瀕危植物粗莖紫金牛莖段愈傷組織再生體系的建立

周艷 李冬梅 吳坤林 寧祖林

關(guān)鍵詞：瀕危植物；粗莖紫金牛；愈傷組織；再生體系

粗莖紫金牛（ArdisiagigantifoliaStapf）為報(bào)春花科（Primulaceae）紫金牛屬常綠灌木，高50～70cm，株型緊湊優(yōu)美，莖粗壯不分枝，葉通常聚生于莖頂端，葉片肥大似扇子，上面深綠色，背面紫紅色，花紫紅色或淡粉色，花量大而密集，花期長(zhǎng)，果熟時(shí)鮮紅或紫粉色，耐蔭性強(qiáng)，觀賞價(jià)值高，可作為室內(nèi)盆花或園林花境素材，極具市場(chǎng)開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[1]。粗莖紫金牛自然分布范圍狹窄，僅分布于我國(guó)云南河口，生于海拔100～400m的溝谷常綠闊葉林下[2]，筆者在野外調(diào)查過(guò)程中僅在河口南溪鎮(zhèn)和古林箐鎮(zhèn)兩地溝谷林下發(fā)現(xiàn)個(gè)體數(shù)量極少的野生居群。因粗莖紫金牛野生資源稀少，被列為《中國(guó)生物多樣性紅色名錄-高等植物卷》極危（CR）物種[3]，具有重要的保護(hù)價(jià)值和研究意義。

遷地保護(hù)于華南植物園的粗莖紫金牛生長(zhǎng)良好，每年開(kāi)花，但難以結(jié)實(shí)，存在繁殖障礙問(wèn)題。劉華等[4]已申報(bào)了粗莖紫金牛扦插、壓條繁殖專(zhuān)利技術(shù)，但受季節(jié)和繁殖材料的限制，繁殖效率不高。李冬梅等[5]申報(bào)了利用粗莖紫金牛嫩葉為外植體的組織培養(yǎng)專(zhuān)利技術(shù)，公開(kāi)了其繼代增殖系數(shù)最高為4.0。孫英坤等[6]研究認(rèn)為T(mén)DZ能有效促進(jìn)堇葉紫金牛（A.violacea）不定芽分化。符運(yùn)柳等[7]對(duì)走馬胎（A.kteniophylla）離體培養(yǎng)及植株再生生根壯苗階段添加了10%的CW，但未起到壯苗增高效果。迄今為止，紫金牛屬植物組培快繁技術(shù)研究主要以莖段和嫩葉為外植體，研究集中在外植體的消毒方式、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)腋芽誘導(dǎo)、增殖與生根的影響、不同基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響[8-10]等方面。目前尚無(wú)粗莖紫金牛愈傷組織再生體系建立方面的研究。鑒于此，本研究利用粗莖紫金牛莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織再生體系的建立，探究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和有機(jī)物對(duì)其組織培養(yǎng)的影響，以期建立高效的粗莖紫金牛離體再生體系，為該物種的保育和種苗的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為粗莖紫金牛（A.gigantifoliaStapf）無(wú)菌苗，保存于華南植物園瀕危植物繁育中心。

1.2方法

1.2.1TDZ和NAA對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響將粗莖紫金牛無(wú)菌苗切成長(zhǎng)約2.0cm帶1個(gè)莖節(jié)的切段，接種到培養(yǎng)基WPM+NAA0.10mg/L+TDZ（0.10、0.25、0.50、0.80、1.00、1.50mg/L）進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照，每個(gè)濃度梯度處理10瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后觀察記錄各處理培養(yǎng)結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)其愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽誘導(dǎo)率和莖段存活率。

愈傷組織誘導(dǎo)率＝產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

不定芽誘導(dǎo)率＝產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

莖段存活率=外植體成活數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

1.2.2TDZ對(duì)愈傷組織增殖的影響將誘導(dǎo)獲得的愈傷組織分切成重約0.10g的團(tuán)粒，接種到培養(yǎng)基WPM+TDZ（0.30、0.50、0.80、1.00mg/L）進(jìn)行愈傷組織的增殖培養(yǎng)，以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照，每個(gè)濃度梯度處理10瓶，每瓶接種2團(tuán)，重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織存活率和愈傷組織增殖系數(shù)。

愈傷組織存活率=成活的愈傷組織團(tuán)粒數(shù)/接種愈傷組織粒總數(shù)×100%

愈傷組織增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)后愈傷組織鮮重/接種愈傷組織鮮重

1.2.36-BA和NAA對(duì)愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的影響將增殖培養(yǎng)的愈傷組織分切成重約0.10g的團(tuán)粒，接種到培養(yǎng)基WPM+0.20mg/LNAA+6-BA（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/L）進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照，每個(gè)濃度梯度處理10瓶，每瓶接種2團(tuán)，重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率。

