妊娠期糖尿病患者血清NLRP3炎性小體信號(hào)通路的臨床研究

何 苗, 曹 羽, 王 佳, 陳 璐, 苗春菊

(蘇州大學(xué)附屬常熟醫(yī)院 產(chǎn)科, 江蘇 常熟, 215500)

妊娠期糖尿病(GDM)是妊娠期常見的糖代謝異常,全球發(fā)生率約為18%[1], 中國發(fā)病率為5%～10%[2]。GDM發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),儼然成為世界范圍內(nèi)重要且日益升級(jí)的健康問題。GDM不僅增加胎兒畸形、羊水過少、羊水過多、胎兒發(fā)育遲緩、巨大兒、肩難產(chǎn)、臂叢神經(jīng)損傷、新生兒呼吸窘迫綜合征、死胎、死產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)增加母體妊娠期高血壓性疾病、難產(chǎn)、手術(shù)產(chǎn)、產(chǎn)時(shí)及產(chǎn)后出血及產(chǎn)后2型糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此,探索GDM的發(fā)病機(jī)制及尋找有效的防治方法是臨床亟待解決的問題。目前研究發(fā)現(xiàn), GDM的發(fā)生與機(jī)體固有免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體活化后在凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)的協(xié)助下募集并活化半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶-1(Caspase-1), 導(dǎo)致炎性因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)的成熟和分泌,進(jìn)而介導(dǎo)炎癥性程序性細(xì)胞死亡(即細(xì)胞焦亡),誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng),與GDM的發(fā)生密切相關(guān)。故本研究探討核苷酸NLRP3炎性小體的細(xì)胞焦亡相關(guān)NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-1β/IL-18-TGF-β信號(hào)通路在GDM發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與材料

1.1.1 研究對(duì)象: 選取2020年6月—2022年6月在本院產(chǎn)科門診產(chǎn)檢的GDM患者80例為研究對(duì)象。其中孕期未予胰島素治療患者60例(未予胰島素治療GDM組),平均年齡為(29.13±5.28)歲,平均孕周為(24.45±2.70)周。孕期予胰島素治療患者20例(胰島素治療GDM組),平均年齡為(30.01±4.86)歲,平均孕周為(24.50±1.15)周。選擇同期健康孕婦30例作為對(duì)照組,平均年齡(28.73±5.42)歲,平均孕周為(24.22±1.59)周。各組在年齡、孕周等方面比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05), 具有可比性。本研究已取得所有患者的知情同意,并獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn): 根據(jù)人民衛(wèi)生出版社《婦產(chǎn)科學(xué)》(第九版)診斷標(biāo)準(zhǔn),于孕24～28周行75 g葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT), 空腹、OGTT 1 h、OGTT 2 h的血糖界值分別為5.1、10.0、8.5 mmol/L, 任何一項(xiàng)達(dá)到或超過其相應(yīng)界值即可診斷為GDM。納入標(biāo)準(zhǔn): 患者為自然受孕的單胎妊娠,且臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn): 妊娠前糖尿病患者; 感染性疾病、甲狀腺功能亢進(jìn)等其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病患者; 近期服用糖皮質(zhì)激素以及心、肺、腎等功能障礙患者。

