實時熒光PCR 法鑒別莜面中摻雜淀粉的植物源性

陳佳琛，陳 晨，張 瑞，彭瑛琪，賀麗霞，狄 慧*

（1.張家口市食品藥品檢驗中心，河北張家口 075000；2.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北石家莊 050071）

裸燕麥（Avena nudaL.）亦稱莜麥，禾本科燕麥屬一年生草本植物[1]，種植于華北和西北等半干旱地區(qū)，是北方高寒地區(qū)的主要糧食作物[2]。莜麥成熟后稃革會與里邊的種子分離，種子磨成面粉即為莜面[3]。

莜面營養(yǎng)價值很高，含18 種氨基酸，且比例均衡[4]。莜面富含木質素、纖維素、半纖維素和β-葡聚糖等膳食纖維，其中約三分之一為水溶性膳食纖維，具有良好的保健功效[5]。此外，莜面中還含有豐富的鈣、鋅、硒等礦物質和微量元素[6]。

隨著人們對莜面營養(yǎng)價值，特別是保健功能認識的提高，莜面加工及餐飲產業(yè)實現(xiàn)了快速發(fā)展，涌現(xiàn)出如“西貝莜面”“綠壩”“谷麥郎”“北燕”等諸多知名餐飲及特色農產品品牌。優(yōu)質的莜面口感純香，深受人們喜歡，優(yōu)質莜面的市場需求呈不斷增長趨勢。但由于莜麥種植的產業(yè)化程度不高，加之生長環(huán)境條件有限，優(yōu)質莜面產量增長緩慢。受利益驅使，不良商家往往在劣質莜面中摻入其他植物源性淀粉如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉等來改變劣質莜面的口感，達到以次充好、以高品質售賣的目的[7]。

實時熒光PCR 法靈敏度高，特異性強，同時植物基因組DNA 有很好的穩(wěn)定性和種屬特異性，少量DNA 經PCR 擴增分析就可檢測其植物源性[8]?；诜N屬特異性基因組DNA 的實時熒光PCR 法，是食品植物源性鑒別的重要技術方法，如瑪咖[9]、櫻桃[10]等植物源性可以通過分子生物學方法對其進行鑒別。

基于此，利用紅薯、馬鈴薯、玉米、木薯來源的食用淀粉和莜面在種屬基因組DNA 間的特異性差異，建立實時熒光PCR 檢測方法，對莜面摻雜植物源性淀粉的情況進行有效鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1）原料。莜麥、小麥、蕎麥、玉米、薏仁米、小米、高粱、馬鈴薯、木薯、紅薯10 種原料及20 種市售莜面，均購自超市。

（2）絕對靈敏度分析樣品。對莜麥、紅薯、玉米、馬鈴薯、木薯原料分別提取DNA，用于絕對靈敏度分析。

（3）相對靈敏度分析樣品。莜面中分別摻入自制紅薯、玉米、馬鈴薯、木薯淀粉制成不同質量分數(shù)比例的摻假模型并提取DNA，用于相對靈敏度分析。

（4）自制淀粉過程。馬鈴薯切塊打漿，漿液與渣一起倒入紗布袋中，水洗后收集濾液。邊倒?jié){液邊水洗，至渣中漿液洗凈。濾液冷藏靜置，每日攪動2 ～3 次。待沉淀，將上清液及殘渣棄去，取中間粉漿加水，沉淀后棄去清液。反復多次，沉淀晾干后得到粗制馬鈴薯淀粉。同法制得木薯淀粉、紅薯淀粉、玉米淀粉[11]。

（5）材料。DNA 提取試劑盒（貨號：DP302），天根生化科技有限公司；Real Time PCR Mix（Taqman）試劑盒，北京美正生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BioSpectrometer basic 核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf 公司）；Fresco 21 冷凍高速離心機（美國Thermo 公司）；QuantStudio 7 Flex 實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo 公司）。

1.3 引物及探針

真核生物、莜麥引物探針出自文獻，馬鈴薯、玉米、紅薯、木薯特異性引物探針來自自行設計。所用引物探針均由上海生工合成（見表1）。

1.4 試驗方法

1.4.1 基因組DNA 提取及有效性判定

采用深加工食品DNA 提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行提取。提取完成后，使用蛋白核酸測定儀檢測DNA 溶液的濃度及純度來判定DNA 提取效果。PCR 反應中，通過18S rRNA 真核生物內參基因的是否擴增來判定提取的植物組DNA 溶液的PCR擴增有效性，防止假陰性結果。

