中華絨螯蟹養(yǎng)殖用抑水綿枯草芽孢桿菌A4的安全性分析

曹海鵬，顧 穎，，孫苗苗，王會聰，葉仁智，安 健

(1.上海海洋大學(xué)，國家水生動物病原庫，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.連云港市海洋與漁業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心，江蘇連云港 222000；4.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400)

近年來，商品化益生菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中的安全性問題日益突出。相關(guān)研究表明，部分市售益生菌株含有腸毒素基因、嘔吐毒素基因和溶血素，能引起脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)死亡以及克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)腸炎、中華鱉(Pelodiscussinensis)“搖頭癥”、黃沙鱉(P.sinensis)疥瘡病和腐皮病[1-6]。因此，水產(chǎn)用益生菌的安全性評價必須予以重視。目前，水產(chǎn)用功能芽孢桿菌的安全性研究工作已取得了較大進(jìn)展。安健等[12]通過耐藥性、毒力基因檢測和對小鼠(Musmuslulus)及草魚(Ctenopharyngodonidellus)的致病性評價了解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)G1的安全性，證實解淀粉芽孢桿菌G1對小鼠和草魚的LD50大于109CFU/g，為無毒菌株；王琳晶等[13]通過溶血和對斑馬魚(Daniorerio)的致病性分析評價了解淀粉芽孢桿菌ZJ2009的安全性，證實解淀粉芽孢桿菌ZJ2009無溶血活性，對斑馬魚無毒；周敏等[14]通過溶血和對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的致病性分析評價了大山芽孢桿菌(B.gaemokensis)JY-1的安全性，證實大山芽孢桿菌JY-1無溶血活性，對尼羅羅非魚無致病性。

水綿是一種在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中廣泛存在的有害絲狀綠藻，易導(dǎo)致中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)脫殼困難、窒息或中毒甚至死亡，嚴(yán)重影響了中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[7-9]。目前，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophic)和側(cè)孢芽孢桿菌(B.licheniformis)的一些菌株被證實具有抑制水綿的效果[10-11]。然而，關(guān)于抑水綿芽孢桿菌的安全性評價卻鮮有報道。鑒此，本實驗參照《HJ/T 415-2008 環(huán)保用微生物菌劑環(huán)境安全評價導(dǎo)則》、《GB 20287-2006 農(nóng)用微生物菌劑》、《NY/T 1444-2007 微生物飼料添加劑技術(shù)通則》和《直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評價指南》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，從溶血性、有害代謝物產(chǎn)生能力、耐藥性與耐藥質(zhì)粒及其對斑馬魚、大型蚤、中華絨螯蟹的毒性對抑水綿枯草芽孢桿菌A4的安全性進(jìn)行了檢測分析，以期為枯草芽孢桿菌A4在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定安全性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斑馬魚平均體質(zhì)量(0.3±0.05)g，健康無病傷，由上海海洋大學(xué)魚類學(xué)實驗室提供；大型蚤(Daphniamagna)由上海海洋大學(xué)水生生物學(xué)實驗室提供；中華絨螯蟹，平均體質(zhì)量(30.0±3.1)g，健康無病傷，由江蘇連云港某養(yǎng)殖場提供；抑水綿枯草芽孢桿菌A4，分離自池塘底泥，由本實驗室分離保藏[15]；益生地衣芽孢桿菌BYK，由上海海洋大學(xué)水生動物病原庫提供；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DNA marker、2×Taq PCR Master Mix和4S Green Plus核酸染料，購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；6×DNA Loading Buffer，購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖，購自美國海普生物公司；哥倫比亞血瓊脂平板，購自南京全隆生物技術(shù)有限公司；蛋白胨水(色氨酸肉湯)生化鑒定管、尿素酶生化鑒定管、硫化氫生化鑒定管，購于青島海博生物有限公司；鳥氨酸脫羧酶生化鑒定管、賴氨酸脫羧酶生化鑒定管、精氨酸脫羧酶生化鑒定管、氨基酸脫羧酶對照生化鑒定管、無菌液體石蠟、Kovacs靛基質(zhì)試劑，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱河微生物試劑有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，參照《GB /T 13267-1991水質(zhì) 物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》自制。