1.1.2 主要儀器及試劑: 北京東勝ETC811 PCR擴(kuò)增儀、新加坡ABI QuantStudio 5熒光定量PCR測(cè)定儀、美國Eppendorf Centrifuge 5418R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Centrifuge 5702R臺(tái)式高速離心機(jī)、上海天能電泳裝置、Tanon 4600SF凝膠成像系統(tǒng)、杭州奧盛Nanodrop 400A超微量紫外分光光度計(jì)、美國Molecular Devices FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀、海門其林貝爾GL-1900恒溫金屬浴、上海一恒DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱。北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司: 人淋巴細(xì)胞分離液; Takara Bio: PrimeScriptTMRTreagent Kit、RNAiso plus試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒; abcam: Anti-NLRP3 antibody、Anti-ASC antibody、Anti-Caspase-1 antibody; 上海碧云天生物有限公司: Western blot細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液; 上海廣銳生物科技有限公司: IL-1β、IL-18、TGF-β ELISA試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 資料收集: 收集研究對(duì)象年齡、孕周、身高、體質(zhì)量等基礎(chǔ)資料,同時(shí)檢測(cè)空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等生化資料。所有研究對(duì)象均禁食8 h以上,抽取20 mL肘靜脈血,取2 mL全血3 000轉(zhuǎn)/mL離心10 min, 留取上清并凍存于-80 ℃冰箱備用,剩余全血經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液分離后采用Ficoll-Hypaque密度梯度分離法,嚴(yán)格按照試劑盒說明書分離出外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)備用。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(qRT-PCR): 應(yīng)用RNAiso plus試劑盒提取人PBMCs總RNA。經(jīng)純度檢測(cè)與定量后,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再按照RT-PCR試劑說明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的反應(yīng)時(shí)間與溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 50個(gè)循環(huán)。引物序列:NLRP3上游引物為5′-AAAGCCAAGAATCCACAGTGTAAC-3′, 下游引物為5′-TTGCCTCGCAGGTAAAGGT-3′;ASC上游引物為5′-GGATGCTCTGTACGGGAAGG-3′, 下游引物為5′-CGCATCTTGCTTGGGTTG-3′;Caspase-1上游引物為5′-AGGCATGACAATGCTGCTACAA-3′, 下游引物為5′-TGTGCAAATGCCTCCAGCTC-3′;GAPDH上游引物為5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′, 下游引物為5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct方法分析相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot) : 常規(guī)方法提取人PBMCs總蛋白,嚴(yán)格按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度。含50 ng蛋白質(zhì)的上樣樣品經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PDVF)膜上, BSA-TBS室溫封閉1 h, 與一抗稀釋液(NLRP3、ASC、Caspase-1、GAPDH)4 ℃孵育過夜。次日,經(jīng)洗膜緩沖液(TBST)洗滌后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h。使用Tanon-Chemi成像系統(tǒng)(Tanon-4600SF)掃描蛋白條帶。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA): 應(yīng)用人IL-1β、IL-18、TGF-β ELISA試劑盒,嚴(yán)格按照說明書操作,每個(gè)樣本均設(shè)置2個(gè)復(fù)孔,取均值納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 3組患者基本情況及血脂、血糖水平變化

3組患者年齡、孕周比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); GDM患者(未予胰島素治療GDM組、胰島素治療GDM組)的BMI、FPG、HbA1c、TC、TG高于對(duì)照組, HDL-C低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 胰島素治療GDM組的FPG、HbA1c高于未予胰島素治療GDM組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 3組基本情況及血脂、血糖水平變化比較

2.2 3組PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及其蛋白水平

胰島素治療GDM組(Treated)和未予胰島素治療GDM組(Untreated)的NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(Ctrl),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 胰島素治療GDM組略高于未予胰島素治療GDM組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見圖1。胰島素治療GDM組(Treated)中的NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達(dá)高于未予胰島素治療GDM組(Untreated)和對(duì)照組(Ctrl), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。

2.3 3組血清中IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化

GDM患者(未予胰島素治療GDM組、胰島素治療GDM組)的血清IL-1β、IL-18、TGF-β高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 胰島素治療GDM組的血清IL-1β、IL-18、TGF-β高于未予胰島素治療GDM組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 3組血清IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較 ng/L

2.4 3組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA水平與各變量的Spearman相關(guān)性分析

NLRP3mRNA在對(duì)照組、未予胰島素治療GDM組均無相關(guān)性,在胰島素治療GDM組與FPG呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.322(P=0.028);ASCmRNA在對(duì)照組無相關(guān)性,在未予胰島素治療GDM組與HbA1c呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.483(P=0.035), 在胰島素治療GDM組與HbA1c、TG呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.512(P=0.026)和0.427(P=0.029);Caspase-1mRNA在對(duì)照組與FPG 呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.438(P=0.015), 在未予胰島素治療GDM組與BMI呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.328(P=0.036), 在胰島素治療GDM組與BMI、TC呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.352(P=0.033)和0.487(P=0.017)。

2.5 3組NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白水平與各變量的Spearman相關(guān)性分析

