利用CRISPRi技術(shù)敲低海分枝桿菌PPE13基因

王垚垚,畢斯琪,陳 標(biāo),宋厚輝,楊 楊

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測(cè)技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 311300)

CRISPR即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列,是一類廣泛分布于細(xì)菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)。目前CRISPR-cas9作為一種基因編輯工具,在編輯真核生物細(xì)胞的基因方面發(fā)展迅速[1-5]。雖然CRISPR-cas9技術(shù)是來(lái)源于細(xì)菌的自我保護(hù)免疫機(jī)制,但是基于CRISPR技術(shù)在細(xì)菌基因編輯和基因表達(dá)方面的應(yīng)用發(fā)展卻相對(duì)有限[6-7]。同源重組是廣泛應(yīng)用于分枝桿菌染色體基因沉默調(diào)控的一種基因功能的研究方法,然而轉(zhuǎn)化效率低是導(dǎo)致該技術(shù)同源序列置換失敗的主要原因,而且抗性基因的插入也可能會(huì)影響下游基因的表達(dá)[8]。此外,同源重組技術(shù)無(wú)法完成對(duì)必需基因的敲除。有報(bào)道通過(guò)在目的基因敲除的菌株中引入可被誘導(dǎo)表達(dá)的目的基因,來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)必需基因功能的研究[9-11]。但這種方法無(wú)法真正地模擬目的基因在細(xì)菌正常生理狀態(tài)下mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。CRISPRi是一種基于CRISPR-cas9調(diào)控基因表達(dá)的技術(shù)。CRISPRi中的dCas9無(wú)核酸酶活性,但可在sgRNA的指導(dǎo)下與靶序列特異性結(jié)合干擾正常的RNA轉(zhuǎn)錄,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向基因表達(dá)水平的可控調(diào)節(jié)[12]。已有研究利用CRISPRi技術(shù)成功敲低恥垢分支桿菌中的pknB和sigH基因,實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因轉(zhuǎn)錄的干擾作用[13]。

海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum,M.marinum)是一種主要感染兩棲類和魚(yú)類的病原菌。研究表明,海分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)有較近的親緣關(guān)系,兩者核酸相似度高達(dá)95%[14],感染宿主的途徑類似[15],而研究海分枝桿菌的生物安全設(shè)施相對(duì)較低,故常被作為模式菌來(lái)研究結(jié)核分枝桿菌的生物功能。

PPE13屬于分枝桿菌 PE/PPE蛋白家族,該家族部分蛋白與其致病性相關(guān),并且參與宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)[16]。研究發(fā)現(xiàn)PPE13可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的死亡和相關(guān)IL-6的表達(dá)[17],同時(shí)也有研究表明牛分枝桿菌PPE13可激活NLRP3炎癥復(fù)合體,并促進(jìn)IL-1β的分泌[18]。而海分枝桿菌PPE13具體致病機(jī)制有待研究。本研究使用分子克隆技術(shù)和CRISPRi技術(shù)構(gòu)建出海分枝桿菌PPE13基因敲低菌株,顯著降低了海分枝桿菌PPE13基因的轉(zhuǎn)錄,研究結(jié)果為進(jìn)一步探索PPE13蛋白調(diào)控結(jié)核分枝桿菌感染的具體機(jī)制提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料人源單核細(xì)胞(THP-1)、海分枝桿菌和大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pRH2521、 pRH2502購(gòu)自Addgene;限制性內(nèi)切酶Bbs Ⅰ和T4DNA 連接酶購(gòu)自NEB公司;DL2000 DNA Marker、無(wú)水四環(huán)素(anhydrotetracycline,ATC)購(gòu)自TaKaRa公司;DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司;卡那霉素和潮霉素購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;7H9、7H10培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司;OADC添加劑購(gòu)自青島海博生物科技公司;細(xì)菌RNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自東洋紡生物科技有限公司;1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2 sgRNA的設(shè)計(jì)在NCBI上檢索海分枝桿菌PPE13基因的序列,將PPE13所在的CDS區(qū)序列黏貼至CRISPR在線設(shè)計(jì)工具網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu/),選擇綜合評(píng)分較高的sgRNA。根據(jù)pRH2521載體上BbsⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),在選定的sgRNA序列5′端添加GGGA,對(duì)應(yīng)互補(bǔ)鏈的3′端添加AAAC,設(shè)計(jì)出4個(gè)成對(duì)的序列(表1)。

