Cu2+、Pb2+對青海湖裸鯉的急性毒性效應(yīng)及相關(guān)基因表達的影響

李梓瑄，金文杰，李長忠

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016)

青海湖是我國內(nèi)陸最大的半咸水湖。其獨特的地理位置和生物多樣性使周邊環(huán)境處于特殊類型的生態(tài)系統(tǒng)中，對青海湖的研究具有重要的生態(tài)保護價值和科學(xué)意義。青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskii)屬鯉科(Cyprinidae)裂腹魚亞科(Schizothoracinae)裸鯉屬(Gymnocypris)，是青海湖中的特有魚種，對青海湖生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)平衡起著至關(guān)重要的作用[1]。

一些重金屬會對魚體產(chǎn)生不良影響，而且作為機體生存必需的微量元素參與多種生理功能，在魚類正常生命活動中發(fā)揮不可或缺的作用。Cu2+可參與造血、黑色素合成、骨骼發(fā)育和機體免疫過程，維持鐵的正常代謝[2]。在毒性作用方面，Cu2+可以催化羥基自由基的形成，使脂肪和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，蛋白鹽溶性降低[3]。而作為機體生命活動的非必需元素，Pb2+在魚體內(nèi)不參與任何生理過程，且會毒害魚體各組織和器官，主要表現(xiàn)在對機體血液、生殖、抗氧化免疫等相關(guān)生理過程造成的不利影響[4]。Pb2+會與血紅蛋白發(fā)生相互作用，通過提高血紅蛋白的自氧化程度，誘導(dǎo)細胞組織氧化損傷的發(fā)生[5]。

在傳統(tǒng)毒理學(xué)中常以半致死濃度(LC50)和致死濃度(LC100)來確定后續(xù)實驗重金屬脅迫濃度，并探究該濃度對于魚類的影響，然而重金屬濃度在達到LC50前，魚體內(nèi)分子伴侶、金屬螯合、免疫應(yīng)答等相關(guān)基因早已被激活；在達到LC50和LC100前，水生生態(tài)系統(tǒng)的安全和水生生物的生長已受到嚴重的影響。在低濃度重金屬(低于各個國家水質(zhì)標準)條件下，魚體內(nèi)相關(guān)基因調(diào)節(jié)機制早已啟動并產(chǎn)生應(yīng)答，低濃度重金屬對魚類影響的研究可以更加真實地反映出水體重金屬污染對魚類的危害。對青海湖底泥沉積物中的重金屬含量及生態(tài)風(fēng)險進行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，砷(As，13.21 mg/kg)和鎘(Cd，0.21 mg/kg)的濃度超出自然本底值1.13倍和1.53倍，存在較高的潛在生態(tài)風(fēng)險，污染程度依次為Cd>Pb>As>Cu>Zn>Ni>Cr。通過對重金屬相關(guān)性進行分析，發(fā)現(xiàn)沉積物中鋅(Zn)、銅(Cu)、鉛(Pb)、鈷(Co)、鎳(Ni)、鎘(Cd)和鉻(Cr)均來自自然源[6]。在遇到水流擾動、水體的pH、電導(dǎo)率、溶解氧等環(huán)境條件發(fā)生變化時，沉積在底泥中的重金屬又會被釋放出來，再次進入水相中，造成二次污染。

因此本研究選擇在青海湖區(qū)域內(nèi)水體、底泥、土壤及動植物體內(nèi)最常見的重金屬Pb和Cu[6-11]，脅迫青海湖裸鯉1齡幼魚。以期通過對青海湖裸鯉關(guān)鍵基因的篩選及其在低濃度重金屬離子脅迫后應(yīng)答反應(yīng)方面的研究，為漁業(yè)水體的安全監(jiān)測提供檢測指標，并為青海湖裸鯉的保護和人工繁育提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

研究中1齡青海湖裸鯉取自青海湖裸鯉救護中心恒溫養(yǎng)殖車間，體長為(12.12±1.34)cm，體重為(17.18±2.23)g。實驗前將青海湖裸鯉暫養(yǎng)于青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院實驗室方形魚缸(1 206 mm×838 mm×910 mm)中。魚缸提前用高錳酸鉀(KMnO4)消毒浸泡2 d，清洗干凈后注入自來水(pH=6.8)曝氣3 d。暫養(yǎng)期間水中的溶解氧為(7.5±0.4)mg/L，溫度為(16.0±0.3)℃，pH為7.0±0.2。暫養(yǎng)期間正常投喂，每2 d換水一次，持續(xù)曝氣，實時監(jiān)測水體中的各項指標。暫養(yǎng)期間未出現(xiàn)死亡，實驗前一天停止投喂及換水。暫養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.2 方法

