PLCH1基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖、遷移的影響

卞琳，高迎真，申柳依，張玲

山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，山西太原030001

食管癌作為世界上第6大致死性癌癥，是侵襲性最強(qiáng)的惡性腫瘤之一［1］。我國食管癌的主要組織學(xué)類型為食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）［2］。大多數(shù)ESCC 患者就診時(shí)已屬中晚期，常缺乏根治性手術(shù)的機(jī)會，患者的5 年生存率低于30%［3］。與其他癌癥類型相比，ESCC的早診標(biāo)記物及靶向治療藥物非常局限，缺乏可供參考的國際標(biāo)準(zhǔn)。深入探索ESCC 的發(fā)生發(fā)展機(jī)理，對發(fā)現(xiàn)診斷及監(jiān)測的分子標(biāo)志物、制定有效的臨床干預(yù)措施至關(guān)重要。

PLCH1（phospholipase C eta 1）位于3 號染色體3q25.31 區(qū)段，是磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（phospholipase C，PLC）超家族PLC-eta 的一員，該家族的酶能裂解磷脂酰肌醇-二磷酸PtdIns（P2）以產(chǎn)生第二信使肌醇-三磷酸（inositol triphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG），在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用［4-5］。目前，PLCH1 在腫瘤中的功能及作用機(jī)制研究較少，PLCH1的單核苷酸多態(tài)性與鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)［6］。PLCH1基因是PLC途徑的關(guān)鍵一員，其在慢性粒細(xì)胞白血病中與酪氨酸激酶抑制劑的藥物敏感性相關(guān)，其表達(dá)上調(diào)降低了患者對伊馬替尼的藥物敏感性［7］。

目前有關(guān)PLCH1在食管癌中機(jī)制的研究未見相關(guān)報(bào)道。本課題組前期對508 例ESCC 及其配對正常組織進(jìn)行的全基因組測序發(fā)現(xiàn)［8］，PLCH1基因在ESCC中存在顯著的拷貝數(shù)擴(kuò)增，表明PLCH1與ESCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在通過免疫組化等方法探討ESCC 中PLCH1的表達(dá)，通過體外試驗(yàn)檢測PLCH1敲低后對人ESCC 細(xì)胞遷移和增殖能力的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床樣本 收集山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院70例ESCC患者手術(shù)切除的原發(fā)腫瘤組織、配對癌旁正常組織的石蠟包埋組織，制備組織芯片。病例中包括男性45 例，女性25 例；年齡60 歲以上者43 例，60歲以下者27 例；TNM 分期Ⅰ~ Ⅱ期36 例，Ⅲ~ Ⅳ期34 例；有淋巴轉(zhuǎn)移34 例，無淋巴轉(zhuǎn)移36 例。本研究通過山西醫(yī)科大學(xué)及山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會的審核（倫理號：2017LL037）。

1.2細(xì)胞 人ESCC細(xì)胞系KYESE450、KYSE150、TE-9、KYSE180、TE-14、TE-1、TE-5、TE-15及人食管上皮細(xì)胞Het-1A、人腎上皮細(xì)胞293T均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3主要試劑及儀器 胎牛血清和Opti-MEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；兔抗人PLCH1多克隆抗體（OACD00786）購自美國AVIVA Systems Biology 公司；鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（60004-1-Ig）購自武漢Proteintech 公司；極超敏ECL 發(fā)光試劑盒和MTT 購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔／鼠IgG 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PLCH1siRNA-1（GGATCACGATCCCATTGGA）、siRNA-2（GTTACACTCTCACTTCAAA）和siRNA-3（GAGCTACAGTGACAAGAAA）購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Master Mix）和Real time-PCR 試劑盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTM）購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；TRIzol 試劑和Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司；Transwell 小室購自美國康寧公司；病理掃描系統(tǒng)軟件由Aperio 徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司提供；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4多組學(xué)分析 收集前期508例及癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中95 例ESCC全基因組測序數(shù)據(jù)，通過歸一化腫瘤組織和正常組織數(shù)據(jù)，應(yīng)用SegSeq 在獲得的全基因測序讀長的基礎(chǔ)上進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析。通過拷貝數(shù)片段與單個(gè)基因比對得出基因水平的拷貝數(shù)增加或減少。拷貝數(shù)≤1.5為缺失，拷貝數(shù)≥2.5為擴(kuò)增。為了推斷重復(fù)出現(xiàn)的拷貝數(shù)變異區(qū)域，以1 kb 窗口的拷貝數(shù)為標(biāo)記應(yīng)用GISTIC，根據(jù)發(fā)生頻率及擴(kuò)增／缺失幅度計(jì)算全基因組范圍及基因編碼區(qū)域的G-scores值，當(dāng)Gscores>0.1，P<0.05時(shí)判定為顯著拷貝數(shù)變異區(qū)域。以基因型組織表達(dá)（genotype-tissue expression，GTEx）中食管癌數(shù)據(jù)和TCGA-ESCA 中10 例食管癌癌旁組織數(shù)據(jù)為正常對照數(shù)據(jù)，對TCGA數(shù)據(jù)庫中83例ESCC 的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析。采用Pearson 法篩選PLCH1表達(dá)相關(guān)基因，相關(guān)系數(shù)>0.3者采用京都基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進(jìn)行信號通路富集。