表1 引物信息

1.3 含有sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Bbs Ⅰ在37℃金屬浴中酶切pRH2521載體2 h,酶切體系:BbsⅠ 2 μL,pRH2521載體20 μL,10×CutSmart 5 μL,ddH2O 13 μL,回收酶切產(chǎn)物。將成對(duì)的sgRNA退火成雙鏈,與回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行酶連。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài),在含有潮霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性單克隆菌落,挑取陽(yáng)性菌,搖菌擴(kuò)增,提取重組質(zhì)粒pRH2521-sgRNA進(jìn)行測(cè)序。

1.4 敲低菌株的構(gòu)建將海分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍,向感受態(tài)細(xì)胞中加入1 μg pRH2502質(zhì)粒,在冰上靜置20 min。取4 mmol/L的電轉(zhuǎn)杯進(jìn)行電轉(zhuǎn),電轉(zhuǎn)條件為電壓2 500 V,電容25 μF,電阻1 000 Ω。向電轉(zhuǎn)杯內(nèi)加入200 μL的7H9培養(yǎng)基,再將全部液體轉(zhuǎn)移至分裝有600 μL 7H9培養(yǎng)基的1.5 mL EP試管中,避光30℃、100 r/min培養(yǎng)6 h。5 000 r/min離心5 min,棄上清,用60 μL 7H9培養(yǎng)基重懸菌體,涂布到含有卡那霉素的7H10 固體培養(yǎng)基中,30℃避光培養(yǎng)至生長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng),制備成含有pRH2502質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞,再將攜帶有不同sgRNA的重組質(zhì)粒pRH2521-sgRNA以相同的條件電轉(zhuǎn)到感受態(tài)中,涂布于含有卡那霉素和潮霉素的7H10固體培養(yǎng)基中,于30℃避光培養(yǎng),篩選陽(yáng)性單克隆菌落,搖菌備用。

1.5 敲低菌株的誘導(dǎo)表達(dá)取D600 nm約為1的海分枝桿菌,以1∶100接種到100 mL含有10% OADC添加劑的7H9培養(yǎng)基中,加入卡那霉素和潮霉素分別至終質(zhì)量濃度為50 mg/L,30℃、100 r/min避光培養(yǎng)至D600 nm為0.1～0.2。再將菌液轉(zhuǎn)接到50 mL 7H9培養(yǎng)基中,設(shè)未誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組兩組。未誘導(dǎo)組不做處理,誘導(dǎo)組添加5 μL質(zhì)量濃度為2 g/L的ATC誘導(dǎo)劑,使其終質(zhì)量濃度為200 μg/L。加入誘導(dǎo)劑后不同時(shí)間檢測(cè)菌液D600 nm,每組取3個(gè)重復(fù),繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線;另取適量菌液用于提取細(xì)菌RNA。

1.6 細(xì)菌RNA的提取使用柱式細(xì)菌總 RNA 抽提純化試劑盒提取細(xì)菌RNA。按照該試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)菌的收集和漂洗。為了提高RNA提取的效率,在加入溶菌酶和裂解液后加入適量的研磨珠,利用組織破碎儀進(jìn)行破碎。然后再按照說(shuō)明書(shū)用乙醇等其他試劑提取純化RNA。用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA在260/280 nm處的D值。取500 ng RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,其余RNA于-80℃保存,以防降解。

1.7 PPE13和dCas9轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄使用ReverTra Ace qPCR RT Kit(with gDNA Remover),10 μL反應(yīng)體系中加入500 ng RNA。各取1 μL cDNA,使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 通過(guò)qRCR檢測(cè)PPE13和dCas9的Ct值,每組設(shè)3個(gè)平行,以sigA為內(nèi)參基因,采用相對(duì)定量的方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