1.2.1 Cu2+、Pb2+對青海湖裸鯉的急性毒性效應(yīng)

采取靜態(tài)暴露方式進行實驗[12]，實驗周期為96 h。根據(jù)國家漁業(yè)水質(zhì)標準(GB 11607-89)中規(guī)定Cu2+≤ 0.01 mg/L、Pb2+≤ 0.05 mg/L，選取高于標準值10、20、50、100和200倍，Cu2+、Pb2+單一毒性實驗中各設(shè)置5個濃度梯度，Cu2+(0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mg/L)，Pb2+(0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 mg/L)，在各濃度下分別設(shè)置三組平行及一個空白對照組。在方形魚缸中使用CuSO4·5H2O和Pb(NO3)2配置好各濃度的重金屬離子溶液之后，每個缸中放置20尾魚，持續(xù)監(jiān)測水中理化指標。實驗開始，實時記錄24、48和96 h時青海湖裸鯉的生存狀況，并計算各重金屬離子的LC50和安全濃度。

根據(jù)上述單一毒性實驗得到的安全濃度，以一個安全濃度為一個毒性單位，選取毒性比為1∶1，Cu2+與Pb2+安全濃度×1，×2，×3，×4及×5復(fù)合毒性下對青海湖裸鯉進行同上的方法脅迫。得出Cu2++ Pb2+復(fù)合毒性對青海湖裸鯉的影響。

1.2.2 低濃度Pb2+、Cu2+脅迫后青海湖裸鯉免疫相關(guān)基因的表達

實驗開始，將暫養(yǎng)中的魚隨機放置在9個低濃度重金屬脅迫組，分別為Cu2+=0.000 4 mg/L(C1)，Cu2+=0.002 mg/L(C2)，Cu2+=0.01 mg/L(C3)，Pb2+=0.002 mg/L(P1)，Pb2+=0.01 mg/L(P2)，Pb2+=0.05 mg/L(P3)，Cu2++Pb2+=0.000 4 mg/L + 0.002 mg/L(CP1)，Cu2++ Pb2+=0.002 mg/L + 0.01 mg/L(CP2)，Cu2++Pb2+=0.01 mg/L + 0.05 mg/L(CP3)的小型水族箱中，每個處理條件各設(shè)置三組平行，每個缸中15尾魚。在以上條件下脅迫0、6、12、24和48 h后取樣，每個平行取3尾魚。經(jīng)MS-222麻醉后，取鰓、腎臟、肝臟經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存作為后續(xù)免疫相關(guān)基因的測定樣本。

實驗采用總RNA提取試劑盒(DP424，天根)提取1齡青海湖裸鯉各組織的總RNA，PrimeScriptTM Ⅱ1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。對比不同物種各基因的序列，在該基因的保守區(qū)，使用Premier 5.0設(shè)計引物，送由北京擎科生物科技有限公司合成。序列如表1所示。

以β-actin為內(nèi)參，用熒光定量PCR儀(Light Cycler 96 SW1.1，羅氏)測定不同脅迫條件下各基因的相對表達量。使用TB Green?PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒完成qPCR定量實驗。PCR反應(yīng)體系為20 μL，SYBR 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL和ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 Cu2+、Pb2+對青海湖裸鯉的毒性效應(yīng)

使用Excel對數(shù)據(jù)進行計算分析，得出在不同時間(24、48和96 h)下單一與復(fù)合毒性研究中各重金屬離子濃度對數(shù)和青海湖裸鯉死亡率之間的關(guān)系及回歸方程，計算得到各時間點下的LC50及安全濃度。根據(jù)水生毒理復(fù)合效應(yīng)相加指數(shù)法[13]，評估Cu2+和Pb2+的復(fù)合毒性。利用公式(1)求出重金屬離子毒性相加作用(S)：

S=Am/A1+Bm/B1

(1)

式中Am、Bm分別為重金屬離子復(fù)合毒性條件下試驗動物的LC50，A1、B1為單一重金屬離子毒性條件下試驗動物的LC50。

由S求得相加指數(shù)(AI)：

當S>1時，AI=1-S；當S≤1時，AI=1/S-1。

(2)