1.2 枯草芽孢桿菌A4菌懸液的制備

參照黃曉東等[16]的方法將枯草芽孢桿菌A4接種到無菌營養(yǎng)肉湯中，于30 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)24 h 后12 000 r/min 離心10 min，棄上清，用無菌生理鹽水重懸菌沉淀，制成濃度為1.5×1010CFU/mL的菌懸液。

1.3 枯草芽孢桿菌A4的毒力基因檢測

參照范培超等[17]的方法對枯草芽孢桿菌A4中腸毒素基因(nheA、bceT和entFM)、嘔吐基因(ces)、細(xì)胞毒素基因(cytK)和溶血素基因(hblA、hblC和hblD)等8種常見的芽孢桿菌毒力基因進(jìn)行PCR檢測。PCR擴(kuò)增引物由上海邁浦生物科技有限公司合成，引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板2 μL，引物各1 μL，dd H2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃，30 s，共35個循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以地衣芽孢桿菌 BYK為對照。

表1 毒力基因引物信息Tab.1 Primers for virulence genes

1.4 枯草芽孢桿菌A4有毒有害產(chǎn)物產(chǎn)生能力檢測

1.4.1 溶血能力檢測

參照陳書暢等[19]的方法將枯草芽孢桿菌A4接種于哥倫比亞血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生溶血圈。若無溶血圈產(chǎn)生，則為γ-溶血；產(chǎn)生綠色溶血圈，則為α-溶血；產(chǎn)生透明溶血圈，則為β-溶血[20]。每個處理3個平行。

1.4.2 有害產(chǎn)物產(chǎn)生能力檢測

采用生化鑒定管法[21]檢測枯草芽孢桿菌A4對生物胺、吲哚、氨和硫化氫等有害產(chǎn)物的產(chǎn)生能力。每個處理3個平行。

1.5 枯草芽孢桿菌A4的耐藥性檢測

采用紙片擴(kuò)散法[1]檢測枯草芽孢桿菌A4對30種抗生素的敏感性。即無菌操作取100 μL枯草芽孢桿菌A4的菌懸液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，然后立即將抗生素紙片貼于營養(yǎng)瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，并根據(jù)CLSI藥敏試驗判定標(biāo)準(zhǔn)[22]判斷枯草芽孢桿菌A4的藥物敏感性。每個處理3個平行。

1.6 枯草芽孢桿菌A4的耐藥基因檢測

參照沈飛等[23]的方法對枯草芽孢桿菌A4的多肽類耐藥基因(MCR-1)、酰胺醇類耐藥基因(floR)、氨基糖苷類耐藥基因(aph(3′)-Ⅰa和aac(6′)-Ⅰb)、β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因(blaTEM和blaCTX)、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因(ermA和ermC)、喹諾酮類耐藥基因(qnrA和qnrB)、磺胺類耐藥基因(sul1和sul2)和四環(huán)素類耐藥基因(tetA和tetM)等14種耐藥基因進(jìn)行PCR檢測。PCR擴(kuò)增引物由上海邁浦生物科技有限公司合成，引物信息見表2。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以地衣芽孢桿菌 BYK為對照。

表2 耐藥基因引物信息Tab.2 Primers for resistance genes

1.7 枯草芽孢桿菌A4的耐藥質(zhì)粒檢測

參照甘永琦等[31]的方法采用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌A4的質(zhì)粒，以地衣芽孢桿菌BYK為對照，取5 μL的質(zhì)粒提取液中加入1 μL 6×上樣緩沖液，點樣于0.7%瓊脂糖凝膠孔道中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察瓊脂糖凝膠是否出現(xiàn)質(zhì)粒條帶。

1.8 枯草芽孢桿菌A4對水生動物的毒性分析

1.8.1 枯草芽孢桿菌A4對斑馬魚的毒性

參照NI等[32]的方法。實驗設(shè)置6個實驗組和1對照組，每組3個平行玻璃水族缸，每個水族缸分別盛有1 L曝氣自來水并放入健康斑馬魚10尾。實驗組水族缸加入枯草芽孢桿菌A4菌懸液至終濃度分別為 1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108、1.5×109CFU/mL，每天更換實驗水至實驗濃度；對照組不加任何物質(zhì)。連續(xù)觀察7 d并記錄魚體反應(yīng)能力、游動能力和呼吸能力等，以及各組斑馬魚的死亡數(shù)目，采用BLISS法[33]計算枯草芽孢桿菌A4對斑馬魚的半數(shù)致死濃度(LC50)。將水質(zhì)條件控制在22～24 ℃、DO>4 mg/L、pH 7.0～7.5。