NLRP3在3組均無相關(guān)性; ASC在對(duì)照組無相關(guān)性,在未予胰島素治療GDM組與FPG、HbA1c呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.384(P=0.031)和0.463(P=0.027), 在胰島素治療GDM組與FPG、TC、IL-1β、IL-18呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.414(P=0.023)、0.472(P=0.031)、0.493(P=0.029)和0.512(P=0.019)。Caspase-1在對(duì)照組與FPG呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.537(P=0.025), 在未予胰島素治療GDM組與FPG、HbA1c、LDL-C、IL-1β呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.439(P=0.013)、0.452(P=0.021)、0.517(P=0.018)和0.602(P=0.009); Caspase-1在胰島素治療GDM組與FPG、HbA1c、LDL-C、IL-1β呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.578(P=0.021)、0.502(P=0.021)、0.491(P=0.017)和0.584(P=0.023), 見表3。

2.6 3組血清IL-1β、IL-18、TGF-β之間的Spearman相關(guān)性分析

IL-1β在GDM患者(未予胰島素治療GDM組、胰島素治療GDM組)與TGF-β呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.613(P=0.014)和0.729(P=0.009), 而三者之間在對(duì)照組無相關(guān)性,見表4。

表4 3組血清IL-1β、IL-18、TGF-β之間的相關(guān)性分析

3 討 論

正常孕婦由于體內(nèi)拮抗胰島素樣物質(zhì)增加,胰島素敏感性下降50%～60%, 同時(shí)胰島素代償性分泌增加以維持正常血糖。胰島素抵抗(IR)被認(rèn)為參與GDM發(fā)生發(fā)展的病理生理過程[3-4]。IR是胰島素敏感性降低的一種病理生理狀態(tài),可由缺氧、糖脂代謝異常等通過炎癥反應(yīng)介導(dǎo)而產(chǎn)生,炎癥因子很有可能是IR的“啟動(dòng)子”[5-7]。

細(xì)胞焦亡是一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡形式[8-9]。細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑之一是通過NLRP3識(shí)別病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式,激活由NLRP3、ASC和Caspase-1前體(pro-Caspase-1)組成的多蛋白復(fù)合體,即NLRP3炎性體,進(jìn)而活化和產(chǎn)生Caspase-1; 活化的Caspase-1切割下游的Gasdermin D, 在細(xì)胞膜上形成孔洞,進(jìn)而促進(jìn)裂解性細(xì)胞死亡; 同時(shí)Caspase-1活化和釋放IL-1β、IL-18等炎癥因子,進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)[9-10]。炎癥因子的表達(dá)增加促使抗炎因子TGF-β的過度表達(dá)。研究[11]指出, GDM患者胎盤組織中H2S合成酶缺乏,可能會(huì)過度激活NLRP3炎癥小體,促使炎癥反應(yīng)引起細(xì)胞焦亡。

IL-1β作為趨化因子家族的一員,是重要的炎性細(xì)胞因子。一方面, GDM患者體內(nèi)高水平IL-1β可激活脂肪組織中的p38MAPK, 增強(qiáng)母體炎癥反應(yīng)及IR; 另一方面,通過下調(diào)胰島素受體底物-1的表達(dá),降低脂肪細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT-4D)及胰島素敏感基因PPARy的表達(dá)等途徑產(chǎn)生IR; 同時(shí)研究[12]發(fā)現(xiàn), GDM患者IL-1β rs16944 AA基因型與胰島素治療頻率及每日需求量的增加有關(guān)。通過小鼠試驗(yàn)[13]發(fā)現(xiàn), IL-1β表達(dá)量在GDM小鼠子宮、胎盤組織及血液中均增加,而GDM小鼠應(yīng)用抗IL-1β抗體后糖耐量得到改善,但胰島素分泌無顯著改變,表明抗IL-1β治療后有胰島素增敏作用。

IL-18作為一種促炎因子,被激活后可穿過細(xì)胞膜上的孔洞,促進(jìn)炎癥因子的合成、聚集,引發(fā)炎癥反應(yīng)[14]。本研究中, GDM患者血清IL-18水平升高,與武楠等[3]研究相符。FATIMA S S等[15]發(fā)現(xiàn), GDM患者IL-18水平升高與低度炎癥、IR有關(guān)。TARNOWSKI M等[16]研究發(fā)現(xiàn), IL-18 rs187238和rs1946518基因多態(tài)性可能影響孕婦GDM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