AI用來判斷重金屬離子復(fù)合毒性作用：當AI>0時，毒性作用為協(xié)同作用；當AI<0時，毒性作用為拮抗作用；當AI=0時，毒性作用為加和作用。

1.3.2 低濃度Pb2+、Cu2+脅迫后青海湖裸鯉免疫相關(guān)基因的表達

2 結(jié)果

2.1 Cu2+、Pb2+對青海湖裸鯉的急性毒性效應(yīng)

2.1.1 Cu2+、Pb2+單一與復(fù)合急性作用下青海湖裸鯉的行為反應(yīng)

各試驗濃度下，Cu2+和Pb2+對青海湖裸鯉的行為產(chǎn)生了較為明顯的影響。與空白對照組相比，青海湖裸鯉游動能力及其他生命體征正常，青海湖裸鯉在重金屬離子脅迫初期變得興奮，在缸中四處游動，約6 h后開始出現(xiàn)異常行為特征。隨著重金屬離子濃度的升高青海湖裸鯉表現(xiàn)的越來越興奮，在1、2 mg/L的Cu2+和5、10 mg/L的Pb2+脅迫下大多青海湖裸鯉會不斷浮頭，試圖跳出水面。隨著毒性作用時間的延長，在0.1、0.2、0.5 mg/L的Cu2+和0.5、1、2.5 mg/L的Pb2+脅迫下青海湖裸鯉逐漸適應(yīng)，不再興奮，而在1、2 mg/L的Cu2+和5、10 mg/L的Pb2+脅迫下仍有少數(shù)青海湖裸鯉試圖躍出水面。大約24 h后在1、2 mg/L的Cu2+和5、10 mg/L的Pb2+脅迫下青海湖裸鯉出現(xiàn)身體失衡，側(cè)游、翻轉(zhuǎn)等情況。未死亡的青海湖裸鯉游動速率明顯變慢，相對靜止，呼吸速率也明顯放緩，體表粘液分泌旺盛，部分青海湖裸鯉失去生命體征后腹部朝上漂浮在水面上。

在復(fù)合毒性實驗中，對青海湖裸鯉產(chǎn)生的毒性作用比單一毒性作用下更強烈。相同時間內(nèi)復(fù)合毒性條件下青海湖裸鯉死亡率大于單一毒性下青海湖裸鯉的死亡率，青海湖裸鯉全數(shù)死亡的時間也比單一毒性作用下的短。

2.1.2 Cu2+、Pb2+單獨作用下對青海湖裸鯉的急性毒性

Cu2+對青海湖裸鯉的急性毒性實驗結(jié)果如表2所示。空白對照組中青海湖裸鯉均未出現(xiàn)死亡。隨著Cu2+濃度及接觸染毒時間的延長，對青海湖裸鯉魚體產(chǎn)生的不良反應(yīng)加劇，出現(xiàn)死亡的時間提早。

表2 Cu2+對青海湖裸鯉毒性作用Tab.2 Toxic effects of Cu2+ on G.przewalskii

Pb2+對青海湖裸鯉的急性毒性實驗結(jié)果如表3所示。

表3 Pb2+對青海湖裸鯉毒性作用Tab.3 Toxic effects of Pb2+ on G.przewalskii

2.1.3 Cu2+、Pb2+復(fù)合作用下對青海湖裸鯉的急性毒性

以上述Cu2+、Pb2+單一存在下的安全濃度為一個毒性單位，在毒性單位1～5倍下，進行Cu2++ Pb2+復(fù)合毒性作用后對青海湖裸鯉的急性毒性實驗結(jié)果如表4所示。

表4 Cu2+ + Pb2+對青海湖裸鯉毒性作用Tab.4 Toxic effects of Cu2+ + Pb2+ on G.przewalskii

由表5可知，Cu2++ Pb2+復(fù)合毒性作用下，各時間下AI均小于0，Cu2++ Pb2+對青海湖裸鯉的毒性作用為拮抗作用。

表5 Cu2+和Pb2+共存對青海湖裸鯉復(fù)合毒性作用結(jié)果Tab.5 Results of the combined toxicity effects of Cu2+ and Pb2+ coexistence on G.przewalskii

2.2 低濃度Pb2+、Cu2+脅迫后青海湖裸鯉免疫相關(guān)基因的表達

如圖1A所示，與空白對照組相比，6 h時，Nrf2相對表達量在濃度CP3脅迫下有最大值，且是空白對照組表達量的3.8倍。Cu2+脅迫下，隨著濃度的升高Nrf2相對表達量呈上調(diào)趨勢，Pb2+及Cu2++ Pb2+脅迫下，隨濃度升高Nrf2表達量均呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的變化趨勢?？傮w上，Cu2++ Pb2+脅迫下Nrf2相對表達量更高；12 h時，在C3脅迫下達到峰值，是空白對照組的3.5倍。48 h時，Cu2+、Pb2+及Cu2++ Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高Nrf2相對表達量下調(diào)?？傮w來看，隨著時間的延長，Nrf2相對表達量在不同重金屬脅迫下呈下調(diào)趨勢。如圖1B所示，與空白對照組相比，在Cu2+、Cu2++ Pb2+脅迫6 h后，隨濃度升高腎臟Nrf2相對表達量呈下調(diào)趨勢；12 h時，Pb2+、Cu2++ Pb2+脅迫下腎臟Nrf2相對表達量均下調(diào)；24 h時，Cu2+、Pb2+及Cu2++ Pb2+脅迫下，腎臟Nrf2相對表達量均下調(diào)；48 h時，Cu2+、Pb2+脅迫下腎臟Nrf2相對表達量均先上調(diào)后下調(diào)，在Cu2++ Pb2+脅迫下腎臟Nrf2相對表達量隨濃度升高呈下調(diào)趨勢。如圖1C所示，與空白對照組相比，6 h時，在Cu2+、Cu2++ Pb2+脅迫下肝臟Nrf2相對表達量，隨著濃度的升高而上調(diào)，在C3脅迫下達到最大值，是空白對照組的1.9倍；12 h時，在Cu2++ Pb2+脅迫下肝臟Nrf2相對表達量隨著濃度的升高而上調(diào)，且在CP3脅迫下有最大值，是空白對照組的1.6倍；24 h時，肝臟Nrf2相對表達量在C2脅迫下達到最大值；48 h時，在各組條件下肝臟Nrf2相對表達量均下調(diào)，在濃度為CP3脅迫下有最小值，是空白對照組的0.4倍。