1.8.2 枯草芽孢桿菌A4對大型蚤的毒性

參照朱碧云等[34]的方法。實驗設(shè)置6個試驗組和1對照組，每組3個平行玻璃燒杯，每個燒杯分別盛有100 mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋水并放入健康大型蚤10只。實驗組燒杯加入枯草芽孢桿菌A4菌懸液至終濃度分別為 1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108、1.5×109CFU/mL，每天更換實驗水至試驗濃度；對照組不加任何物質(zhì)。連續(xù)48 h觀察并記錄大型蚤活動受抑制數(shù)和中毒癥狀。實驗期間光照周期(光照/黑暗)為12 h/12 h，將水質(zhì)條件控制在水溫24～26 ℃、DO 8～9 mg/L、pH 7.5～8.5。

1.8.3 枯草芽孢桿菌A4對中華絨螯蟹的毒性

參照周麗穎等[35]的方法。實驗包括6個試驗組和1對照組，每組3個平行塑料水族缸，每個水族缸分別盛有60 L曝氣自來水并放入健康中華絨螯蟹10只。實驗組中華絨螯蟹分別在第三步足基部注射100 μL濃度為 1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108、1.5×109CFU/mL的枯草芽孢桿菌A4菌懸液，對照組注射100 μL生理鹽水。連續(xù)7 d觀察中華絨螯蟹有無攝食異常，附肢無力等不正常行為，并記錄各組中華絨螯蟹的死亡數(shù)目。采用BLISS法計算枯草芽孢桿菌A4對中華絨螯蟹的半數(shù)致死濃度(LC50)。實驗期間水質(zhì)條件控制在24～26 ℃、DO>6 mg/L、pH 7.5～8.0。

1.9 數(shù)據(jù)分析方法

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌A4的毒力基因

實驗結(jié)果(圖1)表明，枯草芽孢桿菌A4不攜帶nheA、bceT、ces、cytK、entFM、hblA、hblC和hblD等8種毒力基因，而對照菌株BYK含bceT和hblA毒力基因，不攜帶nheA、ces、cytK、entFM、hblC和hblD等6種毒力基因。

圖1 枯草芽孢桿菌A4毒力基因的PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR detection of virulence genes from B.subtilis A4M：DL2 000 DNA marker；1-8：A4 nheA、bceT、entFM、ces、cytK、hblA、hblC和hblD毒力基因；9-16：BYK nheA、bceT、entFM、 ces、cytK、hblA、hblC和hblD毒力基因。

2.2 枯草芽孢桿菌A4有毒有害產(chǎn)物的產(chǎn)生能力

實驗結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌A4無溶血活性，也不產(chǎn)生腐胺、尸胺、精胺、吲哚以及氨、硫化氫等有害代謝物。

2.3 枯草芽孢桿菌A4的耐藥性

實驗結(jié)果(表3)表明，枯草芽孢桿菌A4對苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、麥迪霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、萬古霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、氟苯尼考、氯霉素和克林霉素等30種抗生素均高度敏感。

表3 枯草芽孢桿菌A4的藥敏特性Tab.3 Antibiotic sensitivity of B.subtilis A4

2.4 枯草芽孢桿菌A4的耐藥基因檢測

實驗結(jié)果(圖2)表明，枯草芽孢桿菌A4攜帶氨基糖苷類耐藥基因aph(3′)-Ⅰa和β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因blaTEM，不攜帶多肽類耐藥基因(MCR-1)、酰胺醇類耐藥基因(floR)、氨基糖苷類耐藥基因(aac(6′)-Ⅰb)、β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因(blaCTX)、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因(ermA和ermC)、喹諾酮類耐藥基因(qnrA和qnrB)、磺胺類耐藥基因(sul1和sul2)和四環(huán)素類耐藥基因(tetA和tetM)等12種耐藥基因，而對照菌株BYK攜帶floR、aph(3′)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb和blaTEM等4種耐藥基因，不攜帶MCR-1、blaCTX、ermA、ermC、qnrA、qnrB、sul1、sul2、tetA和tetM等10種耐藥基因。