1.5細(xì)胞培養(yǎng) Het-1A和293T細(xì)胞用含10%胎牛血清，100 U／mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清，1%青霉素與鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6免疫組織化學(xué)檢測 在包含70例食管鱗癌組織和癌旁正常組織的組織芯片中，檢測PLCH1 分別在癌旁正常組織和食管鱗癌組織中的表達(dá)。將石蠟包埋的組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。先用梯度濃度水平的二甲苯和乙醇進(jìn)行脫蠟，再在室溫下用3%H2O2孵育20 min；芯片用PBS沖洗3次，每次2 min，在抗原暴露及抗原修復(fù)后，芯片與特異性抗PLCH1 抗體（1∶10稀釋）4 ℃孵育14 h；復(fù)溫1 h；將芯片與二抗37 ℃孵育20 min；使用DAB檢測試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，梯度濃度酒精和二甲苯中脫水，封片。用病理掃描系統(tǒng)軟件分析PLCH1的表達(dá)水平和定位。

1.7細(xì)胞中PLCH1蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用PBS 清洗1 次后加入RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），用細(xì)胞刮收集細(xì)胞沉淀，于冰上渦旋裂解1 h。裂解產(chǎn)物4 ℃，11 000×g離心20 min，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。將100 μg 蛋白質(zhì)經(jīng)7% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，再與PLCH1特異性抗體（1∶100稀釋）4 ℃孵育過夜；洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 500稀釋），室溫孵育1.5 h；最后化學(xué)發(fā)光法檢測印跡，并使用Image J分析灰度值。

1.8細(xì)胞中PLCH1基因mRNA表達(dá)的檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法。用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。PLCH1上游引物序列F：5'-TGCTCTGCTCCACAAAGATACCA-3'，下游引物序列R：5'-CTGCTTTGGGGAGAGAGACTT-3'；GAPDH上游引物序列F：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物序列R：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。通過歸一化GAPDH表達(dá)確定PLCH1基因的相對表達(dá)量。

1.9細(xì)胞轉(zhuǎn)染及PLCH1沉默效率的驗(yàn)證 將KYSE180和TE-9 細(xì)胞接種于6 孔板，使細(xì)胞融合度達(dá)70%以上，第2 天轉(zhuǎn)染PLCH1siRNA-1、siRNA-2。分別在500μL Opti-MEM培養(yǎng)基中加入10μLPLCH1siRNA 和10 μL Lipofectamine 2000，室溫靜置5min；將稀釋的Lipofectamine 2000緩慢滴入稀釋的PLCH1siRNA中，室溫靜置20 min；PBS 清洗6 孔板中的細(xì)胞，將混懸液緩慢加入培養(yǎng)板內(nèi)，4 h后補(bǔ)加1 mL無雙抗完全培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞沉淀，qPCR 和Western blot 法驗(yàn)證PLCH1的沉默效率。設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對照組。

1.10細(xì)胞增殖活力的檢測 采用MTT 比色法。將轉(zhuǎn)染的KYSE180、TE-9細(xì)胞按（3~5）×103個(gè)／孔的密度接種至96 孔板中培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h加入20μL MTT（5 mg／mL）溶液處理4 h，直至晶體形成；棄去MTT 溶液，加入200 μL 二甲基亞砜溶解晶體。用酶標(biāo)儀測定波長490 nm 處吸光度值，觀察細(xì)胞生長曲線的變化。

