 原 酸 濃 度 為0.005 64、0.056 40、0.028 20、0.112 80、0.016 92 mg·mL-1，灰氈毛忍冬皂苷乙濃度為0.107 60、0.161 40、0.053 80、0.026 90、0.043 04 mg·mL-1，灰氈毛忍冬皂苷甲濃度為0.041 60、0.052 00、0.026 00、0.005 20、0.010 40 mg·mL-1，川續(xù)斷皂苷乙濃度為0.069 15、0.036 88、0.046 10、0.004 61、0.013 83 mg·mL-1，咖啡酸濃度為0.044 08、0.011 02、0.027 55、0.002 75、0.005 51 mg·mL-1。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取山銀花莖葉與花提取物，加85%乙醇充分溶解并定容后，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，進行HPLC 分析。

2.3.4 方法學(xué)考察

（1）精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察 分別取混合對照品溶液和山銀花莖葉供試品溶液，按“2.3.1”項下條件進行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察，結(jié)果顯示，每種成分的RSD 值均小于3%，符合要求。

（2）線性關(guān)系考察 取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、新綠原酸、隱綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙的對照品儲備液制備的各混標溶液，按相應(yīng)色譜條件分析，進樣量為10 μL，記錄峰面積。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行標準曲線回歸，標準曲線方程和線性范圍如表1 所示，各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

（3）加樣回收率考察 已知含量的供試品溶液共6 份，精密量取，加入含一定量的綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、新綠原酸、隱綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲、川續(xù)斷皂苷乙的對照品溶液，混勻。 按“2.3.1”項下條件，計算各組平均回收率及RSD 值，結(jié)果見表2，10 個對照品的回收率為99.30%～105.22%，RSD 值均小于3%（1.04%～2.80%），說明該方法回收率好。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.4 體外抗炎活性研究

2.4.1 供試品配制 地塞米松用DMEM 培養(yǎng)基（無血清）配制成32 μg·mL-1的供試品藥液；山銀花莖葉提取物用DMEM 培養(yǎng)基（無血清）配制成25、50、100、200 μg·mL-1的儲備液，山銀花提取物用DMEM培養(yǎng)基（無血清）配制成29.5、59、118、236 μg·mL-1的儲備液；經(jīng)0.22 μm 微孔膜過濾后使用。

2.4.2 細胞分組及細胞存活率檢測 取生長狀態(tài)良好的RAW264.7 細胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單細胞懸液，離心棄上清液，用完全培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞懸液至5×104/mL，按每孔100 μL接種至96 孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。 接種12 h 后，在潔凈工作臺中用無血清DMEM培養(yǎng)基將山銀花莖葉與花提取物稀釋成62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg·mL-1的供試品藥液，棄去孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 對應(yīng)濃度供試品藥液，并設(shè)空白對照組（無血清DMEM 培養(yǎng)基+細胞），每組6 個復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，按每孔10 μL 加入CCK-8 試劑溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，隨后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

2.4.3 細胞上清液中NO 釋放量的檢測 根據(jù)細胞存活率檢測結(jié)果，在對細胞無毒性作用的安全濃度范圍內(nèi)設(shè)置各藥物的濃度。實驗共設(shè)置空白對照組、模型組（LPS 1 μg·mL-1）、地塞米松組（32 μg·mL-1）、山銀花莖葉組（25、50、100、200 μg·mL-1）、山銀花組（29.5、59、118、236 μg·mL-1）。

取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞進行消化，調(diào)整細胞懸液的密度為1×105/mL，按每孔1 mL 接種至12 孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞長至80%密度時，以含各藥物的無血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，空白對照組和模型組給予等量的無血清培養(yǎng)基，預(yù)處理2 h 后加入濃度為1 μg·mL-1的LPS，空白對照組給予等量的無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后收集各孔細胞上清，按照試劑盒說明采用Griess 法測定NO 含量。

2.5 體內(nèi)抗炎活性研究

2.5.1 動物分組及耳郭腫脹度和腫脹抑制率檢測 KM小鼠90 只，雄性，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按體質(zhì)量隨機分為9 組，每組10 只，分別為空白對照組、模型組、地塞米松組（5 mg·kg-1）、山銀花莖葉組（1.25、2.5、5 g·kg-1）和山銀花組（1.25、2.5、5 g·kg-1）。 灌胃給藥，給藥體積為0.01 mL·g-1，每天1 次，連續(xù)給藥7 d。空白對照組、模型組給予等體積蒸餾水。

末次給藥30 min 后，于小鼠右耳正反兩面均勻涂布巴豆油混合物（巴豆油∶無水乙醚∶無水乙醇∶蒸餾水=2∶73∶20∶5，臨用前配制）40 μL/只，左耳不做任何處理，4 h 后，處死小鼠，剪下雙耳，用8 mm 直徑打孔器在小鼠耳朵相同的位置打下圓耳片，稱重。計算腫脹度（兩耳差值）和腫脹抑制率。 腫脹抑制率=（模型組平均腫脹度-實驗組平均腫脹度）/模型組平均腫脹度×100%。