如圖2A所示，與空白對照組相比，6 h時，鰓Keap1相對表達量在P3脅迫下有最大值，是空白對照組的2.3倍，在不同濃度Cu2+脅迫下，鰓Keap1相對表達量下調(diào)；12 h時，在Cu2+、Pb2+脅迫下鰓Keap1相對表達量均下調(diào)，在Cu2++ Pb2+脅迫下隨濃度升高鰓中的Keap1相對表達量上調(diào)，在CP3脅迫下有最大值，是空白對照組的2.9倍；24 h時，鰓中的Keap1相對表達量幾乎均出現(xiàn)下調(diào)；48 h時，各條件下鰓Keap1相對表達量均差異不顯著。如圖2B所示，與空白對照組相比，6 h時，在Cu2+脅迫下腎臟Keap1相對表達量下調(diào)。在Cu2++ Pb2+脅迫下隨濃度升高腎臟Keap1相對表達量降低；12 h和24 h時，各條件下腎臟Keap1相對表達量均下調(diào)且差異不顯著。如圖2C所示，6 h時，在Cu2+、Pb2+脅迫下，肝臟Keap1相對表達量隨濃度升高而上調(diào)，但均低于空白對照中的表達量；12 h時，肝臟Keap1相對表達量在Cu2+、Pb2+脅迫下隨濃度升高而下調(diào)，在Cu2++ Pb2+脅迫下上調(diào)，在CP3脅迫下達到最大值，是空白對照組的1.9倍；24 h時，在Cu2++ Pb2+脅迫下隨濃度升高肝臟Keap1相對表達量上調(diào)，在CP3復(fù)合條件下達到最大值，是空白對照組的2.9倍；48 h時，在不同條件下Keap1相對表達量無顯著變化。

圖2 低濃度銅鉛脅迫下對1齡青海湖裸鯉鰓(A)、腎臟(B)和肝臟(C)中Keap1 mRNA相對表達量的影響Fig.2 he effect of low concentration of copper and lead stress on the expression of Keap1 mRNAin gill(A)，kidney(B)and liver(C)of 1 aged G.przewalskii

如圖3A所示，與空白對照組相比，6 h時，在Cu2+、Pb2+及Cu2++ Pb2+脅迫下鰓MT相對表達量均下調(diào)；12 h時，在CP2脅迫下其表達量達到最大值，是空白對照組的1.6倍，其余各濃度下鰓MT相對表達量均下調(diào)；24 h和48 h時，各重金屬離子脅迫下鰓MT相對表達量均呈下調(diào)趨勢。如圖3B所示，與空白對照組相比，腎臟MT相對表達量在P3脅迫下6 h時達到最大值，是空白對照組的3.2倍；12 h時，在Cu2+、Pb2+脅迫下腎臟MT相對表達量先上調(diào)后下調(diào)，Cu2++ Pb2+脅迫下均隨著濃度的升高腎臟MT相對表達量下調(diào)；24 h時，在Cu2+、Pb2+脅迫下腎臟MT相對表達量均變化不顯著，在CP3條件下MT相對表達量顯著升高，達到峰值為空白對照組的4.5倍；48 h時，在Cu2+脅迫下，隨濃度升高腎臟MT相對表達量下調(diào)，在Pb2+、Cu2++ Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高腎臟MT相對表達量先上調(diào)后下調(diào)。如圖3C所示，與空白對照組相比，6、12、24及48 h時，在Cu2+、Pb2+與Cu2++ Pb2+脅迫下，肝臟中MT相對表達量均下調(diào)。

圖3 低濃度銅鉛脅迫下對1齡青海湖裸鯉鰓(A)、腎臟(B)和肝臟(C)中MT mRNA相對表達量的影響Fig.3 The effect of low concentration of copper and lead stress on the expression of MT mRNAin gill(A)，kidney(B)and liver(C)of 1 aged G.przewalskii

