PCR 技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用

徐知明

（深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳 518102）

與其他食品微生物檢測領(lǐng)域所應(yīng)用的檢測技術(shù)相比，基于PCR 的檢測技術(shù)具有較高的精確度與可靠性，有利于食品微生物檢測工作的開展。PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用能更加快速且真實地了解食品中的致病菌情況，評估病原微生物類型，為后續(xù)相關(guān)工作的開展奠定基礎(chǔ)[1]。更為關(guān)鍵的是，通過對PCR 技術(shù)的合理應(yīng)用，能夠準(zhǔn)確推斷食品在生產(chǎn)后階段內(nèi)微生物的繁殖量以及繁殖速度，從而使食品安全檢查工作的開展更具預(yù)見性與針對性[2]。以下就PCR 技術(shù)在食品微生物檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行分析。

1 PCR 技術(shù)

PCR 技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測過程中，通過高溫變性 低溫退火 中溫延伸的方式，完成對食品樣本微生物核酸序列的檢測，并進(jìn)行核酸擴增反應(yīng)。對于被檢測食品樣品而言微生物處于雙鏈狀態(tài)的DNA 序列于94.0 左右的高溫狀態(tài)下進(jìn)行變性反應(yīng)，并以雙鏈的方式存在，在高溫變性基礎(chǔ)之上，55.0 左右時特異性引物與模板DNA 單鏈互補序列配對結(jié)合；72.0 左右，以被檢測食品樣品微生物引物的引導(dǎo)延伸為基礎(chǔ)進(jìn)行復(fù)制處理，并實現(xiàn)對微生物DNA 序列的檢測。在PCR 檢測過程中，上述反應(yīng)反復(fù)發(fā)生，最終獲取充足的被檢樣品中微生物DNA 序列，從而得出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

目前，PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用以熒光定量PCR 技術(shù)為主，該技術(shù)在檢測過程中通過對微生物基因的標(biāo)記來分析DNA 數(shù)量。為確保熒光定量PCR 技術(shù)在微生物檢測領(lǐng)域得到可靠應(yīng)用，就需要高度重視受體發(fā)色團偶極-負(fù)極間的相互關(guān)系，并通過能量轉(zhuǎn)移的方式，使供體發(fā)色基因-受體發(fā)色基因在熒光表現(xiàn)上呈現(xiàn)出較強的差異，在此基礎(chǔ)上使DNA 產(chǎn)生數(shù)量與熒光強度呈正相關(guān)。具體操作中，檢測人員需要對靶序列初始濃度進(jìn)行準(zhǔn)確記錄，根據(jù)參與反應(yīng)熒光濃度的實測值得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)論。相關(guān)報道中指出，PCR 熒光定量技術(shù)能夠準(zhǔn)確反映出待測食品樣品中所含微生物，同時掌握基因標(biāo)記與基因復(fù)制的相關(guān)內(nèi)容。這樣一來，即便食品樣品中所含微生物數(shù)量有限，仍然可以通過對初始濃度進(jìn)行標(biāo)記與記錄的方式獲取可靠的檢測結(jié)果。且相較于其他檢測技術(shù)，基于熒光定量的PCR 技術(shù)在具體實施中有較高的自動化水平，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高，整個操作過程簡單可控，對我國當(dāng)前的食品環(huán)境市場而言有較高的適用性。

2 基于PCR 技術(shù)的食品微生物檢測方法

PCR 技術(shù)在食品微生物檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用相當(dāng)普遍，PCR 技術(shù)的合理應(yīng)用為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及綠膿桿菌等食品領(lǐng)域常見微生物檢測提供了可能性[3]。以金黃色葡萄球菌為例，該菌種在新鮮蔬果中的繁殖速度非?？?，尤其是對于存放有一定時間的蔬果，表面金黃色葡萄球菌的繁殖速度極快，其代謝產(chǎn)物腸毒素會對人體產(chǎn)生非常大的影響，甚至可能導(dǎo)致食物中毒事件的發(fā)生。因此，在食品微生物檢測中必須高度重視對該指標(biāo)的檢測，科學(xué)確定該菌種以及類似菌種的分布情況，最大限度排除其對人體安全所產(chǎn)生的不利影響。而在這一背景下， PCR 技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對被測食品樣品中微生物的可靠檢測，保障檢測精度符合要求。食品生產(chǎn)企業(yè)可以嘗試將基于PCR 技術(shù)的微生物檢測引入產(chǎn)品出廠檢驗環(huán)節(jié)，避免不合格食品流入市場。所涉及的微生物檢測方法有以下幾種類型。

