櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)初探

劉義存　黃天啟

摘 要：通過對外界環(huán)境如溫度、光照等條件對愈傷組織誘導(dǎo)的影響研究。結(jié)果：葉片培養(yǎng)在溫度22℃時愈傷組織誘導(dǎo)的效果最好，可達到81.82%；有經(jīng)過10 d黑暗培養(yǎng)處理的葉片，愈傷誘導(dǎo)率整體有明顯提高；在最適溫度和黑暗培養(yǎng)處理下，培養(yǎng)基配方為MS+BA 0.2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1，櫟葉枇杷葉片的愈傷誘導(dǎo)率達到100%。

關(guān)鍵詞：櫟葉枇杷；葉片；愈傷組織；誘導(dǎo)

中圖分類號：S667.3 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131005

枇杷屬植物（EriobotryaLindl.），屬薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae），分布于我國南部或東南亞地區(qū)的亞熱帶常綠樹種，全世界枇杷屬植物約有 30 個種或變種[1]，其中大部分都處于野生狀態(tài)。野生枇杷蘊含豐富的遺傳多樣性，還具有一些可以用于栽培枇杷遺傳改良的重要性狀，如抗病蟲、抗逆、抗倒伏等。野生枇杷與栽培枇杷不存在生殖隔離，容易通過常規(guī)育種或者生物技術(shù)手段將這些優(yōu)良性狀漸滲到栽培枇杷中去，使栽培枇杷不僅可獲得優(yōu)良性狀，同時也拓寬遺傳背景[2，3]。此外，野生枇杷還是優(yōu)良砧木資源。關(guān)于枇杷胚、莖尖、胚乳、原生質(zhì)體的離體培養(yǎng)均有不少研究，但關(guān)于葉片愈傷組織的研究，在栽培枇杷上尚有若干報道[4-7]，在野生枇杷上則鮮有報道。本文對櫟葉枇杷的葉片誘導(dǎo)愈傷做了研究，旨在尋找最佳愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方以及培養(yǎng)條件，為下一步誘導(dǎo)胚、離體保存乃至形成新的植株提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料選取

以櫟葉枇杷（E.prinoidesRehd.andWils）組培苗的葉片為實驗材料。

1.2 處理方法

取組培苗中成熟新鮮的葉片，在超菌工作臺中切成大小約為0.5cm×0.5cm的小塊，并迅速接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中。接種時，葉片背向下，與培養(yǎng)基充分接觸。整個過程控制在10～15 min一組。所有處理暗培養(yǎng)10d后，再轉(zhuǎn)為全光照培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計方式

本試驗每個處理接種20塊葉片，每處理重復(fù)2次；設(shè)置不同的實驗組合，具體實驗方案見文中的結(jié)果與分析。統(tǒng)計時間為接種后第30天；實驗結(jié)果采用SAS11.0處理，部分數(shù)據(jù)采用Duncans新復(fù)極差法。

1.4 培養(yǎng)基配方

培養(yǎng)基主要成分：基本培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，附加3%蔗糖、5g·L-1 的瓊脂粉。

1.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)濕度條件為：65%～70%；24 h全光照或全黑暗處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

為了探究櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適溫度，我們以櫟葉枇杷的葉片為材料，培養(yǎng)基配方為MS+KT 0.2+BA 0.2+NAA 0.5。設(shè)置3個不同溫度，每個處理重復(fù)2次，每個重復(fù)接種20個材料。接種后，全黑暗處理10 d后，統(tǒng)計結(jié)果如表1。

在不同的溫度處理下，櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)率有一定的差別。當處理溫度為18℃和25℃時，葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率都約為50%，沒有什么差別；當處理溫度為22℃時，葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率達到81.82%。說明溫度偏高或偏低都不利于櫟葉枇杷葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，只有22℃時，比較適合葉片愈傷組織的形成。

2.2 黑暗培養(yǎng)對櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

為研究經(jīng)全黑暗培養(yǎng)和沒有經(jīng)黑暗培養(yǎng)的處理條件下對櫟葉枇杷愈傷組織誘導(dǎo)的影響。設(shè)置2組實驗，第1組為材料接種到培養(yǎng)基后，便在每天24h光照下培養(yǎng)30d；第2組為材料接種到培養(yǎng)基后，便每天24h全黑暗下培養(yǎng)10d，再轉(zhuǎn)為每天全光照24h下，再連續(xù)培養(yǎng)20d。以上兩組實驗都設(shè)置如表2的6個不同的配方組合處理。培養(yǎng)溫度為：22℃。結(jié)果如圖2所示。