如圖4A所示，與空白對照組相比，6 h時，鰓TNF-α相對表達量在Cu2+脅迫下隨著濃度的升高上調(diào)，在Pb2+、Cu2++ Pb2+脅迫下先下調(diào)后上調(diào)；12 h時，在Cu2+、Cu2++ Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高鰓TNF-α相對表達量上調(diào)，在Pb2+條件下隨著濃度的升高鰓TNF-α相對表達量下調(diào)；24 h時Cu2+、Pb2+及Cu2++ Pb2+脅迫下鰓TNF-α相對表達量均隨著濃度的升高先上調(diào)后下調(diào)；48 h時，與24 h的變化相反且其值在P3脅迫下達到最大值，是空白對照組的2.8倍。如圖4B所示，與空白對照組相比，6、12及24 h時，在Cu2+、Pb2+、Cu2++ Pb2+脅迫下腎臟TNF-α相對表達量均下調(diào)；48 h時，各條件下隨著濃度的升高腎臟TNF-α相對表達量呈現(xiàn)先是上調(diào)后下調(diào)的趨勢，在P1脅迫下其表達量有最小值，為空白對照組的0.1倍。如圖4C所示，與空白對照組相比，6 h時，各條件下肝臟TNF-α相對表達量無顯著變化；12 h時，Cu2+脅迫下隨著濃度的升高肝臟TNF-α相對表達量升高，在C3條件下達到最大值，為空白對照組的2.1倍。在Pb2+、Cu2++ Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高肝臟TNF-α相對表達量先上調(diào)后下調(diào)；24 h時，各條件下肝臟TNF-α相對表達量均無顯著差異；48 h時，在Cu2+脅迫下肝臟TNF-α相對表達量無顯著差異，在濃度P3下其表達量有最大值為空白對照組的3倍。

圖4 低濃度銅鉛脅迫下對1齡青海湖裸鯉鰓(A)、腎臟(B)和肝臟(C)中TNF-α mRNA相對表達量的影響Fig.4 The effect of low concentration of copper and lead stress on the expression of TNF-α mRNAin gill(A)，kidney(B)and liver(C)of 1 aged G.przewalskii

如圖5A所示，與空白對照組相比，6 h時，鰓Hsp90相對表達量在P3脅迫下有最大值，為空白對照組的11.2倍；12和24 h時，在各脅迫條件下鰓Hsp90相對表達量均無顯著差異；48 h時，在Cu2+脅迫下隨著濃度的升高鰓Hsp90相對表達量先上調(diào)后下調(diào)，在Pb2+、Cu2++ Pb2+脅迫下隨著濃度的升高鰓Hsp90相對表達量上調(diào)。48 h時，在P3脅迫下有最大值，其表達量為空白對照組的6.5倍。如圖5B所示，與空白對照組相比，6 h時，腎臟Hsp90相對表達量在P3脅迫下有最大值，為空白對照組的3.8倍；12 h時，各條件下腎臟Hsp90相對表達量均下調(diào)；24 h時，腎臟Hsp90相對表達量在P1脅迫下有最大值，為空白對照組的4.1倍；48 h時，在Cu2+、Pb2+及Cu2++ Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高腎臟Hsp90相對表達量下調(diào)。如圖5C所示，與空白對照組相比，6 h時，肝臟Hsp90相對表達量在P3脅迫下有最大值，為空白對照組的2.9倍；12 h時，肝臟Hsp90相對表達量在P1脅迫下有最大值，為空白對照組的2.6倍；24和48 h時，各條件下肝臟Hsp90相對表達量無顯著差異。

圖5 低濃度銅鉛脅迫下對1齡青海湖裸鯉鰓(A)、腎臟(B)和肝臟(C)中Hsp90 mRNA相對表達量的影響Fig.5 The effect of low concentration of copper and lead stress on the expression of Hsp90 mRNAin gill(A)，kidney(B)and liver(C)of 1 aged G.przewalskii

如圖6A所示，與空白對照組相比，6 h時，在Cu2+、Pb2+、Cu2++ Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高鰓Hsp70相對表達量上調(diào)，在P3脅迫下有最大值，為空白對照組的4.5倍；12 h時，在CP2脅迫下鰓Hsp70相對表達量達到最大值，是空白對照組的3倍；24 h時，各條件下鰓Hsp70相對表達量均下調(diào)；48 h時，鰓Hsp70相對表達量在CP2脅迫下達到最大值，是空白對照組的2倍。如圖6B所示，與空白對照組相比，6 h時，在Cu2+、Pb2+、Cu2++ Pb2+條件下腎臟Hsp70相對表達量均無顯著差異，腎臟Hsp70相對表達量在P3脅迫下有最大值，為空白對照組的3.3倍；12 h時，在Cu2+、Cu2++ Pb2+脅迫下，隨濃度的升高腎臟Hsp70相對表達量下調(diào)，在C1脅迫下腎臟Hsp70相對表達量有最大值，為空白對照組的22.1倍，24、48 h時，各脅迫下腎臟Hsp70相對表達量均無顯著差異。如圖6C所示，與空白對照組相比，6 h時，肝臟Hsp70相對表達量在P2條件下有最大值，為空白對照組的4.1倍；12 h時，肝臟Hsp70相對表達量也在上述脅迫下有最大值，為空白對照組的2.6倍；24、48 h時，各脅迫條件下肝臟Hsp70相對表達量均無顯著差異。

