基于UPLC 指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)華山參及其混偽品的鑒別研究

呂振國(guó) ，武恬恬，趙鵬，歐陽(yáng)慧子，何俊*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617

2.現(xiàn)代中醫(yī)藥海河實(shí)驗(yàn)室，天津 301617

華山參為茄科植物漏斗泡囊草Physochlaina infundibularisKuang 的干燥根，因主產(chǎn)于西岳華山而得名，除主產(chǎn)區(qū)陜西外，山西、河南、廣西等地亦有分布。華山參中化學(xué)成分種類豐富，主要包括生物堿類、香豆素類、有機(jī)酸、揮發(fā)油類等成分[1-4]。《中國(guó)藥典》2020 版一部中記載華山參性溫，味甘、微苦，歸肺、心經(jīng)，有毒，具有溫肺祛痰、平喘止咳、安神鎮(zhèn)驚的功效，臨床上主要用于治療心悸失眠易驚、寒痰咳嗽等[5]。在實(shí)際用藥中，華山參出現(xiàn)了偽品、次品，不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量不一、硫熏藥材導(dǎo)致質(zhì)量下降等問(wèn)題。因此，建立全面合理的華山參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法來(lái)指導(dǎo)其臨床應(yīng)用非常重要。近年來(lái)，華山參藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究主要集中在指標(biāo)成分托品烷類生物堿的測(cè)定[6-8]。中藥指紋圖譜運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)，能夠系統(tǒng)、整體地表征中藥的共有特征和內(nèi)在特征，具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，是評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的重要途徑[9-10]。化學(xué)計(jì)量學(xué)提供了多種良好的算法，能夠從大量數(shù)據(jù)中提取有效信息，對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以實(shí)現(xiàn)鑒別藥材間差異、評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的目的[11-14]。基于此，本研究建立華山參藥材的UPLC 指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析和主成分分析等化學(xué)模式識(shí)別方法鑒別華山參及其混偽品，為華山參藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和真?zhèn)舞b別提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 1290 超高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；超純水制備儀（Millipore 公司）；旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）；高速控溫離心機(jī)（Eppendorf 公司）；超聲波清洗機(jī)（天津知著科技有限公司）；十萬(wàn)分之一天平（波蘭瑞德威公司）。

甲醇、乙腈（色譜純）購(gòu)自美國(guó)Fisher 公司；磷酸（色譜純）購(gòu)自美國(guó)ROE 公司；超純水由Milli-Q 超純水儀制備。東莨菪堿（批號(hào)DST220614-163）、莨菪堿（批號(hào)DSTDL011501）、氫溴酸山莨菪堿（批號(hào)DST220721-478）、東莨菪內(nèi)酯（批號(hào)DST190625-004）、托品酸（批號(hào)DSTDT023201）、東莨菪苷（批號(hào)DST220215-056）、法篳枝苷（批號(hào)DST230209-020）對(duì)照品均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%；S1～S28 樣品經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為茄科植物漏斗泡囊草PhysochlainainfundibularisKuang 的干燥根，S29、S30 樣品經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為蘿藦科鵝絨藤屬植物戟葉牛皮消CynanchumbungeiDecne.的干燥塊根。藥材來(lái)源信息見表1。

表1 樣品來(lái)源信息Table 1 Source information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相：0.05%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～20 min，5%～15% B；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；體積流量：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿、莨菪堿、東莨菪苷、法篳枝苷、托品酸和東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL 的對(duì)照品溶液，放置4 ℃冰箱備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取華山參藥材粗粉（過(guò)三號(hào)篩）400.0 mg，置20 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，超聲（300 W、40 kHz）處理1 h，冷卻，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取華山參粗粉（編號(hào)S1），制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以5 號(hào)莨菪堿色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD 值分別小于0.34%、2.41%。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取華山參粗粉（編號(hào)S1），平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以5 號(hào)莨菪堿色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均小于0.70%，相對(duì)峰面積的RSD 值均小于4.89%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取華山參粗粉（編號(hào)S1），制備供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，以5 號(hào)莨菪堿色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均小于0.36%，相對(duì)峰面積的RSD 值均小于4.43%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 華山參UPLC 指紋圖譜的建立和相似度評(píng)價(jià)