圖2 枯草芽孢桿菌A4耐藥基因的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection of resistance genes from B.subtilis A4M：DL2 000 DNA marker；1-14：A4 MCR-1、floR、aph(3′)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、blaTEM、blaCTX、ermA、ermC、qnrA、qnrB、sul1、sul2、tetA和tetM耐藥基因；15-28：BYK MCR-1、floR、aph(3′)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb、blaTEM、blaCTX、ermA、ermC、qnrA、qnrB、sul1、sul2、tetA和tetM耐藥基因。

2.5 枯草芽孢桿菌A4的耐藥質(zhì)粒檢測

實驗結(jié)果(圖3)表明，枯草芽孢桿菌A4不含質(zhì)粒，不存在耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，而對照菌株BYK含有質(zhì)粒，具有耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。

圖3 枯草芽孢桿菌A4質(zhì)粒檢測Fig.3 Detection of plasmids from B.subtilis A4M：DL15 000 DNA marker；1：枯草芽孢桿菌A4；2：地衣芽孢桿菌BYK。

2.6 枯草芽孢桿菌A4對水生動物的毒性

實驗結(jié)果表明，對照組和6個枯草芽孢桿菌A4處理組的斑馬魚均生長良好，未出現(xiàn)反應(yīng)遲緩和魚體側(cè)翻等任何異常癥狀和死亡，而且對照組和6個枯草芽孢桿菌A4處理組的大型蚤也生長良好，未出現(xiàn)反應(yīng)遲緩等中毒癥狀和死亡。此外，對照組和6個枯草芽孢桿菌A4處理組的中華絨螯蟹均未出現(xiàn)死亡，而且生長良好、攝食正常，未出現(xiàn)附肢無力等任何異常癥狀。由此說明，枯草芽孢桿菌A4對斑馬魚、大型蚤和中華絨螯蟹的LC50均大于1.5×109CFU/mL。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌A4的毒力基因分布

毒力基因檢測是評價芽孢桿菌安全性的指標(biāo)之一[1]。據(jù)報道，芽孢桿菌可能含有溶血素Hbl基因(hblA、hblC和hblD)、非溶血性腸毒素Nhe基因(nheA、nheB和nheC)、細(xì)胞毒素K基因(CytK)、 腸毒素T基因(bceT)、腸毒素FM基因(entFM)等腸毒素基因和嘔吐素基因(ces)，具有產(chǎn)生溶血性、腸毒素和嘔吐毒素的潛力，與芽孢桿菌的致病性密切相關(guān)[36]。例如，攜帶溶血素Hbl基因、細(xì)胞毒素K基因和腸毒素T基因的蠟狀芽孢桿菌能夠引起半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)出現(xiàn)皮膚潰爛、充血、淤血等病癥[37]。因此，枯草芽孢桿菌的腸毒素和嘔吐毒素基因檢測至關(guān)重要。劉純等[1]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌S-1不攜帶hblA、hblB、hblC、nheA、nheB、bceT和ces等腸毒素和嘔吐毒素基因，但攜帶hblD、nheC和cytK等3種毒力基因；枯草芽孢桿菌S-2不攜帶hblA、hblB、hblC、nheA、nheB、nheC、cytK、bceT和ces等腸毒素和嘔吐毒素基因，但攜帶腸毒素基因hblD；SOROKULOVA等[38]研究表明枯草芽孢桿菌BS3不攜帶hblA、hblB、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、bceT和cytK等腸毒素和嘔吐毒素基因。本實驗發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌A4不攜帶nheA、bceT、ces、cytK、entFM、hblA、hblC和hblD等腸毒素和嘔吐毒素基因，與劉純等[1]、SOROKULOVA等[38]的報道有所不同，可能是因為不同分離源的枯草芽孢桿菌菌株的毒力基因具有較大的遺傳多樣性。