不定芽誘導(dǎo)率＝產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

1.2.46-BA對(duì)不定芽增殖的影響將誘導(dǎo)出的叢生芽分切，以雙芽為單位接種到培養(yǎng)基WPM+6-BA（2.00、4.00、6.00、8.00mg/L）上進(jìn)行不定芽的增殖培養(yǎng)，以不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種2個(gè)單位，重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)不定芽增殖系數(shù)。

不定芽增殖系數(shù)=新增不定芽數(shù)/接種不定芽數(shù)

1.2.5NAA和CW對(duì)生根壯苗的影響將生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的高2～3cm不定芽接種至WPM+NAA0.20mg/L+CW（5%、10%、15%、20%、25%體積分?jǐn)?shù)）的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根壯苗實(shí)驗(yàn)，以不添加CW為對(duì)照，每個(gè)濃度梯度處理10瓶，每瓶接種2個(gè)不定芽，重復(fù)3次。培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)生根率、株高、根數(shù)、根長(zhǎng)、鮮重增量。

生根率＝生根不定芽數(shù)/接種的不定芽總數(shù)×100%

鮮重增量（g）=培養(yǎng)后組培苗的鮮重-初始不定芽的鮮重

1.2.6移栽基質(zhì)對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響當(dāng)粗莖紫金牛生根瓶苗高度達(dá)4～5cm、葉片數(shù)達(dá)4片時(shí)，于遮光率為60%的溫室中煉苗2～3d，接著開(kāi)蓋煉苗2～3d，將煉苗后的瓶苗取出，小心洗去附著于根部的瓊脂，移栽到準(zhǔn)備好的基質(zhì)穴盤(pán)中，每個(gè)穴孔種植1株。以珍珠巖∶泥炭土按體積比為0∶1、1∶3、1∶6、1∶8和1∶10等5種比例混合基質(zhì)作為移栽基質(zhì)，采用54cm×28cm的32孔育苗篩，用稀釋1000倍的多菌靈溶液浸泡2h后，濾干備用。每種比例混合基質(zhì)處理20株，重復(fù)3次，期間保持濕度90%以上，遮陰度60%左右。60d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

移栽成活率＝成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)×100%

1.3數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析和Duncans多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1TDZ和NAA對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從圖1可看出，莖段外植體在培養(yǎng)基WPM中添加0.10mg/LNAA和不同濃度的TDZ可成功誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽。TDZ與0.10mg/LNAA結(jié)合使用時(shí)，不同濃度的TDZ對(duì)莖段存活、愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用。由表1可知，在不添加任何TDZ和NAA的培養(yǎng)基上，莖段存活率為100.00%，但均無(wú)愈傷組織和不定芽形成。當(dāng)TDZ濃度為0.10～0.50mg/L時(shí)，TDZ對(duì)莖段存活率和愈傷組織誘導(dǎo)的影響差異不顯著，愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率隨TDZ增加而逐漸遞增；TDZ在0.5mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高達(dá)96.67%，且愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好，呈黃綠色或淺綠色（圖1C）。TDZ濃度為0.50～1.50mg/L時(shí)，莖短成活率、愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率隨TDZ濃度增加而逐漸降低，但TDZ濃度在0.50～0.80mg/L范圍內(nèi)，TDZ對(duì)愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率差異不顯著。當(dāng)TDZ濃度為1.50mg/L時(shí)，成活率降至80.00%，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最低值54.17%，不定芽誘導(dǎo)率低至23.33%，此時(shí)愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)差，且呈黃綠色（圖1D）。

2.2TDZ對(duì)愈傷組織增殖的影響

由表2可知，以WPM培養(yǎng)基添加不同濃度TDZ對(duì)愈傷組織增殖具有顯著影響。隨著TDZ濃度增高，愈傷組織存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，TDZ濃度為0.50mg/L時(shí)，存活率達(dá)到最高93.33%。在不添加TDZ的培養(yǎng)基上，愈傷組織鮮重增殖系數(shù)為1.62，愈傷組織呈淺綠色，僅有少數(shù)芽點(diǎn)。當(dāng)添加TDZ濃度為0.30mg/L時(shí)，其增殖系數(shù)下降為0.26，愈傷組織呈淺黃綠色顆粒狀，結(jié)果表現(xiàn)為低濃度TDZ對(duì)愈傷組織鮮重增殖有明顯的抑制作用。當(dāng)TDZ濃度為0.50mg/L，增殖系數(shù)為4.42，達(dá)到最大值，愈傷組織呈淺綠或黃綠色；而TDZ濃度在0.80～1.00mg/L時(shí)增殖系數(shù)從1.26下降至0.31，愈傷組織由黃綠色、顆粒狀逐漸呈現(xiàn)褐黃色，且多數(shù)死亡。綜合分析，WPM+0.50mg/LTDZ為愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.36-BA和NAA對(duì)愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的影響

