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      鳶尾苷元通過(guò)miR-449a 調(diào)控JAK/STAT 信號(hào)通路對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響

      2023-09-19 02:45:38張夢(mèng)婕黃聯(lián)杰
      中成藥 2023年9期
      關(guān)鍵詞:鳶尾牙周炎纖維細(xì)胞

      杜 姣,張夢(mèng)婕,黃聯(lián)杰

      (武漢存濟(jì)口腔醫(yī)院綜合科,湖北 武漢 430020)

      牙周炎是臨床常見(jiàn)的一種細(xì)菌感染性疾病,其可破壞口腔牙周組織進(jìn)而影響牙槽骨的吸收,人牙齦成纖維細(xì)胞是牙齦的主要組成細(xì)胞,牙齦成纖維細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等均可引起牙周炎的發(fā)生。研究表明唑來(lái)膦酸、柚皮素等可調(diào)控牙齦成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及成骨分化等過(guò)程[1-2]。鳶尾苷元是一種異黃酮類化合物,其含有3 個(gè)酚羥基與1 個(gè)甲氧基,為葛花的有效成分,研究表明其具有抗氧化、炎癥等作用[3],但其對(duì)牙周炎的治療效果及可能作用機(jī)制尚未闡明。微小RNA (miRNA) 在牙齦成纖維細(xì)胞中異常表達(dá),并可能調(diào)控炎癥反應(yīng)進(jìn)而參與牙周炎的發(fā)生過(guò)程[4]。微小RNA-449a (miR-449a) 在腦缺血再灌注損傷中表達(dá)降低,丹酚酸A 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-499a/DDK1 抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷[5]。JAK/STAT 信號(hào)通路可介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程,一旦激活后可明顯誘導(dǎo)炎癥因子的聚集從而加重細(xì)胞損傷[6]。但miR-449a 和JAK/STAT 信號(hào)通路是否可介導(dǎo)鳶尾苷元調(diào)控牙齦成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的過(guò)程尚未可知。因此,本研究主要探討鳶尾苷元對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響,探究其對(duì)miR-449a 表達(dá)和JAK/STAT 信號(hào)通路的調(diào)控作用。

      1 材料

      1.1 牙齦組織來(lái)源 收集2018 年2 月至2019 年8 月于本院診治的青少年的牙齦組織,拔除智齒時(shí)切取少量無(wú)炎癥牙齦組織,患者共25 例,其中男性15 例,女性10 例;年齡18~25 歲,平均年齡(23.12±3.15) 歲,牙齦組織于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。使用含有青鏈霉素雙抗的PBS洗滌牙齦組織,采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)[7],得人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)(批號(hào)20180019)。

      1.2 藥物與試劑 鳶尾苷元(純度≥98%,批號(hào)20191203,成都格利普生物科技有限公司);Lipofectamine2000 (美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司);TRIzol 試劑(美國(guó)Invitrogen公司);cDNA 合成與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RTqPCR) 試劑[天根生化科技(北京) 有限公司];甲基噻唑基四唑(MTT) 試劑、凋亡檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔抗人細(xì)胞周期蛋白1 (Cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (cleaved caspase-3)抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司);兔抗人磷酸化Janus 激酶(p-JAK)、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(p-STAT) 抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

      2 方法

      2.1 分組與給藥 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGFs (1×105/mL) 接種于96 孔板,每孔100 μL,分別加入含不同濃度(50、100、200 μmol/L) 鳶尾苷元的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h[8],分別記作鳶尾苷元低、中、高劑量組,同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。分別將miR-NC、miR-449a mimics、anti-miR-NC、anti-miR-449a 轉(zhuǎn)染至HGFs,分別記作miR-NC 組、miR-449a 組、anti-miR-NC 組、anti-miR-449a 組。分別將antimiR-NC、anti-miR-449a 轉(zhuǎn)染至HGFs 后加入含200 μmol/L鳶尾苷元的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,分別記作鳶尾苷元+antimiR-NC 組、鳶尾苷元+anti-miR-449a 組。

      2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGFs (1×105/mL) 接種于96 孔板,每孔100 μL,按“2.1” 項(xiàng)下分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔分別加入MTT 溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清后每孔加入DMSO 150 μL,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(A) 值,以A值間接表示細(xì)胞活力。