圖6 低濃度銅鉛脅迫下對1齡青海湖裸鯉鰓(A)、腎臟(B)和肝臟(C)中Hsp70 mRNA相對表達量的影響Fig.6 The effect of low concentration of copper and lead stress on the expression of Hsp70 mRNA in gill(A)，kidney(B)and liver(C)of 1 aged G.przewalskii

如圖7所示，與空白對照組相比，在6、12、24和48 h時，各脅迫條件下鰓、腎臟及肝臟中的iNOS相對表達量均顯著下調(diào)。

圖7 低濃度銅鉛脅迫下對1齡青海湖裸鯉鰓(A)、腎臟(B)和肝臟(C)中iNOS mRNA相對表達量的影響Fig.7 The effect of low concentration of copper and lead stress on the expression of iNOS mRNAin gill(A)，kidney(B)and liver(C)of 1 aged G.przewalskii

如圖8A所示，與空白對照組相比，6 h時，在Cu2+脅迫下，隨著濃度的升高鰓COX-2相對表達量先下調(diào)后上調(diào)，在Pb2+、Cu2++ Pb2+脅迫下，均隨著濃度的升高鰓COX-2相對表達量下調(diào)；12 h時，在CP3脅迫下鰓COX-2相對表達量有最大值，為空白對照組的2.1倍；24 h時，在Cu2+、Pb2+及Cu2++ Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高鰓COX-2相對表達量先上調(diào)而后下調(diào)，在CP2脅迫下鰓COX-2相對表達量有最大值，為空白對照組的1.3倍；48 h時，鰓COX-2相對表達量在C1脅迫下有最大值，為空白對照組的2.3倍。如圖8B所示，與空白對照組相比，6 h時，腎臟COX-2相對表達量在C1脅迫下有最大值，為空白對照組的14.2倍；12、24和48 h時，各條件下腎臟COX-2相對表達量均無顯著差異。如圖8C所示，與空白對照組相比，6 h時，各條件下肝臟COX-2相對表達量均無顯著差異；12 h時，肝臟COX-2相對表達量在P2脅迫下有最大值，為空白對照組的1.7倍；24 h時，各條件下肝臟COX-2相對表達量均無顯著差異；48 h時，在Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高肝臟COX-2相對表達量上調(diào)，在Cu2+、Cu2++ Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高肝臟COX-2相對表達量下調(diào)。在各個時間點，Cu2++ Pb2+脅迫下，隨著濃度的升高肝臟COX-2相對表達量均下調(diào)。

3 討論

3.1 Cu2+、Pb2+對青海湖裸鯉的毒性效應(yīng)

魚類容易受到水體環(huán)境變化的影響，當水體中重金屬的含量較高時，就會對魚體產(chǎn)生癌變或畸變等毒性作用，重金屬離子濃度達到一定程度會突破魚類的承受能力甚至引發(fā)死亡。Cu2+和Pb2+對魚類毒性作用的大小，主要取決于游離的重金屬離子濃度和處理時間，濃度越高處理時間越長毒性作用越強烈[15-16]。毒物之間的復(fù)合作用有三種類型：協(xié)同作用、拮抗作用和加和作用[17]。

關(guān)于重金屬對水體生物毒性作用由于重金屬種類濃度和試驗動物以及水生生物生活環(huán)境和生存周期的不同，使得試驗結(jié)果存在一定差異性。研究表明，Cu2+對中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[18]96、120、144和168 h時的LC50分別為0.500、0.401、0.356和0.352 mg/L，安全濃度為0.05 mg/L；對日本黃姑魚(Argyrosomusjaponicus)[19]在24、48、72和96 h時相應(yīng)LC50分別為3.178、2.924、2.755和2.63 mg/L，安全濃度為26.3 mg/L；對中國花鱸(Lateolabraxmaculatus)[20]幼魚24、48、72和96 h的LC50分別為1.85、1.66、1.48和0.86 mg/L，安全濃度為8.6 mg/L。水體中Pb2+對鯽(Carassiusauratus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、南方鲇(Silurusmeridionalis)、團頭魴(Megalobramaamblycephala)、中華倒刺鲃和胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)的96 h LC50分別為3.73、11.59、6.59、3.27、0.33和3.00 mg/L[21]。與本研究中得到結(jié)果相比，Cu2+對1齡青海湖裸鯉的24、48和96 h的LC50分別為0.528、0.422和0.295 mg/L；Pb2+對1齡青海湖裸鯉的24、48和96 h的LC50分別為2.509、1.793和1.316 mg/L，青海湖裸鯉的LC50與安全濃度更低，對重金屬離子更加敏感。這可能是由于青海湖裸鯉的棲息地水域幾乎沒有污染，周圍不存在重金屬離子的來源，在面對不同重金屬的脅迫時青海湖裸鯉的耐受性就更差。