1.8 誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度的選擇使用CRISPRi系統(tǒng)抑制目的基因的表達(dá),誘導(dǎo)劑ATC的質(zhì)量濃度發(fā)揮重要的作用。參照文獻(xiàn)[13]的方法,分別選用質(zhì)量濃度為0,100,200,400和800 μg/L的ATC進(jìn)行誘導(dǎo),探索誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度和目的基因轉(zhuǎn)錄水平兩者之間的關(guān)系。

1.9 海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞THP-1內(nèi)增殖情況檢測(cè)使用或不使用200 μg/L ATC作用于含有sgRNA1的海分枝桿菌重組菌株,24 h后分別將誘導(dǎo)菌株和非誘導(dǎo)菌株以MOI(細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù))10∶1的比例感染THP-1細(xì)胞,感染后24 h裂解細(xì)胞,裂解液梯度稀釋至10-5,取10-3,10-4,10-53個(gè)梯度各10 μL,每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù),點(diǎn)板至含有卡那霉素和潮霉素的7H10(含10% OADC)固體培養(yǎng)基中,避光靜置培養(yǎng)于30℃條件下,至生長(zhǎng)出單菌落并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.10 數(shù)據(jù)分析利用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖形制作及統(tǒng)計(jì)分析,使用t檢驗(yàn)的方法分析誘導(dǎo)前后D600 nm變化、目的基因表達(dá)差異和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存活數(shù)目變化的顯著性。數(shù)據(jù)表示為所獲數(shù)據(jù)的SD,*表示P<0.05(有差異),**表示P<0.01(差異顯著),***表示P<0.001(差異極顯著),ns表示無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 pRH2521-sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建本研究使用的CRISPRi技術(shù)是通過(guò)ATC誘導(dǎo)質(zhì)粒pRH2502、pRH2521分別表達(dá)出dCas9和sgRNA,兩者共同作用于DNA的特異性位點(diǎn),阻止目的基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)水平的降低[19-20]。前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)為5′-NGG-3′,該種序列可促使dCas9-sgRNA復(fù)合體與靶基因的識(shí)別與結(jié)合。以NGG為PAM序列,在PPE13編碼區(qū)正義鏈上選擇了4條sgRNA,分別位于編碼區(qū)86,244,392,955 bp處(圖1)。將對(duì)應(yīng)的sgRNA單鏈退火合成雙鏈后,將其與經(jīng)酶切過(guò)的pRH2521質(zhì)粒片段酶連,酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,菌落PCR篩選出陽(yáng)性單克隆,測(cè)序并比對(duì)序列無(wú)誤,表明pRH2521-sgRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 sgRNA靶位點(diǎn)選擇示意圖

2.2 海分枝桿菌敲低菌株的構(gòu)建首先將含有dCas9的質(zhì)粒pRH2502電轉(zhuǎn)至海分枝桿菌感受態(tài)中,涂布于含50 mg/L卡那霉素的7H10固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑選6個(gè)單菌落克隆,經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證獲得3個(gè)含有pRH2502質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆(圖2)。將陽(yáng)性克隆擴(kuò)增,制成含有pRH2502質(zhì)粒的海分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞,再將重組質(zhì)粒pRH2521-sgRNA電轉(zhuǎn)至該感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L潮霉素的7H10固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。PCR驗(yàn)證篩選出含有pRH2521-sgRNA重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker;1～6.待驗(yàn)證的菌落;7.陰性對(duì)照;8.陽(yáng)性對(duì)照

M.DL2000 DNA Marker;1～4.分別表示sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4位點(diǎn)的不同pRH2521-sgRNA重組質(zhì)粒;5.陽(yáng)性對(duì)照;6.陰性對(duì)照