2.1 普通PCR 檢測方法

普通PCR 檢測法是食品微生物檢測中應(yīng)用最為廣泛的檢測方案。檢測期間，將一定比例聚合酶添加至混合物中，可形成檢測所需的基礎(chǔ)樣本。后續(xù)檢測期間，還應(yīng)當(dāng)對反應(yīng)條件以及環(huán)境溫度進(jìn)行預(yù)設(shè)，并展開針對基礎(chǔ)樣本的處理反應(yīng)。在溫度可控的條件下，混合物由于添加有一定比例的聚合酶，容易導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生擴增反應(yīng)[4]?；A(chǔ)樣本檢測期間高溫變性是指在加熱條件下，經(jīng)過一段時間模板DNA解離成為易與引物結(jié)合的單鏈；低溫退火為DNA 片段成單鏈后降溫，引物與模板DNA 單鏈的互補序列配對結(jié)合；延伸為DNA 模板-引物結(jié)合物在經(jīng)聚合酶的作用，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，復(fù)制DNA。上述3 個過程可不斷重復(fù)，得到更多的半保留復(fù)制鏈，為下次復(fù)制過程提供模板。上述循環(huán)過程反應(yīng)迅速，2 ～3 h 可得到幾百萬條DNA，以滿足食品檢測需求。

2.2 多重PCR 檢測方法

多重PCR 檢測技術(shù)是以常規(guī)PCR 檢測方法為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)與優(yōu)化所得。常規(guī)PCR 檢測方法從本質(zhì)上來說是基于單引物的檢測，而多重PCR 檢測技術(shù)則實現(xiàn)了對多個DNA 引物的檢測。對于相同的PCR 反應(yīng)體系，通過投加≥2 個反應(yīng)引物的方式，受聚合酶影響產(chǎn)生擴增與復(fù)制。需要注意的是，本方法用于微生物檢測時，反應(yīng)前投加2 個或2 個以上DNA 引物，因而在聚合酶作用下能夠生成多個相對應(yīng)的DNA 反應(yīng)片段，在應(yīng)用于食品微生物檢測中時，能夠就微生物的致病因子展開系統(tǒng)分析[5]，這對于微生物檢測結(jié)果準(zhǔn)確率的提升是非常關(guān)鍵的。且本方法實施過程中所分析致病因子明顯較傳統(tǒng)方法更多，檢測效率較高。目前，多重PCR 檢測技術(shù)能夠縮短檢測時間、減少檢測內(nèi)容遺漏風(fēng)險，促進(jìn)檢測結(jié)果準(zhǔn)確率的提升，且對樣本投入量有一定的控制效果，可通過多基因檢測的方式獲得較高的經(jīng)濟效益。

2.3 定量PCR 檢測方法

定量PCR 檢測技術(shù)是在常規(guī)PCR 檢測方法的基礎(chǔ)上變形得到，操作原理及步驟上與傳統(tǒng)PCR 方法存在一定差異，但將其應(yīng)用于食品微生物檢測中時能夠表現(xiàn)出突出的優(yōu)勢。應(yīng)用本方法檢測食品樣本中微生物的基本原理是對細(xì)胞組織中總DNA進(jìn)行提取，將mRNA 作為檢測模板，選擇隨機引物并通過逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的方式轉(zhuǎn)錄形成cDNA。在此基礎(chǔ)上，形成cDNA 模板并對其進(jìn)行擴增處理，以此種方式獲得檢測基因及其表達(dá)。相較于傳統(tǒng)的PCR 檢測技術(shù)，定量PCR 檢測技術(shù)嘗試將待檢測食品樣本目標(biāo)中的一條RNA 先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄處理，得到互補DNA，使后續(xù)的擴增以及復(fù)制處理具有針對性。為確保檢測結(jié)果的可靠性，在本檢測方法實施期間必須注意確保參與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的DNA 模板的完整性，且剔除其他蛋白質(zhì)或雜質(zhì)的影響，保障基因鏈的完整性。本檢測方法可以嘗試與數(shù)字技術(shù)以及熒光技術(shù)相結(jié)合，提高檢測過程的靈敏度，以便獲取更高精準(zhǔn)度的檢測結(jié)果。

3 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

近年來，PCR 技術(shù)已經(jīng)在食品微生物檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在食品致病菌、乳酸菌以及水源細(xì)菌的檢測等環(huán)節(jié)中發(fā)揮出了一定的優(yōu)勢。