3.2 枯草芽孢桿菌A4有毒有害代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生能力

溶血素是致病芽孢桿菌重要的毒力因子，其作用于細(xì)胞膜后會造成其結(jié)構(gòu)和功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，引起嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖動物的健康[17，39]。因此，溶血素產(chǎn)生是評價功能性芽孢桿菌安全性的重要檢測指標(biāo)之一。陳豐等[40]研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌CS4具有β-溶血性，對鯽的LD50為4.6×106CFU/g，能導(dǎo)致鯽體表充血、腹腔內(nèi)嚴(yán)重出血等癥狀；郭藝偉等[41]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)Y1無溶血性，在菌濃度為1.0×108CFU/mL時飼喂小鼠，對小鼠無致病性。本實驗發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌A4無溶血性，與郭藝偉等[41]的報道相同。此外，致病性芽孢桿菌能夠產(chǎn)生生物胺和吲哚等有害物質(zhì)，引起免疫、消化和神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[39]。張艷等[21]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌LLYB不產(chǎn)生生物胺和吲哚。本實驗也證實枯草芽孢桿菌A4不產(chǎn)生腐胺、精胺、尸胺和吲哚，與張艷等[21]報道的枯草芽孢桿菌LLYB在生物胺和吲哚產(chǎn)生上的研究結(jié)果一致。

3.3 枯草芽孢桿菌A4的耐藥性

枯草芽孢桿菌的耐藥性已成為全球關(guān)注的問題，其抗生素耐藥基因能夠通過耐藥質(zhì)粒在環(huán)境中發(fā)生轉(zhuǎn)移[42]。因此，檢測枯草芽孢桿菌的耐藥性及其耐藥質(zhì)粒已成為評價其安全性的重要內(nèi)容。樊丹等[43]研究表明，枯草芽孢桿菌RT-BS07對環(huán)丙沙星、氧氟沙星和鏈霉素等18種抗生素高度敏感，但對呋喃唑酮耐藥；SOROKULOVA等[38]研究表明，枯草芽孢桿菌BS3對氨芐西林、萬古霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、克林霉素、四環(huán)素、甲氧芐氨嘧啶、環(huán)丙沙星和恩諾沙星等抗生素高度敏感，對氯霉素、頭孢曲松等抗生素中度敏感，對苯唑西林耐藥，且不攜帶質(zhì)粒。本實驗發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌A4對30種常見抗生素均高度敏感，不攜帶MCR-1、floR、aac(6′)-Ⅰb、blaCTX、ermA、ermC、qnrA、qnrB、sul1、sul2、tetA和tetM等12種耐藥基因，與耐藥表型一致，但枯草芽孢桿菌A4攜帶aph(3′)-Ⅰa和blaTEM耐藥基因，與耐藥表型不一致，可能是檢測到的耐藥基因未能表達(dá)轉(zhuǎn)化為具有生物活性的蛋白質(zhì)分子[44]。此外，枯草芽孢桿菌A4未檢測到耐藥質(zhì)粒，表明枯草芽孢桿菌耐藥基因不是由質(zhì)粒編碼，其所攜帶aph(3′)-Ⅰa和blaTEM耐藥基因?qū)儆诠逃锌剐曰?，耐藥性不具有通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的可能性[28]。

3.4 枯草芽孢桿菌A4的安全性

張洪玉等[45]實驗發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌D7對斑馬魚和大型蚤的LC50>108CFU/mL，且對斑馬魚、大型蚤安全無毒；黃曉東等[16]實驗發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌PNB3對斑馬魚的LC50>2.0×108CFU/mL，且對斑馬魚安全無毒；王琳晶等[13]實驗表明解淀粉芽孢桿菌ZJ2009對斑馬魚LC50>108CFU/mL，且對斑馬魚安全、無毒副作用。本實驗結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌A4對斑馬魚、大型蚤的LC50>1.5×109CFU/mL，其LC50比芽孢桿菌D7、PNB3和ZJ2009等菌株的LC50更高，說明更具安全性。此外，枯草芽孢桿菌A4對中華絨螯蟹的LC50>1.5×109CFU/mL。根據(jù)MITTAL等[46]對菌株毒力的判定標(biāo)準(zhǔn)，可判定枯草芽孢桿菌A4為無毒菌株。因此，枯草芽孢桿菌A4在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中具有良好的應(yīng)用安全性。