2.5.2 足趾腫脹度和腫脹抑制率檢測 分組與給藥同“2.5.1”。 末次給藥后30 min，在小鼠左側(cè)足趾皮下注射1%角叉菜膠30 μL，右側(cè)足趾不做任何處理，4 h 后處死小鼠，沿踝關(guān)節(jié)剪下左右兩足，稱重，計算腫脹度（兩足差值）和腫脹抑制率。 取小鼠左后足組織，勻漿后用ELISA 試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2 含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。 實驗數(shù)據(jù)均以“±s”表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布者用獨立樣本Student's t-test 檢驗，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布用Mann-Whitney U test 進行統(tǒng)計分析。 組間比較時方差齊者采用Tukey 檢驗，方差不齊者用Dunnett-t 檢驗。 均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 山銀花莖葉與花中主要成分的含量

經(jīng)計算得到山銀花莖葉提取物中總酚酸、總?cè)坪糠謩e為26.68%、13.48%，山銀花提取物中總酚酸、總?cè)坪糠謩e為16.14%、18.65%。山銀花莖葉中總酚酸含量高于山銀花（P＜0.01），而山銀花中總?cè)坪扛哂谇o葉（P＜0.01）。 山銀花莖葉與花提取物中主要成分含量存在差異，山銀花莖葉中隱綠原酸含量高于山銀花（P＜0.05），灰氈毛忍冬皂苷乙（P＜0.01）、灰氈毛忍冬皂苷甲（P＜0.05）含量低于山銀花。 詳見圖2。

圖2 山銀花莖葉與花中主要成分的含量測定結(jié)果（n=3）

3.2 體外抗炎活性分析評價

3.2.1 山銀花莖葉與花對RAW264.7 細胞活性的影響 與空白對照組相比，山銀花莖葉提取物濃度大于500 μg·mL-1時表現(xiàn)出對RAW264.7 細胞的顯著毒性（P＜0.05），山銀花提取物濃度大于1 000 μg·mL-1時表現(xiàn)出對RAW264.7 細胞的顯著毒性（P＜0.05）。山銀花莖葉提取物在250 μg·mL-1時RAW264.7 細胞的存活率僅為79.86%，故后續(xù)實驗山銀花莖葉提取物質(zhì)量濃度調(diào)整為25、50、100、200 μg·mL-1，對應(yīng)的山銀花提取物質(zhì)量濃度為29.5、59、118、236 μg·mL-1。詳見圖3。

圖3 山銀花莖葉與花提取物對RAW264.7 細胞存活率的影響（±s，n=3）

3.2.2 山銀花莖葉與花提取物對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細胞NO 釋放量的影響 采用LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細胞，與空白對照組比較，模型組NO 釋放量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，山銀花莖葉組（50、100、200 μg·mL-1）、山銀花組（59、118、236 μg·mL-1）均對LPS 誘導(dǎo)的NO 分泌有明顯抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見圖4。

圖4 山銀花莖葉與花對細胞中NO 的影響（±s，n=3）

3.3 體內(nèi)抗炎活性研究

3.3.1 山銀花莖葉與花對巴豆油混合物致小鼠耳郭腫脹的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠耳郭腫脹度明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組、山銀花莖葉組（1.25、2.5、5 g·kg-1）和山銀花組（1.25、2.5、5 g·kg-1）小鼠耳郭腫脹度降低（P＜0.01），耳腫脹抑制率升高（P＜0.01）；相同濃度下的山銀花莖葉與花提取物對巴豆油致小鼠耳郭腫脹的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 詳見表3。

表3 山銀花莖葉及花中提取物對巴豆油致小鼠耳郭腫脹度的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別空白對照組模型組山銀花莖葉組劑量/（g·kg-1）——5耳腫脹抑制率/%100 0##山銀花組地塞米松組2.5 1.25 5 2.5 1.25 0.005耳郭腫脹度/mg 0 21.0±4.0##9.0±3.0**10.4±4.6**14.2±4.2**9.6±2.6**10.9±3.1**14.5±3.5**3.8±2.8**57.14**50.48**32.38**54.29**48.10**30.95**81.90**

3.3.2 山銀花莖葉與花提取物對角叉菜膠致小鼠足趾腫脹度的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠足趾腫脹度明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松組、山銀花莖葉組（1.25、2.5、5 g·kg-1）和山銀花組（2.5、5 g·kg-1）小鼠足趾腫脹度降低（P＜0.01），山銀花莖葉組（2.5、5 g·kg-1）和山銀花組（2.5、5 g·kg-1）足腫脹抑制率升高（P＜0.01）。 此外，與山銀花組（2.5、5 g·kg-1）比較，山銀花莖葉組（2.5、5 g·kg-1）小鼠足趾腫脹度降低（P＜0.01），足腫脹抑制率升高（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見表4。