1.11細(xì)胞克隆形成能力的檢測 將轉(zhuǎn)染的TE-9細(xì)胞按每孔2 000個(gè)接種于6孔板中培養(yǎng)，于37 ℃，5%CO2條件下孵育10 d，4%聚甲醛固定15 min，1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)50個(gè)以上細(xì)胞的菌落數(shù)。試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.12細(xì)胞遷移能力的檢測 采用Transwell小室試驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染的KYSE180、TE-9細(xì)胞按10×104個(gè)接種于上腔室無血清培養(yǎng)基中，含血清的培養(yǎng)基于下腔室，48 h后，濾膜上方非侵襲性細(xì)胞被清除。用4%多聚甲醛固定遷移的細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS.20 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間差異的比較采用student t檢驗(yàn)，單因素或雙因素方差分析兩個(gè)以上組的數(shù)據(jù)。樣本數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PLCH1在各種癌癥類型中的拷貝數(shù)變化 TCGA數(shù)據(jù)庫中，PLCH1基因在各種癌癥中存在一定的拷貝數(shù)變化（copy number alteration，CNA），鱗癌中以拷貝數(shù)擴(kuò)增為主，其中包括ESCC（擴(kuò)增率23.16%）、肺鱗癌（擴(kuò)增率17.25%）、頭頸鱗癌（擴(kuò)增率8.41%）以及宮頸鱗癌（擴(kuò)增率9.16%），由此可初步推測PLCH1基因擴(kuò)增與鱗狀細(xì)胞癌存在一定的相關(guān)性。見圖1。

圖1 TCGA中各癌癥類型中PLCH1的變異頻率Fig.1 Frequency of PLCH1 mutation in various types of cancer in TCGA

2.2ESCC 中PLCH1拷貝數(shù)的變化 通過對508 例ESCC及TCGA 數(shù)據(jù)庫中95 例ESCC 的全基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析，發(fā)現(xiàn)PLCH1基因所在的染色體區(qū)域在ESCC 中存在顯著的拷貝數(shù)擴(kuò)增，見圖2。

圖2 PLCH1在兩組ESCC對列中的拷貝數(shù)擴(kuò)增熱圖Fig.2 Copy number amplification thermogram of PLCH1 in two ESCC cohorts

2.3ESCC 中PLCH1mRNA 和組織表達(dá)水平 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，ESCC 組織中PLCH1mRNA 表達(dá)水平顯著高于正常組織，差異表達(dá)倍數(shù)（fold change）的log2值為1.313，屬于顯著表達(dá)上調(diào)基因（w=6 829，P<0.000 1），見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中PLCH1的差異表達(dá)Fig.3 Differential expression of PLCH1 in transcriptome data

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，PLCH1 主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上，其在ESCC組織中的表達(dá)量（69.74 ±5.68）顯著高于癌旁正常組織（12.47 ± 1.81），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=55.15，P<0.000 1），見圖4。

圖4 PLCH1 在癌旁正常組織（A）和ESCC 組織（B）中的表達(dá)Fig.4 Expression of PLCH1 in adjacent normal（A）and ESCC（B）tissues

2.4PLCH1在不同ESCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平 qPCR和Western blot分析顯示，以PLCH1在Het-1A細(xì)胞中的表達(dá)為對照，在mRNA水平上，PLCH1在KYSE180、KYSE450、TE-14、TE-5 細(xì)胞中表達(dá)相對較高（F=36.00，P<0.000 1），在KYSE150、TE-9、TE-1、TE-15細(xì)胞中表達(dá)相對較低（F=63.82，P<0.000 1），見表1；在蛋白水平上，PLCH1 在KYSE180、KYSE450、TE-9細(xì)胞中表達(dá)相對較高（F= 1 101，P< 0.000 1），在KYSE150、TE-1、TE-14、TE-5 細(xì)胞中表達(dá)相對較低（F=617.6，P<0.000 1），見圖5和表1。

表1 ESCC 細(xì)胞系中PLCH1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平（±s，n=3）Tab.1 Expression of PLCH1 mRNA and protein in ESCC cell lines（±s，n=3）

表1 ESCC 細(xì)胞系中PLCH1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平（±s，n=3）Tab.1 Expression of PLCH1 mRNA and protein in ESCC cell lines（±s，n=3）