重金屬復(fù)合發(fā)生拮抗作用時，細胞膜的通透性被減弱，魚體滲透作用減弱，從而造成的毒性作用弱于單一存在時的毒性[22]。研究表明，Cu2+和Pb2+共存時對金魚(C.auratusLinnaeus)24 h、48 h和72 h時計算得到的AI均大于0，Cu2++ Pb2+表現(xiàn)出極強的協(xié)同作用[23]。Cu2+和Pb2+不論是在毒性比為1∶1還是質(zhì)量濃度為1∶1條件下，對魚類均產(chǎn)生毒性協(xié)同作用[24]。但在對剛孵化的黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)進行Cu2++ Pb2+處理后，卻發(fā)現(xiàn)兩者具有拮抗作用[25-26]。本研究中得到Cu2++ Pb2+對青海湖裸鯉復(fù)合脅迫后具有拮抗作用，復(fù)合毒性作用比單一毒性作用下更強烈?？梢娭亟饘匐x子之間的相互作用形式也并非一成不變，明確復(fù)合毒性作用下青海湖裸鯉的生存情況，及兩種重金屬離子的作用方式，比較重金屬單一與復(fù)合存在下，對青海湖裸鯉的毒性效應(yīng)有何不同，可為了解青海湖裸鯉對不同重金屬的敏感度提供理論依據(jù)，為更好地保護青海湖裸鯉棲息水域提供數(shù)據(jù)支撐。

3.2 低濃度Pb2+、Cu2+脅迫后青海湖裸鯉免疫相關(guān)基因的表達

Nrf2-Keap1系統(tǒng)在機體應(yīng)激反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用[27]，Keap1是Nrf2主要的胞內(nèi)負調(diào)控調(diào)節(jié)因子[28]。MT參與大量與金屬離子相關(guān)的生理過程(從解毒到維持穩(wěn)態(tài)、再到儲存和傳遞重金屬)[29]。Hsps是一類高度保守應(yīng)激蛋白和外部伴侶蛋白。另外發(fā)現(xiàn)在重金屬存在條件下魚類肝臟中免疫調(diào)節(jié)相關(guān)生物標志物TNF-α表達水平升高。iNOS是炎癥過程的早期反應(yīng)基因。許多環(huán)境脅迫因子都具有激活iNOS活性并使其生成NO的潛力[30]。除了iNOS以外，在免疫系統(tǒng)中COX-2也是早期炎癥反應(yīng)中的應(yīng)答基因，常被用作炎癥標志物。

不同重金屬在低濃度脅迫下，對各個基因的表達均產(chǎn)生了不同的影響。這可能是各組織的功能差異導(dǎo)致的，魚類的滲透離子調(diào)節(jié)主要通過滲透調(diào)節(jié)器官鰓、腎完成[31]。肝臟是魚類最重要的解毒器官，可將體內(nèi)新陳代謝的有毒廢物轉(zhuǎn)化為無毒、毒性較輕或易被降解的物質(zhì)，通過膽汁或尿液排出體外，進而保障機體正常行使生理功能[32]。本研究結(jié)果顯示引發(fā)炎癥反應(yīng)的相關(guān)因子TNF-α，iNOS及COX-2主要在肝臟中表達，可見低濃度重金屬離子引起的炎癥反應(yīng)主要在肝臟，會對肝臟的解毒功能造成不利的影響。在重金屬存在條件下魚類肝臟中免疫調(diào)節(jié)相關(guān)生物標志物的相對表達水平會升高。鰓及腎臟中各基因均在不同濃度重金屬離子條件下表現(xiàn)出不同于空白對照組的表達水平，說明各基因?qū)τ诘蜐舛菴u2+、Pb2+存在應(yīng)答反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，機體在低濃度重金屬離子暴露下可能會產(chǎn)生與高濃度重金屬離子脅迫完全不同的生物學(xué)效應(yīng)[33]。長期低劑量重金屬Cu2+、Pb2+、Zn2+和Cd2+對水生生物泥蚶(Tegillarcagranosa)的研究表明，低劑量重金屬長期脅迫雖不能導(dǎo)致機體死亡，但能影響其生長發(fā)育，并對機體抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因表達和種群的正常繁衍生息造成一定的影響[34]。在本研究中，低濃度Cu2+、Pb2+單一與復(fù)合條件下，各基因的變化情況均不相同，表明各基因在面對低濃度重金屬脅迫時存在復(fù)雜的應(yīng)答機制。