      2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組HGFs,加入預(yù)冷PBS 洗滌后棄上清,加入500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后按照凋亡試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

      2.4 RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞miR-449a表達(dá) 收集各組HGFs,采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng),按照試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)體系并設(shè)置反應(yīng)條件,應(yīng)用羅氏LightCycler480 熒光定量PCR 儀檢測(cè)miR-449a相對(duì)表達(dá)量。

      2.5 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞Cyclin D1、cleaved caspase-3、p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá) 收集各組HGFs,用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白,SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉2 h,分別孵育一抗(1 ∶1 000) 與二抗(1 ∶5 000),暗室內(nèi)曝光顯影后應(yīng)用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

      2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料均符合正態(tài)分布,以(±s) 表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      3 結(jié)果

      3.1 鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與對(duì)照組比較,鳶尾苷元各劑量組細(xì)胞活力和Cyclin D1 蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均升高(P<0.05),見(jiàn)圖1、表1。

      表1 鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響(±s,n=9)

      表1 鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響(±s,n=9)

      注:與對(duì)照組比較,*P<0.05。

      組別Cyclin D1cleaved caspase-3A 值凋亡率/%對(duì)照組0.86±0.080.32±0.030.986±0.097.13±0.64鳶尾苷元低劑量組0.72±0.06*0.48±0.04*0.765±0.08*13.16±1.05*鳶尾苷元中劑量組0.58±0.05*0.72±0.07*0.536±0.05*18.93±1.73*鳶尾苷元高劑量組0.41±0.04*0.79±0.06*0.457±0.04*25.43±2.34*

      圖1 鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞凋亡(A) 及Cyclin D1、cleaved caspase-3 蛋白(B) 的影響

      3.2 鳶尾苷元對(duì)HGFs 中miR-449a表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,鳶尾苷元各劑量組miR-449a表達(dá)升高(P<0.05),見(jiàn)表2。

      表2 鳶尾苷元對(duì)HGFs 中miR-449a 表達(dá)的影響(±s,n=9)

      表2 鳶尾苷元對(duì)HGFs 中miR-449a 表達(dá)的影響(±s,n=9)

      注:與對(duì)照組比較,*P<0.05。

      組別miR-449a對(duì)照組1.00±0.11鳶尾苷元低劑量組1.57±0.12*鳶尾苷元中劑量組2.24±0.21*鳶尾苷元高劑量組2.64±0.23*

      3.3miR-449a對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較,miR-449a 組細(xì)胞活力及Cyclin D1 蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),凋亡率、miR-449a表達(dá)及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均升高 (P<0.05)。與anti-miR-NC 組比較,antimiR-449a 組細(xì)胞活力及Cyclin D1 蛋白表達(dá)均升高 (P<0.05),凋亡率、miR-449a表達(dá)及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),見(jiàn)圖2、表3。

      表3 miR-449a 對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響(±s,n=9)

      表3 miR-449a 對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響(±s,n=9)

      注:與miR-NC 組比較,*P<0.05;與anti-miR-NC 組比較,#P<0.05。

      組別miR-449aCyclin D1cleaved caspase-3A 值凋亡率/%miR-NC 組1.00±0.100.88±0.080.33±0.030.991±0.097.23±0.71 miR-449a 組1.85±0.14*0.41±0.04*0.76±0.07*0.506±0.05*20.64±1.82*anti-miR-NC 組1.01±0.090.84±0.070.31±0.020.983±0.087.14±0.62 anti-miR-449a 組0.38±0.03#1.13±0.10#0.08±0.01#1.286±0.11#3.04±0.27#

      圖2 miR-449a 對(duì)HGFs 細(xì)胞凋亡(A) 及Cyclin D1、cleaved caspase-3 蛋白(B) 的影響

      3.4anti-miR-449a逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較,鳶尾苷元+antimiR-449a 組細(xì)胞活力及Cyclin D1 蛋白表達(dá)均升高 (P<0.05),凋亡率、miR-449a表達(dá)及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),見(jiàn)圖3、表4。

      表4 anti-miR-449a 逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響(±s,n=9)

      表4 anti-miR-449a 逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響(±s,n=9)