注：與Het-1A細(xì)胞比較，a表示P<0.05；aa表示P<0.01；aaa表示P<0.001；aaaa表示P<0.000 1。

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圖5 Western blot 分析ESCC 細(xì)胞系中PLCH1 蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Western blot analysis of PLCH1 protein expression in ESCC cell lines

2.5PLCH1基因在ESCC細(xì)胞系中的沉默效率 qPCR結(jié)果顯示，與空白對照組相比，KYSE180 和TE-9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 后，PLCH1siRNA-1、PLCH1siRNA-2組細(xì)胞中PLCH1mRNA 的表達(dá)水平均顯著降低（FTE-9=60.54，PTE-9=0.000 1；FKYSE180=2 306，PKYSE180<0.000 1），見表2。Western blot 分析顯示，與空白對照組相比，KYSE180和TE-9細(xì)胞中PLCH1siRNA-1、PLCH1siRNA-2 組細(xì)胞中PLCH1 蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（FTE-9=4 318，PTE-9<0.000 1；FKYSE180=299.4，PKYSE180< 0.000 1），見圖6 和表2。選擇PLCH1沉默效率達(dá)70%以上的細(xì)胞用于后續(xù)細(xì)胞遷移增殖能力檢測。

表2 KYSE180、TE-9各組細(xì)胞中PLCH1 mRNA 和蛋白的表達(dá)（±s，n=3）Tab.2 Expression of PLCH1 mRNA and protein in KYSE180 and TE-9 cells of various groups（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，aaa表示P<0.001；aaaa表示P<0.000 1。

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圖6 Western blot 分析KYSE180 和TE-9 各組細(xì)胞中PLCH1的沉默效率Fig.6 Western blot analysis of silencing efficiency of PLCH1 in KYSE180 and TE-9 cells of various groups

2.6PLCH1 對ESCC 細(xì)胞增殖活力的影響 MTT 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，PLCH1siRNA 組細(xì)胞的增殖能力均顯著降低（FTE-9= 92.40，PTE-9< 0.000 1；FKYSE180=77.31，PKYSE180<0.000 1），見圖7。提示PLCH1可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖能力。

圖7 KYSE-180（A）和TE-9（B）各組細(xì)胞的增殖能力Fig.7 Proliferation ability of KYSE180（A）and TE-9（B）cells of various groups

2.7PLCH1對ESCC細(xì)胞克隆形成能力的影響 克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，PLCH1siRNA 兩組細(xì)胞的集落數(shù)量明顯少于空白對照組（F=634.0，P<0.000 1），見圖8和圖9。提示PLCH1可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的克隆形成能力。

圖8 TE-9各組細(xì)胞的集落形成結(jié)果Fig.8 Colony formation results of TE-9 cells of various groups

圖9 TE-9各組細(xì)胞的集落形成數(shù)目Fig.9 Colony formation numbers of TE-9 cells of various groups

2.8PLCH1對ESCC細(xì)胞遷移能力的影響Transwell小室試驗(yàn)結(jié)果顯示，在KYSE180 和TE-9 細(xì)胞系中，兩個(gè)PLCH1siRNA 組的遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對照組（FTE-9= 219.2，PTE-9< 0.000 1；FKYSE180=35.49，PKYSE180= 0.000 5），見圖10 和圖11。提示PLCH1敲低后可抑制ESCC細(xì)胞系的遷移能力。

圖10 Transwell 小室試驗(yàn)檢測TE-9 和KYSE180 各組細(xì)胞的遷移能力（×100）Fig.10 Detection of migration ability of TE-9 and KYSE180 cells by Transwell assay（×100）

圖11 KYSE180（A）和TE-9（B）各組細(xì)胞的遷移能力Fig.11 Cell migration ability of KYSE180（A）and TE-9（B）of various groups

2.9PLCH1在ESCC 中發(fā)揮癌基因作用的可能信號通路PLCH1顯著相關(guān)的基因主要富集在肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路（regulation of actin cytoskeleton）以及Rap1 信號通路等，見圖12。提示PLCH1在ESCC 細(xì)胞系中發(fā)揮癌基因作用可能通過這些信號通路起作用。

圖12 TCGA 95例ESCC中PLCH1表達(dá)相關(guān)基因KEGG富集分析Fig.12 KEGG enrichment analysis of PLCH1 expression related genes of 95 cases of ESCC in TCGA