相較Cu而言，Pb屬于毒性重金屬，并具有高毒性[35]，但兩者以一定劑量存在于魚體內(nèi)時均會誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激[36]。研究表明，在重金屬脅迫后斑馬魚體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因表達量隨著重金屬離子濃度升高而上調(diào)，表明重金屬存在下能上調(diào)抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的表達。重金屬可能通過Nrf2-Keap1信號通路激活下游抗氧化系統(tǒng)[37]。MT作為金屬結(jié)合蛋白，在細胞層面，發(fā)揮著對機體重金屬水平穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定與消除毒性以及自由游離基清除等功能[38]。MT通過螯合作用降低金屬毒性，參與氧化應(yīng)激過程中相關(guān)酶類的合成，維持機體和細胞的穩(wěn)態(tài)。Pb2+、Cd2+對錦鯉(Cyprinuscarpiohaematopterus)的毒理學(xué)研究表明，重金屬暴露能誘導(dǎo)魚體組織和血液產(chǎn)生大量MT表達，伴隨兩種重金屬積累量的提高，Pb2+-MT和Cd2+-MT水平也迅速達到最高，并且通過血液循環(huán)運送到各個組織來應(yīng)對外界重金屬的毒害，所以MT對重金屬在魚體內(nèi)的積累和排出過程起關(guān)鍵作用[39]。DEANE等[40]研究轉(zhuǎn)錄層面重金屬(Cd2+、Cu2+和Ni2+)誘導(dǎo)黑鯛(Sparusmacrocephlus)熱激同源蛋白(HSC70)和HSP70的表達水平，發(fā)現(xiàn)HSP70對水體中重金屬相關(guān)危害物質(zhì)有強烈響應(yīng)。另外，陳曄等[41]發(fā)現(xiàn)Cd2+可以顯著誘導(dǎo)褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)肝臟HSP70的表達，且HSP60，HSP90和HSC70的表達量也有增加。總之，HSP就是作為一種保護性蛋白，當受到外界環(huán)境脅迫時，就會大量合成，阻止受損蛋白互作，促進有益互作，使機體維持正常的生理活動。本研究表明，在低濃度重金屬Cu2+、Pb2+脅迫下青海湖裸鯉免疫調(diào)節(jié)相關(guān)生物標志物TNF-α相對表達水平顯著變化。也就是說參與炎癥反應(yīng)的炎癥反應(yīng)因子在重金屬損傷機體引發(fā)炎癥反應(yīng)時，TNF-α的表達會改變，激發(fā)細胞炎癥反應(yīng)。COX-2在正常組織內(nèi)表達量較低，當機體受到重金屬離子引發(fā)的炎癥等刺激時，其表達水平可升高至空白對照組的數(shù)倍，導(dǎo)致炎癥對組織造成損傷。iNOS通過產(chǎn)生NO起到防御功能，一般情況下iNOS不表達，常在受到刺激TNF-α等誘導(dǎo)下表達[42]。本研究表明，重金屬暴露期間青海湖裸鯉組織中iNOS相對表達水平是降低的，盡管在暴露期間與暴露后沒有顯著差異。低濃度金屬暴露下iNOS的生理反應(yīng)一般遵循損傷修復(fù)模型，該結(jié)果表明了低濃度重金屬暴露過程中機體也會發(fā)生炎癥過程。iNOS具有雙面作用，一方面可以作為防御毒害作用的因子，另一方面又生成NO，形成過氧亞硝酸鹽造成細胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)重金屬鎘誘導(dǎo)魚類iNOS活性升高，生成大量NO[43]。iNOS誘導(dǎo)NO的生成，而NO是炎癥和免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)在低濃度重金屬Cu脅迫下，青海湖裸鯉腎臟中COX-2 mRNA水平?jīng)]有顯著變化，但是在肝臟中顯著增強，表明COX-2可能在肝臟中受到Cu轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)節(jié)。

由此可見，重金屬離子對抗氧化免疫相關(guān)基因的表達會造成影響，但是如何影響及最終表現(xiàn)比較復(fù)雜，不能一概而論簡單地歸納為誘導(dǎo)激活或抑制的變化規(guī)律。重金屬對魚類基因表達的影響反映出較大的差異性，不同種重金屬或同種重金屬不同劑量、不同作用時間，重金屬單一與復(fù)合處理魚類，都對機體抗氧化免疫、重金屬解毒、熱休克反應(yīng)及炎癥防御等方面的基因表達產(chǎn)生不同的影響，也反映出這些相關(guān)基因表達對環(huán)境應(yīng)激源響應(yīng)的綜合性和復(fù)雜性。

4 結(jié)論

單一脅迫下，Cu2+和Pb2+的安全濃度分別為0.03 和0.1 mg/L；復(fù)合脅迫下，Cu2+和Pb2+的安全濃度分別為0.000 2和0.000 7 mg/L。Cu2++ Pb2+對青海湖裸鯉具有拮抗作用。低濃度Cu2+和Pb2+處理對青海湖裸鯉抗氧化免疫、重金屬解毒、熱休克反應(yīng)及炎癥防御等方面的基因表達產(chǎn)生不同影響，各基因均對重金屬離子作出響應(yīng)。