小柴胡湯含藥血清體外抗流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究

霍雨佳，陳佳亮，鄒文瑋，郝莉鵬，2，張 磊，楊沛霖，李凌威，周一心，2*，潘麗峰，2*

（1.上海市浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200136；2.復(fù)旦大學(xué)浦東預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院，上海 200136；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)上海中醫(yī)健康服務(wù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201203；4.上海市奉賢區(qū)四團(tuán)鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 201412）

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染?。?-2］，全球每年大約有10 億人感染，其中重癥病例有300～500 萬例，死亡29～65 萬例［3］。A （H1N1） pdm09 和H3N2，Victoria 型（BV） 和Yamagata 型（BY） 是目前主要流行的流感病毒亞型［4-6］。由于奧司他韋等化學(xué)藥物大量使用，其耐藥性日益嚴(yán)重［7-9］，因此需研究其他藥物對(duì)流感的有效性與安全性。經(jīng)方是“醫(yī)藥之祖”，小柴胡湯出自張仲景的《傷寒論》［10-11］，其中的柴胡、甘草等成分已被證實(shí)對(duì)感冒發(fā)燒、咳嗽痰多等癥狀有效并用于臨床治療［12］，但小柴胡湯方劑對(duì)流感的抗病毒作用研究鮮有報(bào)道。本研究通過探索小柴胡湯含藥血清對(duì)流感病毒A（H1N1） pdm09、H3N2、BV、BY 4 種亞型株的抑制作用，以期為該藥的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 狗腎細(xì)胞 （Madin-Darby canine kidney cells，MDCK） 由上海市疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 毒株 流感病毒A （H1N1） pdm09、H3N2、BV、BY 亞型株為本實(shí)驗(yàn)室保存，其序列與A／Hawaii／70／2019（H1N1） 、A／Kansas／14／2017 （H3N2）、B／Victoria／17／2022、B／Washington／28／2020 無明顯差異。

1.3 動(dòng)物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量（300±15） g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京）2016-0006］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)屏障內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過程經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)PZSHUTCM220822005）。

1.4 藥物與試劑 小柴胡湯含藥血清由上海中醫(yī)藥大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心制備。磷酸奧司他韋膠囊（上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)SH0093），無菌稀釋至7 500 μg／mL 備用。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、EDTA-胰酶、青霉素-鏈霉素、HEPES 緩沖液、HBSS （美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)2428750、2547014P、2323487、2199830、2428706、2492851）；TPCK-胰酶（美國(guó)Sigma 公司，CAS 號(hào)9002-07-7）；MTT 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒［生工生物工程（上海） 股份有限公司，批號(hào)IA19FA0007］。

1.5 儀器 生物安全柜（型號(hào)BSC-1500ⅡA2-X，山東博科醫(yī)療器械有限公司）；倒置顯微鏡（型號(hào)CKX41，日本Olympus 公司）；全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（型號(hào)ELX800，美國(guó)BioTek 公司）；CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)CCL-240B-8，新加坡ESCO 公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（型號(hào)IC1000，上海睿鈺生物科技有限公司）；低溫冰箱（型號(hào)HYC-360，海爾集團(tuán)公司）；水浴恒溫振蕩器（型號(hào)HSHZ-B，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；十功能自動(dòng)煎藥機(jī)、液體濃縮機(jī)（型號(hào)NS01、NS01，北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)液和病毒生長(zhǎng)液的配制 500 mL DMEM 中加入青霉素-鏈霉素5 mL （終濃度為青霉素100 U／mL 和鏈霉素100 μg／mL） 和12.5 mL HEPES 緩沖液（終濃度為25 mmol／L）。將50 mL 胎牛血清加到450 mL 上述混合DMEM 中，使胎牛血清終濃度為10%，即得細(xì)胞生長(zhǎng)液；向上述混合DMEM 中每500 mL 加入0.5 mL TPCK-胰酶（母液濃度為2 mg／mL，終濃度為2 μg／mL），即得病毒生長(zhǎng)液。

2.2 小柴胡湯的制備 按照《傷寒論》 中小柴胡湯的原方比例，柴胡半斤（24 g）、黃芩三兩（9 g）、人參三兩（9 g）、甘草三兩（9 g）、姜半夏半升（9 g）、生姜三兩（9 g）、大棗四枚（9 g） （藥材經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)吳靳榮教授鑒定為正品） 配制。第1 次加8 倍量水煎煮，其中煎煮前先加入7 倍量水浸泡30 min，選擇常壓煎煮模式，武火煮沸后轉(zhuǎn)為文火煎煮30 min；第2 次煎煮時(shí)，機(jī)器自動(dòng)補(bǔ)充進(jìn)20%加水量，武火煮沸后轉(zhuǎn)為文火煎煮20 min，合并2 次煎煮的藥液，投入液體濃縮機(jī)，濃縮至所需濃度備用。