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展到轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，基因組變異、表觀遺傳修飾變化、基因表達(dá)水平異常均可能是引起腫瘤發(fā)生甚至轉(zhuǎn)移的重要因素。多組學(xué)聯(lián)合的研究方法對于單獨(dú)癌癥以及泛癌癥研究均具有更加深遠(yuǎn)的意義，可系統(tǒng)闡述癌變機(jī)制，多維解析致病機(jī)理［9-10］。

PLCH1基因是利用ESCC 大樣本組學(xué)測序數(shù)據(jù)的結(jié)果，首次從我國大樣本ESCC的全基因組測序中鑒定到的拷貝數(shù)顯著擴(kuò)增基因。TCGA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)PLCH1在ESCC 中存在顯著上調(diào)，提示ESCC中PLCH1基因的擴(kuò)增可能影響該基因表達(dá)上調(diào)，從而在ESCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

PLCH1最初被報(bào)道主要在神經(jīng)元豐富的區(qū)域表達(dá)，對細(xì)胞內(nèi)Ca2+更敏感，在細(xì)胞內(nèi)被Ca2+激活后，在G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）介導(dǎo)的信號通路充當(dāng)信號放大器［11-13］。PLCH1可能在產(chǎn)前哺乳動物的神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮作用，其有害變異可導(dǎo)致小兒全前腦畸形［4］。目前PLCH1與腫瘤的相關(guān)報(bào)道不多，主要是PLCH1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，PLCH1的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinomas，SQC）發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，PLCH1rs181696 中A 基因型的頻率在SQC 中的發(fā)生頻率高于對照組［6］。在慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）中，主要報(bào)道了CML 細(xì)胞中高水平的SRSF1 使PRKCH 和PLCH1 上調(diào)，從而導(dǎo)致CML 細(xì)胞伊馬替尼敏感性受損，影響酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKIs）對CML的治療［7］。

本實(shí)驗(yàn)中采用免疫組織化學(xué)法［14］檢測PLCH1基因在ESCC 及配對正常組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)PLCH1在ESCC 組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。細(xì)胞水平的功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低PLCH1后抑制ESCC 細(xì)胞的增殖和遷移能力，提示PLCH1基因在ESCC 組織中發(fā)揮癌基因的作用，PLCH1基因可能通過表達(dá)量的增高來調(diào)控ESCC的惡性表型。

但PLCH1促進(jìn)ESCC 增殖遷移的作用機(jī)制尚不明確。生物信息分析表明，PLCH1可能通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路以及Rap1 等信號通路來發(fā)揮作用。肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)相關(guān)通路包含Rho 家族GTPases，細(xì)胞多重活動受到其調(diào)節(jié)［15］，通過調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架相關(guān)功能會影響到細(xì)胞黏附以及細(xì)胞間連接的能力，與細(xì)胞侵襲遷移能力顯著相關(guān)［16］。而Rap1通路中Rap1蛋白是一種控制細(xì)胞黏附、細(xì)胞-細(xì)胞連接形成和細(xì)胞極性等多種過程的小GTPase［17］。Rap1可通過影響Rho家族GTPases，調(diào)節(jié)LIMK、PI4P5K等的磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而影響肌動蛋白骨架的相關(guān)功能［18］。眾所周知，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能的失調(diào)是惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素［19-22］。由此推測，PLCH1促進(jìn)ESCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制可能通過肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路以及Rap1信號通路來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，PLCH1是利用多組學(xué)聯(lián)合分析鑒定出的可能與ESCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因。本實(shí)驗(yàn)已證明，PLCH1在ESCC 中表達(dá)高于癌旁正常組織，且PLCH1敲除后ESCC細(xì)胞增殖和遷移能力減弱，但還需細(xì)胞水平及動物水平的功能試驗(yàn)驗(yàn)證；同時(shí)，PLCH1促進(jìn)ESCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是否通過肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路以及Rap1 信號通路來實(shí)現(xiàn)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

PLCH1基因在ESCC中的作用機(jī)制有望揭示ESCC相關(guān)新的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，可能為ESCC乃至鱗狀細(xì)胞癌的科學(xué)研究提供新的思路。本研究為癌癥診斷、預(yù)后以及選擇有效的藥物靶點(diǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。