由表3可知，當(dāng)NAA濃度保持在0.20mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，不定芽的誘導(dǎo)率呈先增加后減少的趨勢(shì)；當(dāng)6-BA濃度低于2.00mg/L時(shí)，每團(tuán)愈傷誘導(dǎo)出的不定芽較少，呈黃綠色或綠色（圖2C）；當(dāng)6-BA濃度為2.00mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為100.00%，每團(tuán)愈傷誘導(dǎo)出大量不定芽，芽體為綠色，生長(zhǎng)狀況較好（圖2A，圖2B）；當(dāng)6-BA濃度高于2.00mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的增加而下降；當(dāng)6-BA濃度為3.00mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率最低為56.67%，芽體為黃綠色至黃色（圖2C）。綜合考慮，WPM+2.00mg/L6-BA+0.20mg/LNAA為粗莖紫金牛愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.46-BA對(duì)不定芽增殖的影響

由表4可知，在WPM培養(yǎng)基上添加不同濃度的6-BA對(duì)不定芽的增殖具有顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用6-BA對(duì)粗莖紫金牛不定芽的增殖有顯著影響，隨著6-BA濃度的增加，不定芽的增殖系數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)6-BA濃度為4.00mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出的不定芽生長(zhǎng)正常，芽體為淺綠色或綠色，小葉狹窄且未展開(kāi)（圖2D），增值系數(shù)達(dá)到最大值為3.90；當(dāng)6-BA濃度高于6.00mg/L時(shí)，增殖系數(shù)顯著下降；當(dāng)6-BA濃度為8.00mg/L時(shí)，增殖系數(shù)降至最低0.97?？梢?jiàn)，WPM+4.00mg/L6-BA為對(duì)不定芽的增殖有較好的促進(jìn)作用，最適濃度因植物種類(lèi)不同有所差異。

2.5NAA和CW對(duì)生根壯苗的影響

將無(wú)根苗轉(zhuǎn)接到WPM+0.20mg/LNAA+CW上進(jìn)行生根壯苗，15d左右開(kāi)始生根，生根率達(dá)100%，CW能誘導(dǎo)根系生長(zhǎng)，但對(duì)株高生長(zhǎng)有抑制作用。由表5可知，NAA濃度固定為0.20mg/L時(shí)，在不添加CW的培養(yǎng)基中，植株平均高度為4.25cm，在培養(yǎng)基中添加不同濃度CW，其平均株高均低于不添加CW的處理，當(dāng)CW濃度在0～10%范圍時(shí)，對(duì)株高的影響差異不顯著，而當(dāng)CW濃度高于10%時(shí)，隨著CW濃度增加，植株平均高度降低，且達(dá)到顯著性差異。

CW濃度在0～10%范圍時(shí)，CW濃度對(duì)植株的根條數(shù)、根長(zhǎng)和鮮重增量的影響均無(wú)顯著差異。當(dāng)CW濃度為10%時(shí)，根長(zhǎng)和鮮重增量達(dá)到最大值，分別為4.36cm和1.48g，生長(zhǎng)狀態(tài)最佳（圖3）。當(dāng)CW濃度高于10%時(shí)，隨著CW濃度的增加，根條數(shù)、根長(zhǎng)和鮮重均逐漸減少，且達(dá)到顯著差異。當(dāng)CW濃度達(dá)到20%以上時(shí)，根部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象（圖3白色箭頭所示）。

2.6移栽基質(zhì)對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

由表6可知，移栽基質(zhì)對(duì)粗莖紫金牛組培苗移栽成活率有明顯差異。在泥炭土基質(zhì)中，培養(yǎng)60d，成活率為82.78%，生長(zhǎng)狀態(tài)較差，植株弱小，葉片質(zhì)地較薄且?。徽渲閹r∶泥炭土以體積比1∶3～1∶10混合范圍時(shí)，培養(yǎng)60d，成活率無(wú)顯著差異，其中珍珠巖∶泥炭土以體積比1∶3混合時(shí)，成活率最高達(dá)96.67%，此時(shí)植株生長(zhǎng)健壯，葉片質(zhì)地較厚，有光澤且葉片較大（圖4）。