2.3 CRISPRi 敲低海分枝桿菌PPE13挑取敲低菌株的單克隆至含有ATC的7H9培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),對(duì)照組不加ATC。分別在培養(yǎng)后6,12,24,48 h收集菌體,進(jìn)行細(xì)菌總RNA提取,qPCR檢測(cè)dCas9和PPE13的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,和對(duì)照組相比,誘導(dǎo)組的dCas9轉(zhuǎn)錄水平在不同時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)顯著升高,且基本呈現(xiàn)時(shí)間依賴性(圖4A,C,E,G)。設(shè)計(jì)的4條sgRNA中,sgRNA1對(duì)PPE13基因轉(zhuǎn)錄的抑制效果最佳,最高可達(dá)91.64%(圖4B);其次是sgRNA3,可使PPE13基因轉(zhuǎn)錄水平降低50%～60%(圖4F);sgRNA2和sgRNA4的抑制效果較差(圖4D,H)。

2.4 海分枝桿菌PPE13敲低對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響選取對(duì)PPE13轉(zhuǎn)錄水平有抑制作用的2株重組菌株(含有sgRNA1和sgRNA3的重組菌株),培養(yǎng)至含有或不含有ATC的7H9培養(yǎng)基中。在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)菌D600 nm,并繪制海分枝桿菌PPE13敲低的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示,和對(duì)照組相比,誘導(dǎo)組的D600 nm均沒(méi)有顯著性差異(圖5)。這說(shuō)明敲低PPE13對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)無(wú)顯著性影響。

2.5 敲低PPE13對(duì)海分枝桿菌胞內(nèi)增殖的影響用敲低PPE13的海分枝桿菌(含有sgRNA1的重組菌株)以MOI為10∶1感染THP-1細(xì)胞,在感染24 h后裂解細(xì)胞,倍比稀釋細(xì)胞裂解液,點(diǎn)板進(jìn)行胞內(nèi)CFU檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),和對(duì)照組相比,PPE13敲低后的胞內(nèi)CFU數(shù)量降低至6.5×106,顯著低于對(duì)照組(圖6),這說(shuō)明PPE13可以促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的增殖和生存。

2.6 誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度的選擇選擇含有sgRNA1的重組菌株,向7H9培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度ATC(0,100,200,400,800 μg/L),檢測(cè)誘導(dǎo)24 h后dCas9和PPE13的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,用質(zhì)量濃度為200 μg/L ATC誘導(dǎo)的dCas9表達(dá)水平達(dá)到最高值(圖7A),而PPE13基因的轉(zhuǎn)錄水平卻隨著ATC質(zhì)量濃度的增加而逐漸降低,用質(zhì)量濃度為400 μg/L ATC誘導(dǎo)時(shí)PPE13的轉(zhuǎn)錄水平降至最低值(約為6%,圖7B)。

3 討論

由于分枝桿菌菌內(nèi)基因重組效率非常低,針對(duì)分枝桿菌的基因敲除一直以來(lái)都是一個(gè)難題。雖然近年來(lái)研究者們廣泛利用轉(zhuǎn)座子突變、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)等技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)分枝桿菌基因的定向敲除,但這些技術(shù)只局限于對(duì)非必需基因的敲除,并且存在構(gòu)建過(guò)程繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)、重組效率低等諸多缺點(diǎn)。而CRISPRi技術(shù)是一種基于誘導(dǎo)調(diào)控dCas蛋白表達(dá)、且不改變?cè)行蛄械幕蚯玫图夹g(shù),可以更簡(jiǎn)單高效的實(shí)現(xiàn)微生物的靶向基因調(diào)控,并且可用于必需基因的研究。相對(duì)于基因敲除,CRISPRi下調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄水平更為可控[21-22]。SINGH等[13]成功利用CRISPRi靶向敲低了恥垢分枝桿菌的PknB、sigH基因;CHOUDHARY等[23]成功利用CRISPRi靶向敲低了結(jié)核分枝桿菌Rv1713(EngA)、Rv2150c(FtsZ)、Rv2460c(ClpP2)和Rv3417c(GroEL1)等基因。

A、C、E、G.dCas9和sgRNA誘導(dǎo)前后的dCas9表達(dá)情況;B、D、F、H.dCas9和sgRNA誘導(dǎo)前后PPE13表達(dá)情況