取華山參粗粉（S1～S28），制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（130723 版，國(guó)家藥典委員會(huì)，2012），以色譜圖S1 為參照?qǐng)D譜，平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正Mark 峰匹配，建立28 批華山參藥材的疊加圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜（R），見圖1。共標(biāo)定出15個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品的色譜圖（圖2）比對(duì)，指認(rèn)出7 個(gè)成分，分別為2 號(hào)峰東莨菪堿、4 號(hào)峰山莨菪堿、5 號(hào)峰莨菪堿、7 號(hào)峰東莨菪苷、8 號(hào)峰法篳枝苷、10 號(hào)峰托品酸和14 號(hào)峰東莨菪內(nèi)酯。華山參藥材的相似度分析結(jié)果見表2，其相似度均在0.867 以上，相似度較高，說(shuō)明28 批華山參樣品的化學(xué)成分一致性較高，質(zhì)量較為均一、穩(wěn)定。

圖1 華山參的疊加圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜Fig.1 Overlay map and reference fingerprint of Physochlainae Radix

圖2 混合對(duì)照品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed reference solution

表2 華山參樣品相似度分析Table 2 Similarity analysis of Physochlainae Radix

2.6 偽品華山參UPLC 圖譜分析

將華山參對(duì)照?qǐng)D譜及其混偽品（S29、S30）的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件，建立正品及其混偽品的UPLC 疊加圖譜，見圖3。正品華山參與其混偽品整體峰形具有較大差異，計(jì)算其相似度為0.531、0.555，相似度低?？梢娀靷纹放c正品華山參化學(xué)輪廓整體差異明顯，所建立的該圖譜可快速、直觀地對(duì)其進(jìn)行鑒別區(qū)分。

圖3 華山參對(duì)照?qǐng)D譜及其混偽品的疊加圖譜Fig.3 Overlay map of Physochlainae Radix and adulterants

2.7 化學(xué)模式識(shí)別方法

2.7.1 聚類分析（CA）運(yùn)用SIMCA 14.1 軟件，以30 批華山參樣品UPLC 指紋圖譜中15 個(gè)共有峰的峰面積與樣品編號(hào)建立矩陣（若該保留時(shí)間下無(wú)色譜峰，則峰面積定為0），采用組間連接法，以平方歐式距離為測(cè)度進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。華山參樣品可被明顯聚為3 類，S1～S10 陜西產(chǎn)華山參正品聚為第1 類，S11～S28 山西、河南和廣西省產(chǎn)華山參聚為第2 類，S29、S30 陜西產(chǎn)偽品聚為第3 類。聚類分析結(jié)果將主產(chǎn)地與非主產(chǎn)地、正品與偽品顯著區(qū)分開來(lái)。

圖4 華山參藥材聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis diagram of Physochlainae Radix

2.7.2 主成分分析（PCA）采用SIMCA 14.1 軟件，以30 批華山參樣品UPLC 指紋圖譜中15 個(gè)共有峰的峰面積為變量進(jìn)行PCA 分析，模型擬合參數(shù)R2X為0.876，預(yù)測(cè)參數(shù)Q2為0.502，以上參數(shù)均大于0.5，表明該模型具有較高的解釋能力和預(yù)測(cè)性能。PCA 得分圖見圖5，可見華山參正品和混偽品呈現(xiàn)出明顯的分類，同時(shí)主產(chǎn)地與非主產(chǎn)地產(chǎn)藥材也被顯著區(qū)分，證實(shí)了聚類分析的結(jié)果。