TGF-β作為蛋白質(zhì)超家族的一員,可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化?；罨腡GF-β可抑制β細(xì)胞增殖,加快β細(xì)胞凋亡,從而使得胰島素分泌減少。TGF-β通過促進(jìn)纖溶酶原激活物抑制劑-1的表達(dá)誘導(dǎo)IR; 同時(shí)激活Smad3 信號(hào)通路,促進(jìn)參與胰島素作用的相關(guān)基因和脂代謝基因的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致IR[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn), TGF-β3 rs2284792的AA和AG基因型多態(tài)性可能與GDM患病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。

本研究顯示, GDM患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表達(dá)水平及其蛋白表達(dá)水平顯著性增加; 血清中IL-1β、IL-18、TGF-β水平顯著增加, ASC與IL-1β、IL-18呈正相關(guān), Caspase-1與IL-1β呈正相關(guān),且IL-1β與TGF-β呈正相關(guān),提示以NLRP3炎性小體為中心的細(xì)胞焦亡相關(guān)NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-1β/IL-18-TGF-β信號(hào)通路可能在GDM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究[19]發(fā)現(xiàn),細(xì)胞焦亡促使胰腺β細(xì)胞數(shù)量減少和IR的發(fā)生。本研究認(rèn)為,以NLRP3炎性小體為中心的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路活化并產(chǎn)生下游炎性因子,進(jìn)而介導(dǎo)IR,導(dǎo)致GDM的發(fā)生。研究[20]發(fā)現(xiàn), NLRP3炎性小體和細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑的激活可能促進(jìn)脂肪或胎盤組織炎癥,參與GDM發(fā)生; OLMOS-ORTIZ A等[21]也認(rèn)為,胎盤和脂肪組織中的炎癥反應(yīng)是引起IR及進(jìn)一步導(dǎo)致GDM發(fā)生的重要因素。韓寧等[22]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞焦亡因子NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表達(dá)水平在GDM孕婦血清中顯著升高,這與本研究結(jié)果基本相符,同時(shí)研究指出由細(xì)胞焦亡誘發(fā)炎癥相關(guān)信號(hào)通路的激活,而產(chǎn)生的慢性炎癥狀態(tài)是導(dǎo)致IR的重要因素,且與孕婦不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)。

本研究顯示, GDM組患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表達(dá)水平均顯著增加,且ASCmRNA與HbA1c、TG呈正相關(guān),Caspase-1mRNA與BMI、TC呈正相關(guān),提示在基因轉(zhuǎn)錄水平, GDM患者NLRP3炎性小體的表達(dá)顯著增加,糖脂代謝異常、高BMI可能對(duì)其起到促進(jìn)作用。GDM組患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著增加,且ASC蛋白表達(dá)水平與FPG、HbA1c、TC呈正相關(guān), Caspase-1蛋白表達(dá)水平與FPG、HbA1c、LDL-C呈正相關(guān),提示在翻譯水平, GDM患者NLRP3炎性小體的表達(dá)顯著增加,高血糖、高血脂可能對(duì)其起到促進(jìn)作用。溫金等[23]發(fā)現(xiàn),在GDM發(fā)病過程中,高糖可誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡并釋放炎性介質(zhì),導(dǎo)致局部以及全身炎癥并引發(fā)IR, 與本研究結(jié)果相符。

綜上所述,激活NLRP3炎性小體表達(dá)的危險(xiǎn)因素包括高血糖、高血脂及高BMI, 加強(qiáng)孕期對(duì)血糖、血脂、體質(zhì)量的控制,降低以NLRP3炎性小體為中心的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路的激活,減輕不同炎癥因子之間互相交錯(cuò)的炎癥反應(yīng),可能對(duì)GDM的防治、早期干預(yù)以及良好母嬰結(jié)局有重要意義。研究[24]發(fā)現(xiàn),過敏介質(zhì)阻釋劑——曲尼司特通過抑制NLRP3炎性小體的激活減輕炎癥反應(yīng),對(duì)GDM起到正向作用。進(jìn)一步研究NLRP3炎性小體及其下游炎癥因子的激活、調(diào)控機(jī)制,有望在細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步明確GDM的發(fā)病機(jī)制,為GDM的預(yù)防及診治提供潛在靶標(biāo)和新突破點(diǎn)。