      注:與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較,*P<0.05。

      組別miR-449aCyclin D1cleaved caspase-3A 值凋亡率/%鳶尾苷元+anti-miR-NC 組1.00±0.100.43±0.040.81±0.070.447±0.0424.13±2.14鳶尾苷元+anti-miR-449a 組0.40±0.04*0.82±0.08*0.38±0.03*0.861±0.07*11.58±1.24*

      圖3 anti-miR-449a 逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞凋亡(A) 及Cyclin D1、cleaved caspase-3 蛋白(B) 的影響

      3.5miR-449a及鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞JAK/STAT 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,200 μmol/L 鳶尾苷元組p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與anti-miRNC 組比較,anti-miR-449a 組p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較,鳶尾苷元+anti-miR-449a 組p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)升高 (P<0.05),見(jiàn)圖4、表5。

      表5 miR-449a 及鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞p-JAK、p-STAT蛋白表達(dá)的影響(±s,n=9)

      表5 miR-449a 及鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞p-JAK、p-STAT蛋白表達(dá)的影響(±s,n=9)

      注:與對(duì)照組比較,*P <0.05;與anti-miR-NC 組比較,#P <0.05;與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較,&P<0.05。

      組別p-JAKp-STAT對(duì)照組0.73±0.060.62±0.05鳶尾苷元組0.33±0.03*0.28±0.02*anti-miR-NC 組0.74±0.060.63±0.06 anti-miR-449a 組1.11±0.10#0.93±0.09#鳶尾苷元+anti-miR-NC 組0.31±0.030.26±0.02鳶尾苷元+anti-miR-449a 組0.65±0.06&0.57±0.04&

      圖4 各組細(xì)胞p-JAK、p-STAT 蛋白條帶圖

      4 討論

      牙周炎發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,牙周組織再生對(duì)治療牙周炎具有重要意義,牙周組織再生、修復(fù)等與牙齦成纖維細(xì)胞增殖、遷移及分化等密切相關(guān),既往研究顯示脂聯(lián)素、硝苯地平等均可影響牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性,但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明[9-10]。miRNA 可能作為牙周炎治療的潛在靶標(biāo)[11]。但關(guān)于藥物與miRNA 在治療牙周炎中的作用機(jī)制也尚未闡明。

      鳶尾苷元具有清除氧自由基、降血糖等作用,還可減輕急性心肌梗死小鼠的心肌損傷[12];可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13];可抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)從而減輕小鼠急性肺損傷[14]。本研究結(jié)果顯示,鳶尾苷元可降低細(xì)胞活力,提高細(xì)胞凋亡率,提示鳶尾苷元可促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞凋亡。

      miR-449a可通過(guò)調(diào)節(jié)高遷移率族框蛋白1 抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖、遷移和炎癥反應(yīng)[15];還可調(diào)控AREG 減輕腦缺血損傷[16]。本研究結(jié)果顯示,鳶尾苷元可提高miR-449a表達(dá);miR-449a過(guò)表達(dá)可降低細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而抑制miR-449a表達(dá)可提高細(xì)胞活力,抑制細(xì)胞凋亡,提示miR-449a過(guò)表達(dá)可抑制牙齦成纖維細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究顯示,鳶尾苷元與anti-miR-449a共處理后可增強(qiáng)細(xì)胞活力,降低細(xì)胞凋亡率,提示抑制miR-449a表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs細(xì)胞增殖及凋亡的作用。JAK 與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后發(fā)生磷酸化,STAT 與受體結(jié)合后在p-JAK 的催化下形成p-STAT,其可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌及生成,進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17-19]。本研究結(jié)果顯示,鳶尾苷元可降低HGFs中p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá);抑制miR-449a表達(dá)可促進(jìn)p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá);且抑制miR-449a表達(dá)可逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)的抑制作用,提示鳶尾苷元可能通過(guò)調(diào)控miR-449a而抑制JAK/STAT 信號(hào)通路的活化從而發(fā)揮作用。

      綜上所述,鳶尾苷元可抑制HGFs 細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制與上調(diào)miR-449a表達(dá)及抑制JAK/STAT信號(hào)通路活化有關(guān),可為進(jìn)一步闡明牙周炎發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),還可為揭示鳶尾苷元治療牙周炎的分子機(jī)制提供參考。

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