3討論

植物組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)是植物資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用的一種有效手段，可在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗[11]。彭光天[12]對(duì)9種紫金牛屬（Ardisia）植物進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同外植體誘導(dǎo)愈傷的能力存在差異，在MS+1.0mg/LNAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)5種紫金牛幼苗生根的效果不太理想，其中百兩金（A.crispa）、虎舌紅（A.mamillata）、紫金牛（A.japonica）的莖段愈傷組織分化僅形成一些不定根，血黨（A.punctata）和蓮座紫金牛（A.primulifolia）未能形成根。符運(yùn)柳等[7]對(duì)走馬胎（A.kteniophylla）進(jìn)行離體培養(yǎng)及植株再生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MS（改良）+0.50mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+10%CW壯苗培養(yǎng)時(shí)，能夠誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，但不能高頻誘導(dǎo)不定芽增高。在本研究中，通過(guò)在WPM培養(yǎng)基上添加0.20mg/LNAA和CW對(duì)粗莖紫金牛幼苗生根誘導(dǎo)效果良好，生根率達(dá)100%，當(dāng)添加10%CW時(shí)，不定根發(fā)達(dá)，植株生長(zhǎng)健壯。推測(cè)低濃度的NAA可促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)生根，同時(shí)椰汁也促進(jìn)了愈傷組織誘導(dǎo)生根和根長(zhǎng)生長(zhǎng)，使鮮重增加，植株生長(zhǎng)健壯。

TDZ作為一種新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，已有文獻(xiàn)報(bào)道其不但具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性，能誘導(dǎo)愈傷組織形成不定芽[13-14]，而且具有生長(zhǎng)素的脫分化作用，能有效誘導(dǎo)愈傷組織形成[15]。本研究通過(guò)TDZ和NAA的組合不僅能使粗莖紫金牛莖段誘導(dǎo)出愈傷組織和增殖，同時(shí)產(chǎn)生不定芽，與前人的研究結(jié)果一致[16-17]。TDZ促進(jìn)愈傷組織形成，也促進(jìn)不定芽形成，這可能與TDZ能有效促進(jìn)外植體直接誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生有關(guān)[18-19]。此外，本研究利用TDZ具有細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的雙重作用，對(duì)粗莖紫金牛愈傷組織進(jìn)行增殖且效果良好，這與劉守贊等[10]研究發(fā)現(xiàn)TDZ對(duì)堇葉紫金牛莖段增殖作用效果顯著優(yōu)于6-BA和KT，且當(dāng)TDZ濃度為0.50mg/L時(shí)，增殖倍率最高達(dá)3.14的研究結(jié)果類(lèi)似。

6-BA是常用的細(xì)胞分裂素，促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)和分化。本研究使用6-BA搭配N(xiāo)AA誘導(dǎo)愈傷組織分化不定芽，結(jié)果表明細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值對(duì)粗莖紫金牛愈傷組織不定芽分化具有顯著影響，當(dāng)6-BA/NAA=10時(shí)，不定芽分化率高達(dá)100%；比例大于10時(shí)不定芽分化率卻呈下降趨勢(shì)。符運(yùn)柳等[7]對(duì)紫金牛屬走馬胎進(jìn)行離體培養(yǎng)研究，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，2.00mg/L6-BA+0.10mg/LNAA的組合最利于愈傷組織分化不定芽，分化率為88.9%，而當(dāng)6-BA濃度為3.0mg/L時(shí)，不定芽分化率明顯下降，因此合適的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值對(duì)于紫金牛愈傷組織分化不定芽最重要。

有機(jī)物的添加有利于蘭科植物組培生根壯苗培養(yǎng)[20-21]，但在紫金牛的組織培養(yǎng)中還未見(jiàn)CW對(duì)其生根壯苗培養(yǎng)影響的報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將2～3cm高的粗莖紫金牛無(wú)根苗接種在不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中也能生根，但根量少且纖細(xì)；使用0.20mg/L濃度的NAA能有效促進(jìn)粗莖紫金牛無(wú)根苗生根，平均根條數(shù)為3.37，根長(zhǎng)為3.91cm，單株鮮重為1.41g；將NAA濃度固定為0.20mg/L，當(dāng)添加濃度10%的CW時(shí)，會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)無(wú)根苗的生長(zhǎng)，平均根條數(shù)達(dá)3.80，根長(zhǎng)達(dá)4.36cm，單株鮮重達(dá)1.48g，試管苗生長(zhǎng)狀況較好；但高濃度椰汁會(huì)使根部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，抑制根部生長(zhǎng)，因此低濃度的CW有促進(jìn)粗莖紫金牛生根壯苗作用。