表4 山銀花莖葉及花中提取物對角叉菜膠致小鼠足趾腫脹度的影響（±s，n=10）

表4 山銀花莖葉及花中提取物對角叉菜膠致小鼠足趾腫脹度的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與山銀花組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01。

組別空白對照組模型組山銀花莖葉組劑量/（g·kg-1）——5足腫脹抑制率/%100 0##山銀花組地塞米松組2.5 1.25 5 2.5 1.25 0.005足趾腫脹度/mg 0 53.4±2.4##27.1±2.1**&&31.4±2.4**&&50.5±2.5**34.0±2.0**35.2±2.2**52.1±3.9 20.7±2.3**49.2**&&41.2**&5.4 36.3**34.1**2.4 61.2**

3.3.3 山銀花莖葉與花提取物對小鼠足腫脹組織中炎癥細胞因子的影響 與空白對照組相比，模型組小鼠足腫脹組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 和PGE2 含量均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組及山銀花莖葉組（2.5、5 g·kg-1）和山銀花組（2.5、5 g·kg-1）小鼠足腫脹組織中IL-6、PGE2、IL-1β、TNF-α 含量均減少（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見圖5。

圖5 小鼠足組織中炎癥因子的含量比較（±s，n=6）

4 討論

山銀花已在中醫(yī)藥中使用數(shù)千年。迄今為止，已從山銀花中分離和鑒定出200 多種化合物，主要成分為有機酸、三萜和黃酮等。 山銀花的干燥花蕾或帶初開的花是山銀花的入藥部位[1]。 不同的植物部分，包括花、花蕾、葉和整個植物，因含有不同的成分而具有不同的活性。 本研究通過HPLC 檢測并比較了山銀花莖葉與花中主要酚酸和三萜類成分的差異。

本研究結(jié)果表明，山銀花中總?cè)坪扛哂谇o葉，而總酚酸含量低于莖葉。 山銀花莖葉和花中酚酸和三萜成分種類相似，其中酚酸類成分以綠原酸和隱綠原酸為主，三萜類成分以灰氈毛忍冬皂苷乙為主，但各成分含量存在差異，如山銀花莖葉中隱綠原酸含量高于花，而3 種三萜成分的含量均低于花。除了綠原酸，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙也是2020 版《中華人民共和國藥典》[1]中規(guī)定的山銀花質(zhì)量控制的指標成分。 在本研究中，山銀花中灰氈毛忍冬皂苷乙和灰氈毛忍冬皂苷甲含量均顯著高于莖葉，這與已有文獻報道結(jié)果一致[16]。

炎癥是免疫系統(tǒng)對有害刺激（如病原體、受損細胞、有毒化合物或輻射）的反應(yīng)，通過去除有害刺激并啟動愈合過程[17]。因此，炎癥是一種對健康至關(guān)重要的防御機制[18]。炎癥可以在局部引起紅腫、熱、痛，激活巨噬細胞在炎癥部位分泌多種促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1β 和IL-6，以及促炎介質(zhì)NO 和PGE2[19]。本實驗采用巴豆油致小鼠耳郭腫脹模型和角叉菜膠致小鼠足趾腫脹模型，考察山銀花莖葉和花提取物對小鼠的耳郭腫脹和足趾腫脹的影響及腫脹足組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2 含量變化，結(jié)果顯示，巴豆油致小鼠耳郭腫脹度增加，角叉菜膠致小鼠足趾腫脹度增加，而山銀花莖葉和花均可降低小鼠耳郭腫脹度和足趾腫脹度，升高耳腫脹抑制率和足腫脹抑制率，足腫脹組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2含量也明顯降低，其機制可能與抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2 的合成與釋放有關(guān)。 山銀花莖葉組的小鼠足趾腫脹度低于山銀花組，但山銀花莖葉和山銀花對各細胞因子的調(diào)控作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示山銀花莖葉和花的抗炎作用還可能與其他機制有關(guān)。炎癥部位損傷程度與炎癥因子水平非正相關(guān)情況，也存在于赪桐根[20]、蒙藥阿給水[21]等的抗炎作用機制研究中。

本研究初步闡明了山銀花莖葉與花中的酚酸和三萜類成分及其含量的差異。 體內(nèi)外抗炎實驗結(jié)果表明，山銀花莖葉與花的提取物均具有顯著的抗炎活性，且二者抗炎活性相當，證實了山銀花莖葉與藥用部位花的等效一致性。 本研究結(jié)果可為山銀花莖葉用于治療相關(guān)炎癥性疾病以及進一步的研究利用提供科學(xué)參考。