2.3 小柴胡湯含藥血清的制備 10 只大鼠隨機(jī)分為中藥組和對(duì)照組。小柴胡湯灌胃劑量依據(jù)人與大鼠體表面積換算得到為7.02 g／kg，對(duì)照組給予生理鹽水，每天早晚各灌胃1 次，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，大鼠腹腔注射水合氯醛（350 mg／kg） 麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置0.5 h。4 ℃、3 000 r／min 離心10 min，取血清，同組大鼠血清合并混勻，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜無菌過濾，收集濾液，無菌封裝，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｐ〔窈鷾幯褰?jīng)測(cè)定原始質(zhì)量濃度為6 521.58 μg／mL。

2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 按照試劑盒使用說明書，在待測(cè)細(xì)胞孔中每孔加入10 μL MTT 試劑（終質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL），輕輕混合后在34 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL Formazan 增溶溶液，將孔板置于搖床上輕輕搖晃10 min 以溶解甲臜結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。

2.5 CPE 法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 將藥物或病毒接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層MDCK，于36 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，以藥物或病毒的最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變?yōu)榻K點(diǎn)，記錄病變情況與孔數(shù)（CPE＞50%為病變，CPE＜50%為非病變），見圖1。

圖1 MDCK 不同形態(tài)觀察（×200）

2.6 半數(shù)中毒濃度（TC50） 測(cè)定 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、長(zhǎng)成單層的MDCK 用EDTA-胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，用細(xì)胞生長(zhǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為8×105／mL，接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于36 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，形成單層細(xì)胞備用。小柴胡湯含藥血清從6 521.58 μg／mL 倍比稀釋至50.95 μg／mL 共8 個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)稀釋度均重復(fù)4孔，于34 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照“2.4” 項(xiàng)下MTT 法測(cè)定各孔吸光度值，并計(jì)算TC50及細(xì)胞存活率。

2.7 半數(shù)有效濃度（EC50） 測(cè)定 將流感病毒A （H1N1）pdm09、H3N2、BV、BY 4 種亞型株連續(xù)10 倍遞次稀釋成1×10-1～1×10-6后，將各稀釋度病毒接種于MDCK 中，每個(gè)稀釋度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，于34 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照，48 h 后觀察病變孔數(shù)，用Reed-Muench法計(jì)算流感病毒4 種亞型株的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（median tissue culture infective dose，TCID50）。在小柴胡湯含藥血清對(duì)MDCK 的TC50范圍內(nèi)，加入50 μL 配制好的100 TCID50流感病毒4 種亞型病毒液，再加入不同質(zhì)量濃度小柴胡湯含藥維持液，每孔50 μL，于34 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每一藥物濃度均重復(fù)4 孔，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照、空白血清對(duì)照、陽(yáng)性藥物對(duì)照。按照“2.4” 項(xiàng)下MTT 法測(cè)定各孔吸光度值，并計(jì)算EC50、病毒抑制率及治療指數(shù)（therapeutic index，TI），公式為TI＝TC50／EC50。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 及Excel 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，細(xì)胞存活率與藥物濃度之間的關(guān)系用Probit 回歸進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小柴胡湯含藥血清對(duì)MDCK 的TC50小柴胡湯含藥血清質(zhì)量濃度從6 521.58 μg／mL 稀釋至50.95 μg／mL 等8 個(gè)質(zhì)量濃度時(shí)，細(xì)胞存活率從15.95% 升高至95.27%，細(xì)胞存活率和藥物質(zhì)量濃度呈反比。未用小柴胡湯含藥血清處理的正常細(xì)胞存活率為100%。用Probit 回歸法統(tǒng)計(jì)分析，小柴胡湯含藥血清對(duì)MDCK 的TC50為3 533.59 μg／mL，磷酸奧司他韋的TC50為1 226.62 μg／mL，見圖2。

圖2 小柴胡湯含藥血清和磷酸奧司他韋對(duì)MDCK 的細(xì)胞毒性作用

3.2 小柴胡湯含藥血清的EC50用Reed-Muench 法計(jì)算得流感病毒A （H1N1） pdm09、H3N2、BV、BY 4 種亞型株的TCID50分別為1×10-3.1、1×10-2.8、1×10-2.8、1×10-3.0。在小柴胡湯含藥血清對(duì)MDCK 的TC50范圍內(nèi)，病毒抑制率與小柴胡湯含藥血清質(zhì)量濃度呈正相關(guān) ［rA（H1N1）pdm09＝0.719，P＜0.001；rH3N2＝0.709，P＝0.001；rBV＝0.703，P＝0.001；rBY＝0.878，P＜0.001］。在小柴胡湯含藥血清質(zhì)量濃度為1 630.40 μg／mL 時(shí)，對(duì)流感病毒4 種亞型株的抑制率分別為79.46%、88.16%、54.28%、57.38%；當(dāng)質(zhì)量濃度低至50.95 μg／mL 時(shí)，抑制率分別為 22.22%、33.20%、12.83%、11.15%。小柴胡湯含藥血清對(duì)流感病毒4 種亞型株的EC50分別為288.12、173.90、1 037.85、1 107.27 μg／mL，TI 分別為12.26、20.32、3.40、3.19。磷酸奧司他韋膠囊的EC50分別為316.54、155.77、111.28、197.74 μg／mL，TI 分別為3.88、7.87、11.02、6.20，見表1～3。