由圖1可以看出，除了配方3沒有誘導(dǎo)出愈傷組織外，其他培養(yǎng)基配方均誘導(dǎo)出葉片愈傷組織；有經(jīng)黑暗培養(yǎng)10 d的第1實驗組，除了配方3，其它配方的愈傷誘導(dǎo)率明顯都高于另外一組沒經(jīng)黑暗階段的第2組實驗，在有經(jīng)過黑暗處理的配方上，平均愈傷組織誘導(dǎo)率為57.8%，而實驗組2的平均愈傷誘導(dǎo)率為40%；尤其黑暗處下的MS+KT 0.2 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1配方，誘導(dǎo)率可以達到100%，啟動也相對較快。與此同時，在配方MS+BA 1.0這一組處理中，原本在全光照下無法誘導(dǎo)愈傷組織生長的配方，而經(jīng)黑暗處理后誘導(dǎo)出了愈傷組織，并取得了40%的誘導(dǎo)率。說明黑暗處理對于枇杷愈傷組織的誘導(dǎo)起到了很大的促進作用。

實驗還發(fā)現(xiàn)，在黑暗培養(yǎng)實驗組下的葉片，大部分的處理在接種4d后開始膨大，10d后從葉片邊緣和葉脈處出現(xiàn)愈傷組織，30d 時已長出大量愈傷組織；而沒有經(jīng)黑暗培養(yǎng)實驗組在同樣的時間點確實沒有特別明顯的愈傷組織出現(xiàn)。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由圖1可得，如單獨使用 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率為40%；單獨使用KT處理的誘導(dǎo)率為50%；而單獨使用2，4-D，不添加任何細胞分裂素，愈傷誘導(dǎo)率為只為0%。而在添加低濃度6-BA 0.2 mg·L-1和KT 0.2 mg·L-1的基礎(chǔ)上改變2，4-D的濃度，所有處理都要比較單獨使用一種植物生長調(diào)節(jié)劑的的愈傷誘導(dǎo)率要高。

在添加6-BA、KT與2，4-D不同濃度的組合中，發(fā)現(xiàn)隨著2，4-D濃度的升高，愈傷誘導(dǎo)率出現(xiàn)明顯的下降。當2，4-D濃度為1.0 mg·L-1時，愈傷誘導(dǎo)率為100%；當2，4-D濃度為3.0 mg·L-1時，愈傷誘導(dǎo)率降為96.67%；隨著2，4-D濃度升高到6.0 mg·L-1時，愈傷誘導(dǎo)率已經(jīng)降為60%?？梢?，2，4-D 對于櫟葉枇杷葉片愈傷組織的誘導(dǎo)形成有重要的促進作用，但濃度不宜過高，也不適合單獨使用。實驗表明，櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)最適合的培養(yǎng)基配方為MS+KT 0.2 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1。

3 結(jié)論

環(huán)境的培養(yǎng)因素對櫟葉枇杷葉片愈傷組織的誘導(dǎo)有較大影響。在本文的3個溫度設(shè)置試驗中，數(shù)據(jù)顯示在溫度22℃時，是比較適合葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。另外，單一使用某一種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)所得的效果并不如多種配合使用，尤其是2，4-D，單獨使用幾乎沒有效果，但是配合BA，KT時則大大提高了櫟葉枇杷葉片愈傷誘導(dǎo)率。通過對野生枇杷櫟葉枇杷的葉片愈傷組織誘導(dǎo)實驗，認為在培養(yǎng)溫度22℃下，以MS+BA0.2 mg·L-1+KT0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1作為最適培養(yǎng)基，材料接種后黑暗處理10 d，再轉(zhuǎn)為全光照，是櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)條件。通過本試驗，對野生櫟葉枇杷葉片愈傷組織有了一定的實驗基礎(chǔ)，從而為探索其它野生種枇杷屬植物的葉片愈傷組織誘導(dǎo)研究提供一些理論依據(jù)和實驗借鑒。

參考文獻

[1]林順權(quán)，楊向暉，劉成明，等. 中國枇杷屬植物的自然地理分布[J]. 園藝學(xué)報，2004，31（5）： 101-104.

[2]劉義存，岑偉儀，黃天啟， 等. 枇杷屬植物莖尖離體培養(yǎng)及褐化抑制研究[J]. 果樹學(xué)報， 2014（3）： 011.

[3]楊鳳玲，林順權(quán). 枇杷葉片愈傷組織的誘導(dǎo)與保存[J]. 亞熱帶植物科學(xué)，2005（04）：1-5.

[4]陳紅. 枇杷花藥愈傷組織誘導(dǎo)的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[5]彭曉軍，王永清. 枇杷胚乳愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽發(fā)生的研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002（03）：228-231.

[6]林慶良，林順權(quán)，陳振光. 櫟葉枇杷原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994（01）：26-29.

[7]Wai-Jane Ho，高峰. 枇杷愈傷組織培養(yǎng)物經(jīng)體細胞胚胎發(fā)生再生出植株[J]. 福建果樹，1989（01）：66-67.

作者簡介：劉義存（1979-），男，助理研究員，博士，主要研究方向：園藝植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)；黃天啟（1993-），男，在讀研究生，主要研究方向：果樹生物技術(shù)。