ERK1/2、MEK1/2在盆腔器官脫垂患者子宮骶韌帶組織中的表達(dá)

洪 瑩,李 蕾,劉冬霞,李巖閣,肖婷偉,奈嫚嫚,耿建芳

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院盆底重建科 鄭州 450052

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)主要是由于女性盆底支持結(jié)構(gòu)包括盆底肌群、纖維結(jié)締組織等發(fā)生功能障礙或者結(jié)構(gòu)損傷,致使盆腔器官脫垂于陰道內(nèi)或陰道外。近年來(lái),POP發(fā)病率逐年攀升[1]。有研究[2-3]認(rèn)為,成纖維細(xì)胞損傷導(dǎo)致了膠原代謝異常,使得盆底纖維結(jié)締組織的彈性、可延展性等受損,因而出現(xiàn)了器官移位及功能障礙等問(wèn)題。MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)于成纖維細(xì)胞的功能有重要意義,MEK/ERK信號(hào)通路受到抑制,會(huì)影響成纖維細(xì)胞的增殖與遷移[4]。ERK1/2與MEK1/2是該通路的重要組成成分。近宮頸旁的子宮骶韌帶主要包括平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和其細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)、血管以及淋巴組織等[5]。本研究檢測(cè)了POP患者子宮骶韌帶組織中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2的表達(dá)情況,初步探討MEK/ERK信號(hào)通路在POP發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2021年10月至2022年6月因POP于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院行子宮切除術(shù)或盆底重建術(shù)的患者30例(POP組),POP定量分期(POP quantitation,POP-Q)評(píng)分均為Ⅲ～Ⅳ度;收集同期因非POP的婦科良性腫瘤或?qū)m頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變而行子宮切除術(shù)的33例患者為對(duì)照組,POP-Q評(píng)分均為0～Ⅰ度;兩組臨床資料均完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①子宮內(nèi)膜異位癥。②合并免疫系統(tǒng)疾病或結(jié)締組織病。③近1 a內(nèi)有激素替代治療史。④合并惡性腫瘤。⑤合并大小便失禁。所有患者術(shù)前均簽署知情同意書(shū),本研究通過(guò)該院倫理委員會(huì)審查,(倫)審編號(hào):2022-214-01。

1.2 標(biāo)本選擇及處理取材部位選擇子宮骶韌帶近宮頸0.5～1.0 cm處,取材大小約0.5 cm3,每個(gè)病例共取材兩塊,一塊置于體積分?jǐn)?shù)10%中性固定液中保存,另一塊用生理鹽水沖洗組織表面凝固血液后放入凍存管,盡快置于-80 ℃冰箱保存。取材過(guò)程中注意保護(hù)標(biāo)本,減少對(duì)組織的牽拉、擠壓等,以免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 子宮骶韌帶組織HE及Masson染色將存于固定液中的子宮骶韌帶組織脫水、包埋后,使用切片機(jī)將其制成厚度為4 μm的組織切片并貼片,然后分別進(jìn)行HE及Masson染色。HE染色用于組織學(xué)觀(guān)察,Masson染色用于觀(guān)察膠原纖維沉積情況。

1.4 子宮骶韌帶組織中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2和p-MEK1/2表達(dá)的免疫組化檢測(cè)切片處理同HE染色,貼片后使用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(0.01 mol/L,pH=6.0)進(jìn)行抗原修復(fù),山羊血清工作液封閉非特異性抗體后按照相應(yīng)比例滴加一抗:抗ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2抗體(均1∶50稀釋,華安生物技術(shù)有限公司)和抗p-MEK1/2抗體(1∶50稀釋,北京博奧森技術(shù)有限公司),再加入二抗,DAB顯色。鏡下觀(guān)察,顯色呈黃褐色為陽(yáng)性。使用Image Pro Plus軟件測(cè)定各蛋白染色區(qū)域的平均光密度,計(jì)算p-ERK/ERK和p-MEK/MEK的比值。

1.5 子宮骶韌帶組織中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2和p-MEK1/2表達(dá)的Western blot檢測(cè)取出儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱的子宮骶韌帶組織,提取蛋白后置于SDS-PAGE凝膠中電泳,之后在PVDF膜中轉(zhuǎn)膜并加入一抗:抗ERK1/2抗體(1∶500稀釋,華安生物技術(shù)有限公司)、抗p-ERK1/2和MEK1/2抗體(均1∶1 000稀釋,華安生物技術(shù)有限公司)、抗p-MEK1/2(1∶500稀釋,北京博奧森技術(shù)有限公司)、抗GAPDH抗體(1∶1 000稀釋,賢至生物科技有限公司),再加入二抗孵育,最后曝光顯影。使用Image J 1.52軟件測(cè)量各條帶灰度值,結(jié)果取目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值,并計(jì)算p-ERK/ERK和p-MEK/MEK比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間年齡、BMI,ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2蛋白平均光密度、相對(duì)表達(dá)量,p-ERK/ERK和p-MEK/MEK比值的比較均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);孕次和經(jīng)陰道分娩次數(shù)用中位數(shù)(四分位數(shù))表示,兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較兩組年齡、BMI、孕次、經(jīng)陰道分娩次數(shù)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1。