3.1 食品致病菌檢測

以往針對食品致病菌展開的檢測手段存在一系列問題，檢測過程耗時長且操作步驟煩瑣，難以保障檢測工作的開展效率。且為得到可靠的檢測結(jié)果，常需要對被檢測微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)處理，確保食品檢測樣品中微生物數(shù)量達(dá)到可供檢測水平后方可進(jìn)行樣品微生物分離處理，進(jìn)而對微生物具體形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。由此可見，傳統(tǒng)檢測方法不但需要人工進(jìn)行微生物培養(yǎng)，且培養(yǎng)期間不確定因素較多，導(dǎo)致微生物檢測難度較大。而PCR 技術(shù)的應(yīng)用能夠突破傳統(tǒng)檢測技術(shù)存在的諸多限制，通過對細(xì)菌編碼rRNA 進(jìn)行擴增以及賦值處理的方式，獲取微生物致病菌檢測所需的DNA 片段，并能全面了解致病菌的存在情況。除此以外，基于PCR 技術(shù)的應(yīng)用還能夠?qū)﹄y以進(jìn)行人工培養(yǎng)的微生物進(jìn)行擴增處理，獲取準(zhǔn)確的DNA 片段，從而得到可靠的檢測結(jié)果。

3.2 水源指示細(xì)菌檢測

水質(zhì)同樣會對人們的身體健康產(chǎn)生影響，食品行業(yè)大量產(chǎn)品對水質(zhì)要求較高，對水源指示細(xì)菌進(jìn)行檢測有重要價值。以往針對水質(zhì)的細(xì)菌檢測以大腸埃希菌為關(guān)鍵指標(biāo)，使用傳統(tǒng)檢測方法需要幾天時間，耗時耗力，且檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性難以保障。若能夠通過利用 -半乳糖苷酶的方式，明確底物并進(jìn)行檢測，則能夠顯著提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與工作效率。但需要注意的是，部分大腸桿菌品系對 -葡萄糖醛酸苷酶的表達(dá)效果較差，難以保障檢測結(jié)果的可靠性。而PCR 技術(shù)可以面向 -半乳糖苷酶以及 -葡萄糖醛酸苷酶基因提供更加可靠與有效的檢測方案，相較于傳統(tǒng)方法具有更強的靈敏度以及特異性，且能夠在檢測過程中進(jìn)行擴增處理，以實現(xiàn)對多種類型大腸桿菌的可靠檢測，同時縮短檢測時間，提高檢測效率。以沙門氏菌為例，其作為寄生在人類以及動物腸道組織中的典型微生物，屬于革蘭氏陰性桿菌，生化反應(yīng)與人體抗原結(jié)構(gòu)存在密切關(guān)系。若不及時發(fā)現(xiàn)水源污染并進(jìn)行針對性處理，可能導(dǎo)致一系列疾病的產(chǎn)生。需要注意的是，沙門氏菌雖然毒性水平偏低，但在菌體裂解反應(yīng)過程中會產(chǎn)生毒性水平較高的內(nèi)毒素，并侵入宿主細(xì)胞，進(jìn)而對人體健康產(chǎn)生影響。目前PCR 技術(shù)的應(yīng)用過程中，有關(guān)沙門氏菌的檢測可以將invA、invb、hila以及16S rRNA 作為主要靶基因。

3.3 乳酸菌檢測

以典型的雙歧桿菌為例，有研究嘗試對雙歧桿菌現(xiàn)有種以及相關(guān)種所對應(yīng)基因序列進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示位于1 412 ～1 432 位的寡核苷酸堿基序列有高度一致性表現(xiàn)，提示其可以作為雙歧桿菌特異性較高的寡核苷酸片段，通過對PCR 技術(shù)的應(yīng)用，可以將其作為引物并對雙歧桿菌16S rRNA 基因片段進(jìn)行擴增處理。在此過程當(dāng)中，模板DNA 通過簡單SDS 裂解細(xì)菌細(xì)胞并經(jīng)蛋白酶對蛋白進(jìn)行去除處理后獲得。在這一背景下，雙歧桿菌能夠基于PCR 技術(shù)進(jìn)行擴增處理的方式產(chǎn)生具有典型特征的1.35 kb核苷酸片段，并以其為基礎(chǔ)展開PCR 檢測，確保檢測結(jié)果的可靠性。

4 結(jié)語

在食品安全領(lǐng)域中，對食品微生物進(jìn)行可靠檢測是非常重要的工作內(nèi)容，在此期間應(yīng)用PCR 技術(shù)的綜合優(yōu)勢非常明顯。在PCR 技術(shù)的應(yīng)用過程中，相關(guān)人員必須形成正確的技術(shù)應(yīng)用認(rèn)知，結(jié)合微生物檢測實際需求制定完善的PCR 技術(shù)方案，并通過有效措施促進(jìn)食品微生物檢測工作質(zhì)量的提高，將PCR 技術(shù)作用充分發(fā)揮出來，根據(jù)微生物檢測結(jié)果及時發(fā)現(xiàn)食品安全問題并積極展開后續(xù)應(yīng)對與處理工作。本文通過分析PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用及相關(guān)原理介紹，希望為食品質(zhì)量安全的保障奠定基礎(chǔ)。