1.4.2 DNA 濃度和純度測定

使用蛋白核酸測定儀檢測DNA 溶液濃度及純度，DNA 溶液濃度在5 ng·μL-1以上，A260／A280為1.7 ～1.9。

1.4.3 實時熒光PCR 擴增及有效性判定

體 系：預 混 合 液12.5 μL；探 針（10 μmol·L-1）1 μL；上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL；DNA 模板5 μL，無菌水補至總體系25 μL。

條件：預變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃60 s，40 個循環(huán)。

試驗對照：用含目標成分的樣品提取的DNA為陽性對照，以不含目標成分的樣品DNA 為陰性對照，以無菌水為空白對照。樣品、陽性對照、陰性對照和空白對照設置兩個平行的反應體系，分別進行靶基因和內參基因擴增，以Ct 平均值為最終結果。

依據(jù)實時熒光PCR 原理及相關食品檢測國標，設定判定原則：空白及陰性對照應Ct 值≥40.0，無典型擴增曲線；內參對照Ct 值＜30.0，有典型擴增曲線；當Ct 值≤35.0，有典型擴增曲線時，判定為檢出；當Ct 值＞35.0，無典型擴增曲線時，判定為未檢出。

1.4.4 引物特異性

真核生物18S rRNA 引物探針對所有原料DNA按1.4.3 進行擴增，以確定DNA 提取質量，防止假陰性結果。

利用莜麥、紅薯、玉米、馬鈴薯、木薯引物探針，對10 種原料按1.4.3 方法分別進行擴增，來測試引物探針的特異性。

1.4.5 靈敏度

（1）絕對靈敏度。用無菌水10 倍梯度稀釋莜面、紅薯、玉米、馬鈴薯、木薯的DNA（10.00 ng·μL-1、1.00 ng·μL-1、0.10 ng·μL-1、0.01 ng·μL-1），按1.4.3節(jié)方法分別進行擴增。

（2）相對靈敏度。莜面中分別摻入自制紅薯、玉米、馬鈴薯、木薯淀粉，制成質量分數(shù)為50.0%、10.0%、5.0%、1.0%、0.1%的摻假模型，按1.4.1 提取DNA，按1.4.3 節(jié)分別擴增。

1.4.6 市售樣品檢測

利用建立的實時熒光PCR 方法對20 份市售莜面進行檢測，鑒別其是否摻雜其他食用植物淀粉。

2 結果與分析

2.1 特異性結果分析

18S rRNA 引物探針擴增原料DNA（圖1），均產生顯著的熒光擴增曲線，Ct 值在18.5 ～22.5，空白對照Ct 值為40.0，說明從原料中均能提取到適用于擴增反應的DNA。

圖1 特異性試驗結果

所有原料DNA 分別經莜麥等5 種引物探針擴增（圖1），反應體系中靶標成分莜麥、紅薯、玉米、馬鈴薯、木薯分別產生顯著的熒光擴增曲線，Ct 值均在20.0 ～23.0，而非靶標成分及空白對照Ct 值均為40.0，說明5 種引物探針均有良好的物種特異性。

2.2 靈敏度結果

2.2.1 絕對靈敏度

實時熒光PCR 擴增結果如圖2，DNA 質量濃度為0.01 ng·μL-1及以上時，呈現(xiàn)顯著擴增曲線，說明絕對靈敏度可達0.01 ng·μL-1。

2.2.2 相對靈敏度

實時熒光PCR 擴增結果如圖3，摻入淀粉的質量分數(shù)為0.1%及以上時，呈現(xiàn)顯著擴增曲線，說明相對靈敏度可達0.1%。

圖3 實時熒光PCR 相對靈敏度

2.3 市售樣品檢測

利用建立的實時熒光PCR 方法對20 份市售莜面進行檢測，結果未發(fā)現(xiàn)莜面中摻雜食用淀粉情況。今后可重點關注小作坊、小攤販、小餐飲以及農貿市場等環(huán)節(jié)的莜面摻雜情況。

3 結論

本研究采用實時熒光PCR 法，通過對莜麥、紅薯、玉米、馬鈴薯、木薯種屬基因組DNA 的特異性擴增，建立了莜面中摻雜植物源性淀粉的檢測方法。該檢測方法具有良好的特異性和靈敏度，條件穩(wěn)定，可檢測市售莜面摻雜食用淀粉的情況。