圖5 PCA 散點(diǎn)圖Fig.5 PCA score plot

2.7.3 偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）將15 個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中，建立PLS-DA 模型，模型得分圖見圖6。根據(jù)得分圖可知，18 批華山參樣品被分為3 類，與聚類分析結(jié)果一致。模型中R2X、R2Y、Q2值分別為0.812、0.920、0.832，均接近于1，說(shuō)明該模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。在PLS-DA 模型中，對(duì)兩個(gè)分類變量進(jìn)行了200次置換檢驗(yàn)，結(jié)果見圖7，Q2點(diǎn)所在回歸線與y軸交于0 以下，且左側(cè)點(diǎn)的所有排列值均遠(yuǎn)低于右上角原始點(diǎn)的值，表明該模型沒(méi)有過(guò)擬合，有效可靠。

圖6 PLS-DA 散點(diǎn)圖Fig.6 PLS-DA score plot

圖7 置換檢驗(yàn)驗(yàn)證模型圖Fig.7 Permutation test validation model diagram

為進(jìn)一步篩選獲得區(qū)分正品華山參及其混偽品的標(biāo)志性成分，實(shí)驗(yàn)選取了變量投影重要度（VIP）大于1 的成分作為差異性成分。由圖8 可知，4 個(gè)得分較高的變量按照VIP 值大小依次為4 號(hào)峰（山莨菪堿）、15 號(hào)峰、3 號(hào)峰和2 號(hào)峰（東莨菪堿）。

圖8 變量投影重要度VIP 圖Fig.8 variable importance in projection (VIP) plot

3 討論

實(shí)驗(yàn)比較了不同流動(dòng)相與添加劑（甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.05%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.05%磷酸水）、柱溫（25、30、35 ℃）、體積流量（0.2、0.3、0.4 mL/min）和提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）下各色譜峰的峰數(shù)、峰響應(yīng)和分離度。優(yōu)化后的結(jié)果表明，在提取溶劑為50%甲醇，乙腈-0.05%磷酸水為流動(dòng)相，30 ℃柱溫，0.3 mL/min 體積流量下所得色譜峰的分離效果較好、分離度高，且洗脫時(shí)間短。

建立的指紋圖譜共標(biāo)定出15 個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品溶液色譜圖比對(duì)，共指認(rèn)出7 個(gè)成分，分別為東莨菪堿、山莨菪堿、莨菪堿、東莨菪苷、法篳枝苷、托品酸和東莨菪內(nèi)酯。相似度結(jié)果顯示，正品華山參藥材的相似度均大于0.867，而混偽品的相似度在0.555 以下，表明華山參混偽品與正品化學(xué)輪廓差異較大，構(gòu)建的指紋圖譜能夠快速地區(qū)分正品和混偽品。為進(jìn)一步增強(qiáng)方法的準(zhǔn)確性，采用聚類分析（CA）和主成分分析（PCA）對(duì)共有峰進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)華山參正品和混偽品被顯著聚類區(qū)分，S1～S10 陜西產(chǎn)華山參正品被聚為第1 類，S11～S28 山西、河南和廣西產(chǎn)正品華山參被聚為第2 類，S29、S30 陜西產(chǎn)偽品被聚為第3 類，正品與偽品、主產(chǎn)地與非主產(chǎn)地產(chǎn)華山參藥材被顯著區(qū)分。偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。此外，根據(jù)變量投影重要度（VIP＞1）篩選出4 號(hào)峰（山莨菪堿）、15 號(hào)峰、3 號(hào)峰和2 號(hào)峰（東莨菪堿）為批次間的差異性成分。

本研究將UPLC 指紋圖譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合，對(duì)華山參藥材摻偽行為進(jìn)行鑒別，將華山參正品與混偽品快速區(qū)分。此策略較傳統(tǒng)使用的中藥材鑒別方法更全面、靈敏、客觀，也可為其他存在真?zhèn)螕郊佟?yōu)劣混用問(wèn)題的中藥材鑒別提供思路和方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突