A.含有sgRAN1的重組海分枝桿菌;B.含有sgRNA3的重組海分枝桿菌

圖6 PPE13對(duì)海分枝桿菌胞內(nèi)增殖的影響

圖7 不同質(zhì)量濃度ATC誘導(dǎo)dCas9(A)和PPE13(B)的表達(dá)情況

強(qiáng)毒力的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌是通過(guò)免疫機(jī)制的調(diào)控來(lái)逃避宿主細(xì)胞的攻擊,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌在體內(nèi)的繁殖擴(kuò)散。PE/PPE家族部分成員的功能已被證實(shí),但大多數(shù)成員的生物功能和機(jī)制仍不清楚[24]。本試驗(yàn)用CRISPRi技術(shù)構(gòu)建海分枝桿菌PPE13敲低菌株。在目的基因PPE13上設(shè)計(jì)4個(gè)sgRNA。每個(gè)sgRNA在識(shí)別PAM序列之后和靶基因中的20個(gè)同源堿基序列相結(jié)合,且每個(gè)sgRNA設(shè)計(jì)在模板鏈上,和非模板鏈結(jié)合。在設(shè)計(jì)的4個(gè)特異性sgRNA中,sgRNA1、sgRNA3基本實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的高效抑制。

sgRNA2在誘導(dǎo)前期抑制表達(dá)效果較明顯,24 h后抑制效果減弱甚至消失。sgRNA4的抑制表達(dá)效果最差。sgRNA2位點(diǎn)在前期發(fā)揮抑制作用,但后期抑制作用消失,這可能與脫靶有關(guān)。sgRNA2在誘導(dǎo)后期結(jié)合到基因組上其他位點(diǎn),導(dǎo)致了即使dCas9的表達(dá)水平較高,但對(duì)PPE13的表達(dá)無(wú)明顯抑制作用。是否是由于脫靶導(dǎo)致的這種情況,有待進(jìn)一步研究。雖然dCas9的表達(dá)水平較高,但sgRNA4對(duì)于PPE13表達(dá)的抑制作用卻并不明顯,這可能是由于sgRNA4較靠近編碼區(qū)3′端。LARSON等[25]研究也發(fā)現(xiàn),當(dāng)sgRNA靠近3′端時(shí)CRSIPRi的干擾效果較差。

本試驗(yàn)也探索了不同質(zhì)量濃度的誘導(dǎo)劑對(duì)目的基因的抑制能力的影響。和SINGH等[13]的研究結(jié)果一致,質(zhì)量濃度為200 μg/L的ATC基本可以實(shí)現(xiàn)dCas9最高表達(dá)水平,質(zhì)量濃度為400 μg/L的ATC誘導(dǎo)劑對(duì)目的基因的抑制程度最高。在一定條件下,基因的抑制程度隨誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度的增加而增加。一些基因表達(dá)抑制試驗(yàn)中可能不需要最大程度的抑制效果,因此可以通過(guò)控制ATC質(zhì)量濃度的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)抑制效果的調(diào)節(jié)。以達(dá)到適合試驗(yàn)條件的最佳水平。

牛分枝桿菌侵入宿主機(jī)體后,通過(guò)吞噬作用進(jìn)入到巨噬細(xì)胞內(nèi)來(lái)躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[26]。因此,為研究PPE13是否和海分枝桿菌在宿主體內(nèi)存活能力相關(guān),本試驗(yàn)利用海分枝桿菌PPE13敲低菌株感染THP-1細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的存活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PPE13可以促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的存活,有助于細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的增殖。而PPE13是否參與并調(diào)控炎癥反應(yīng),會(huì)影響哪些炎癥因子及具體的致病機(jī)制,仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究利用CRISPRi成功構(gòu)建海分枝桿菌PPE13敲低菌株,初步發(fā)現(xiàn)敲低PPE13會(huì)降低細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的增殖能力,為進(jìn)一步研究分枝桿菌PPE13基因的功能和致病機(jī)制提供了依據(jù)。