表1 小柴胡湯含藥血清對(duì)流感病毒4 種亞型株的抑制作用（±s，n＝4）

表1 小柴胡湯含藥血清對(duì)流感病毒4 種亞型株的抑制作用（±s，n＝4）

注：與50.95 μg／mL 小柴胡湯含藥血清組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

小柴胡湯含藥血清／（μg·mL-1）抑制率／%A（H1N1）pdm09H3N2BV BY 1 630.4079.46±0.15▲▲88.16±0.24▲▲54.28±0.12▲▲57.38±0.05▲▲815.2063.64±0.14▲▲75.10±0.18▲47.77±0.02▲▲44.26±0.06▲▲407.6056.23±0.16▲62.55±0.1239.03±0.17▲36.07±0.03▲▲203.8045.29±0.1350.77±0.1131.60±0.0826.89±0.09▲101.9033.22±0.0439.38±0.1223.54±0.0718.03±0.05 50.9522.22±0.1633.20±0.1812.83±0.1211.15±0.05

表2 磷酸奧司他韋對(duì)流感病毒4 種亞型株的抑制作用（±s，n＝4）

表2 磷酸奧司他韋對(duì)流感病毒4 種亞型株的抑制作用（±s，n＝4）

磷酸奧司他韋／（μg·mL-1）抑制率／%A（H1N1）pdm09H3N2BVBY 937.502.29±0.0016.40±0.0816.56±0.237.08±0.00 468.7545.14±0.0052.71±0.0174.49±0.3158.86±0.00 234.3852.57±0.0554.65±0.0266.23±0.0454.77±0.00 117.1945.43±0.0548.53±0.0651.72±0.2239.78±0.00 58.5941.14±0.0042.05±0.0540.77±0.1135.29±0.01

表3 小柴胡湯含藥血清和磷酸奧司他韋對(duì)流感病毒4 種亞型株的抑制作用

4 討論

我國(guó)中藥自然資源豐富，在防治病毒性疾病尤其是流感方面已取得較大成就［13-15］。顏海燕等［16］研究發(fā)現(xiàn)熱毒寧注射液對(duì)流感病毒多個(gè)亞型有抑制作用；徐國(guó)雙等［17］研究表明小槐花提取物能有效阻抑流感病毒；趙利華等［18］研究發(fā)現(xiàn)清開靈注射液在體外有拮抗流感病毒H1N1、H5N1、H7N9 3 種亞型的作用。

小柴胡湯由柴胡、黃芩、半夏、人參、生姜、甘草、大棗7 味藥材組成，是和解少陽(yáng)的代表方劑［19-20］。黃芩、甘草等單味中藥和連花清瘟膠囊、雙黃連制劑等復(fù)方藥物已應(yīng)用于臨床［21］。為了確定小柴胡湯含藥血清的抗流感病毒作用，本研究使用流感病毒敏感細(xì)胞MDCK 進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察小柴胡湯含藥血清對(duì)流感病毒A （H1N1）pdm09、H3N2、BV、BY 4 種亞型株的抗病毒作用。研究發(fā)現(xiàn)小柴胡湯含藥血清對(duì)4 種流感病毒亞型株均有抗病毒作用，表現(xiàn)為病毒抑制率隨著藥物質(zhì)量濃度的增加而增加，呈正相關(guān)作用，但對(duì)4 種流感病毒亞型株的病毒抑制率不同，其中對(duì)甲型流感病毒株的病毒抑制率高于乙型流感病毒株，原因可能是小柴胡湯含藥血清對(duì)2 種類型病毒的敏感性不同。小柴胡湯含藥血清對(duì)MDCK 的TC50為3 533.59 μg／mL，磷酸奧司他韋的TC50為1 226.62 μg／mL，提示小柴胡湯含藥血清的毒性小于磷酸奧司他韋。小柴胡湯含藥血清對(duì)4 種流感病毒亞型株的EC50分別為288.12、173.90、1 037.85、1 107.27 μg／mL，表明小柴胡湯含藥血清對(duì)甲型流感病毒株的抑制效果優(yōu)于乙型流感病毒株。小柴胡湯含藥血清對(duì)4 種流感病毒亞型株的TI 分別為12.26、20.32、3.40、3.19，而磷酸奧司他韋的TI 分別為3.88、7.87、11.02、6.20，結(jié)果表明小柴胡湯含藥血清對(duì)甲型流感病毒的治療指數(shù)和安全性均高于磷酸奧司他韋。

綜上所述，小柴胡湯含藥血清在體外能有效抑制流感病毒，具有抗流感病毒作用，但其有效成分與抗病毒作用的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。