表1 兩組一般臨床資料比較

2.2 兩組子宮骶韌帶組織HE及Masson染色結(jié)果HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)照組子宮骶韌帶組織鏡下表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞規(guī)律排列,細(xì)胞間均勻分布著細(xì)胞外基質(zhì)(膠原纖維、彈性蛋白等);而POP組子宮骶韌帶組織鏡下表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞排列雜亂,且細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組,細(xì)胞外基質(zhì)(膠原纖維、彈性蛋白等)分布稀疏且著色不均勻。Masson染色結(jié)果見(jiàn)圖2,膠原纖維顯色為藍(lán)色,肌纖維顯色為紅色。對(duì)照組子宮骶韌帶組織染色為致密深藍(lán)色,其間有規(guī)律排列的細(xì)胞;而POP組子宮骶韌帶組織染色明顯淺于對(duì)照組,且有較多空白間隙,少量細(xì)胞交錯(cuò)其中,結(jié)構(gòu)紊亂。

2.3 兩組子宮骶韌帶組織中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2和p-MEK1/2表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3、表2。ERK1/2、p-ERK1/2廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)中,少量存在于細(xì)胞核中;MEK1/2、p-MEK1/2則主要存在于胞質(zhì)中。POP組ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2和p-MEK1/2的表達(dá)均弱于對(duì)照組,且p-ERK/ERK和p-MEK/MEK的比值也均小于對(duì)照組。

A:ERK1/2;B:p-ERK1/2;C:MEK1/2;D:p-MEK1/2;1:對(duì)照組;2:POP組

表2 兩組子宮骶韌帶組織中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2平均光密度及p-ERK/ERK、p-MEK/MEK比值的比較

2.4 兩組子宮骶韌帶組織中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2和p-MEK1/2表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4、表3。POP組ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組,同時(shí)p-ERK/ERK、p-MEK/MEK比值也均小于對(duì)照組。

圖4 兩組子宮骶韌帶組織中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果

表3 兩組子宮骶韌帶組織中ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-ERK/ERK、p-MEK/MEK比值的比較

3 討論

POP是普遍發(fā)生于中老年婦女的臨床疾病,主要表現(xiàn)為膀胱、直腸、子宮及陰道前后壁的膨出以及這些器官因位移受壓而出現(xiàn)的臨床癥狀,如排尿困難或者壓力性尿失禁、子宮脫出陰道后局部皮膚黏膜摩擦而破損、直腸膨出出現(xiàn)排便異常等,使得患者的生活質(zhì)量大幅降低,甚至脫離社會(huì),產(chǎn)生抑郁心理[6-8]。子宮骶韌帶是維持子宮前傾位的重要韌帶,其主要成分除平滑肌細(xì)胞外,還包含大量成纖維細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)如膠原纖維、彈性蛋白等[5,9]。

MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)是人類(lèi)細(xì)胞中將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要途徑,MEK/ERK信號(hào)通路是MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分,有研究[10]發(fā)現(xiàn)該通路參與成纖維細(xì)胞相關(guān)疾病的調(diào)控。皮膚創(chuàng)面愈合與成纖維細(xì)胞密切相關(guān),Li等[11]的研究發(fā)現(xiàn),EPFE65在Scr介導(dǎo)下可激活MEK/ERK信號(hào)通路,促進(jìn)ERK1/2磷酸化,即p-ERK1/2表達(dá)量增加,進(jìn)而誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面愈合。Liu等[4]將丹參素作用于肺成纖維細(xì)胞,p-MEK1/2與p-ERK1/2的表達(dá)減少,由此判斷丹參素通過(guò)抑制MEK/ERK信號(hào)通路來(lái)抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖、遷移與轉(zhuǎn)化,從而改善肺纖維化。

MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)于成纖維細(xì)胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)化有重要作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)POP患者子宮骶韌帶組織中ERK1/2和MEK1/2的表達(dá)均明顯低于非POP患者,同時(shí),還伴隨著纖維結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)改變及膠原纖維分布的減少。在MEK/ERK信號(hào)通路中,p-MEK1/2可使ERK1/2中的Thr/Tyr激活而發(fā)生磷酸化,從而發(fā)揮生物學(xué)功能,MEK1/2則被上游的CRAF磷酸化而完成信息傳遞[10,12]。本研究中POP患者子宮骶韌帶組織中p-ERK1/2和p-MEK1/2的表達(dá)均顯著降低,且p-ERK/ERK、p-MEK/MEK的比值也小于對(duì)照組。Zhao等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)POP患者盆底支持結(jié)構(gòu)中p-ERK1/2表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組。因而, MEK/ERK信號(hào)通路的相關(guān)調(diào)控可能參與POP的發(fā)生發(fā)展。

近年來(lái),有關(guān)POP發(fā)病機(jī)制研究逐年增多,有研究[2]認(rèn)為POP的發(fā)生與MAPK信號(hào)通路相關(guān)。Vetuschi等[14]的研究認(rèn)為,POP患者陰道壁的肌層中ERK1/2、p-ERK1/2均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),而本研究發(fā)現(xiàn)在POP患者子宮骶韌帶組織中,ERK1/2、p-ERK1/2均為低表達(dá)狀態(tài),這可能與取材及檢測(cè)部位不同有關(guān)。盡管現(xiàn)有的研究[12]表明MEK/ERK通路在腫瘤組織中表現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài),但是臨床治療中仍未發(fā)現(xiàn)有效的MEK/ERK信號(hào)通路的靶向阻斷藥,針對(duì)MEK的單藥抑制劑用于靶向阻斷癌癥的治療中并未顯現(xiàn)出優(yōu)于上游靶向阻斷RAS、RAF治療的效果[10],因此,MEK/ERK信號(hào)通路的研究仍可能成為POP發(fā)生發(fā)展的干預(yù)方案。

綜上所述,本研究認(rèn)為ERK1/2與MEK1/2在POP患者子宮骶韌帶組織中表達(dá)減少和激活受抑可能與POP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但由于疾病的復(fù)雜性與標(biāo)本獲取的局限性,MEK/ERK信號(hào)通路中有關(guān)POP發(fā)生的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。