山葵愈傷組織誘導(dǎo)與增殖研究

王躍華　段茂華　任三軍　等

摘要：為了獲得山葵愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的最佳培養(yǎng)條件，選擇山葵真葉片、真葉柄和胚軸為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，配以不同濃度的2，4-D和6-BA植物激素進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，并將誘導(dǎo)的愈傷組織接種于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明：誘導(dǎo)山葵愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方為MS+4 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，培養(yǎng)25 d后真葉片、真葉柄、胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為（100.0±0.00）%、（60.5±3.29）%、（62.5±3.74 ）%；山葵胚軸外植體產(chǎn)生的愈傷組織增殖倍數(shù)最高，培養(yǎng)35 d后的愈傷組織增殖倍數(shù)可達(dá)（2.48±0.93）倍。

關(guān)鍵詞：山葵；愈傷組織；配方；外植體；誘導(dǎo)率；增殖倍數(shù)

中圖分類號(hào)： S567.23+9.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0053-02

收稿日期：2014-03-04

基金項(xiàng)目：四川省廣元市科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2013-25）。

作者簡(jiǎn)介：王躍華（1963—），女，山東青島人，碩士，教授，主要從事藥用植物栽培與生藥學(xué)研究。E-mail：1961689636 @qq.com。山葵（Wasabia japonica）別稱山崳菜，為十字花科山崳菜屬多年生草本半陰生植物，原產(chǎn)中國(guó)和日本，被譽(yù)為“綠色黃金”[1-2]。山葵具有強(qiáng)烈的辛辣味及特殊的芳香，不僅具有很強(qiáng)的殺菌和助消化功能[3]，而且能促進(jìn)淀粉性食物的消化，穩(wěn)定胃腸中的維生素C和消滅消化道中的寄生蟲，具有很好的防病治病作用[4-5]。目前山葵多采用分株繁殖和種子繁殖，分株繁殖存在品種退化、繁殖系數(shù)低和種苗帶菌等問題，極易導(dǎo)致病害大面積發(fā)生[6]。種子繁殖具有速度快、 數(shù)量多和能部分減少病害發(fā)生的特點(diǎn)，但是由于山葵種子屬頑拗性種子，失水過多極易導(dǎo)致種子活力喪失，因此常采用低溫高濕保存；同時(shí)，山葵種子存在休眠，需有效破除休眠才能促使種子盡快萌發(fā)[7-9]。本研究采用植物組培快繁技術(shù)，通過篩選培養(yǎng)基配方和外植體種類，以獲得山葵愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件，為山葵后續(xù)的生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

山葵種子采自四川省廣元市；試驗(yàn)材料山葵植物的真葉片、真葉柄、胚軸外植體均取自山葵種子萌發(fā)所得的幼苗。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體消毒和培養(yǎng)選取山葵種子萌發(fā)25 d的幼苗，取其真葉片、真葉柄和胚軸外植體，將其放在超凈工作臺(tái)上用濃度為0.1 g/L的氯化汞消毒處理3 min后，用無菌水清洗5次，再用無菌濾紙吸干材料表面的水分，將其接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.2.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，激素6-BA 的濃度均為0.5 mg/L，2，4-D 的濃度設(shè)定為0、2、4、6、8 mg/L，分別記作A1、A2、A3、A4、A5處理；在20 ℃、12 h/d的光照時(shí)長(zhǎng)、2 000 lx的光照強(qiáng)度條件下培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)各外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織增殖選取由山葵真葉片、真葉柄、胚軸外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織，接種于MS+2 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，分別記作B1、B2、B3處理，在20 ℃、10 h/d光照時(shí)長(zhǎng)、1 800 lx的光照強(qiáng)度條件下增殖培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計(jì)其愈傷組織的增殖倍數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及計(jì)算公式

上述試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，并采用新復(fù)極差（Duncans）法進(jìn)行多重比較，P<0.05 為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果以“x±s”表示。愈傷組織的誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)的計(jì)算公式如下：愈傷組織誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%；愈傷組織的增殖倍數(shù) = 收獲時(shí)質(zhì)量/接種時(shí)質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1山葵不同部位外植體的愈傷組織誘導(dǎo)

由表1可知，隨著2，4-D濃度增高，山葵真葉片、真葉柄、胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率均呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì)；其中未添加2，4-D激素的A1處理，即培養(yǎng)基配方為MS+0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，均不適宜山葵各外植體的愈傷組織誘導(dǎo)，3 種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率均為最低，真葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率為（37.5±2.73）%，真葉柄為（0.0±000）%，胚軸為（0.0±0.00）%。由此說明，在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素2，4-D對(duì)山葵愈傷組織的誘導(dǎo)非常重要。培養(yǎng)基配方為MS+4 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA的A3處理，最適宜3種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷組織的誘導(dǎo)率均為最高，真葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率為（100±0.00）%，真葉柄為（60.5±3.29）%，胚軸為（62.5±3.74）%。然而，隨著2，4-D濃度進(jìn)一步升高到6 mg/L 以上時(shí)，山葵各外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，以2，4-D濃度升高到8 mg/L 時(shí)的各外植體愈傷組織誘導(dǎo)率下降最為顯著，其中真葉柄外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率降低了35.5百分點(diǎn)，表明針對(duì)不同的植物，選擇適宜的2，4-D濃度顯得尤為重要。表1山葵不同部位外植體的愈傷組織誘導(dǎo)

處理編號(hào)激素濃度配比（mg/L）愈傷組織誘導(dǎo)率（%）2，4-D6-BA胚軸真葉片真葉柄A100.50.0±0.0037.5±2.730.0±0.00A220.525.0±2.3487.5±2.1612.5 ±1.78A340.562.5±3.74100.0±0.0060.5±3.29A460.550.2±1.5787.5±1.7537.5 ±2.13A580.537.5±1.6362.5±1.2625.0±1.46

在試驗(yàn)中觀察各外植體產(chǎn)生愈傷組織的情況，發(fā)現(xiàn)真葉片外植體在接種3 d后葉片開始卷曲，并且真葉片切口處開始變?yōu)槟劬G色且增厚，隨后在切口和葉脈處都開始產(chǎn)生黃綠色的愈傷組織；試驗(yàn)中無論是將真葉片正接或反接到培養(yǎng)基上，愈傷組織最先在葉片的切口和與培養(yǎng)基接觸的一面長(zhǎng)出淺綠色顆粒狀愈傷組織，而葉片的游離面產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間較晚，并且產(chǎn)生的愈傷組織顏色也多為綠色。真葉柄外植體在插入培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后，其游離端出現(xiàn)膨大，隨后膨大明顯并脹裂表皮，接著從表皮的內(nèi)層細(xì)胞長(zhǎng)出淺黃色愈傷組織；而將真葉柄直接平放在培養(yǎng)基上的處理，其真葉柄是從中間開始產(chǎn)生膨大，最后整個(gè)葉柄膨大后也發(fā)生脹裂表皮的情況，隨后也從表皮里面產(chǎn)生出愈傷組織。胚軸外植體正接和反接的情況一樣，均是先從培養(yǎng)基上部的游離端長(zhǎng)出黃綠色和淺黃色顆粒狀愈傷組織；而直接將胚軸平接于培養(yǎng)基中則是從胚軸兩端長(zhǎng)出黃綠色愈傷組織，隨后整個(gè)胚軸愈傷化，長(zhǎng)出愈傷組織。