蘆根親水共有成分及解酒護(hù)肝的“譜-效-味” 關(guān)系研究

陳光宇，瞿昊宇，謝夢洲，孫 晶，范 蓓，王鳳忠

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點(diǎn)研究室，湖南 長沙 410208）

目前對蘆根、蘆根提取物及單體的研究主要集中于水煎液［1-2］、多糖［3-4］、水提干浸膏粉［5-6］、大孔樹脂提取物［7］、硅膠柱色譜純化的非極性單體［8］，而關(guān)于強(qiáng)極性的親水性單體報(bào)道則相對較少。這是因?yàn)槟壳暗纳V分離體系中，應(yīng)用較多的分析填料主要是適合分離醇溶性化合物的十八烷基硅烷鍵合硅膠，應(yīng)用較多的分離填料主要是適合分離脂溶性化合物的硅膠、氧化鋁等。然而，對于蘆根及提取物，特別是鮮蘆根，其經(jīng)典用藥形式為水煎湯劑［9］，其活性多糖分子量、低聚糖及單糖組成、結(jié)構(gòu)尚不清楚，對于建立活性單體定量指標(biāo)缺乏依據(jù)。故尋找強(qiáng)極性活性成分，對于蘆根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)、藥食同源產(chǎn)品、復(fù)方制劑開發(fā)具有重要意義。

近年來，親水色譜串聯(lián)質(zhì)譜［10-11］、分子排阻色譜［12-13］等新型方法對于藥食同源、鮮藥、中藥中強(qiáng)極性成分具有更好的保留作用，可以很好地對植物氨基酸、多糖、苷類、肽類等成分進(jìn)行表征。本研究根據(jù)特有性、有效性、傳遞與溯源、可測性、配伍環(huán)境等五原則［14］，對強(qiáng)極性親水性化學(xué)成分改進(jìn)分析方法，擴(kuò)展分析范圍，建立“譜-效-味” 相關(guān)數(shù)據(jù)庫具有重要意義，以期為藥食同源、鮮藥、中藥成分分析提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 Exion LC AD 型超高效液相色譜儀、X-500R 型飛行時(shí)間四極桿質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；Ultimate 型液相色譜儀，配紫外、示差折光檢測器（美國Thermo 公司）；SA402B 型電子舌（日本Insent 公司）；DM 1000 型顯微鏡 （德國Leica 公司）；iMaik 型酶標(biāo)儀 （美國 Bio-Rad公司）。

1.2 試劑 葡聚糖T100 （批號H29M11B114192）、葡聚糖T50 （批號H23S11B125400）、葡聚糖T20（批號 M01GS142715）、葡聚糖 T10 （批號A19GS145781）、葡聚糖T5 （批號N08GS166773）、葡聚糖T2 （批號H21S8B44410）、葡聚糖T1 （批號A14GS157734） 對照品，純度＞98%，均購自上海源葉生物科技有限公司。ALT、AST、LDH、TG、VLDL ELISA 試劑盒均購自江蘇晶美生物科技有限公司。乙腈（批號18100306LM01）、甲醇（批號17111204LM01） 均為色譜純，購自瑞典Oceanpak公司；無水乙醇購自上海沃凱生物技術(shù)有限公司；水為超純水。

1.2 動物 SPF 級湖南大鼠98 只，體質(zhì)量（240±10） g，4～6 周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （湘）2020-0002。所有大鼠均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物房，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（25±1）℃，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，觀察其一般狀況。本研究獲得湖南中醫(yī) 藥 大 學(xué) 動 物 倫 理 委 員 會 批 準(zhǔn)（LL2021061602）。

1.3 藥物 蘆根鮮品均由湖南省音爽生物科技有限公司提供，經(jīng)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)王智副教授鑒定為禾本科植物蘆葦PhragmitescommunisTrin.的新鮮根莖，樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息Tab．1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆根鮮品、飲片及水煎濾液、蘆根水提凍干粉及水提液的制備與收率

2.1.1 蘆根鮮品水煎濾液制備 稱取蘆根鮮品（S3） 185 g，用水煎煮2 次，每次1 h，合并濾液，加水將濾液定容至1 000 mL，即得。

2.1.2 蘆根飲片水煎濾液制備 取蘆根鮮品（S1～S12），除去雜質(zhì)，洗凈，切段，45 ℃鼓風(fēng)干燥6 h，即得蘆根飲片。稱取50 g，用水煎煮2 次，每次1 h，合并濾液，加純化水將濾液定容至1 000 mL，即得。

2.1.3 蘆根水提凍干粉及水提液制備 取蘆根飲片（S3） 50 g，用水煎煮2 次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮，冷凍干燥，得蘆根水提凍干粉。稱取凍干粉10 g，加水定容至1 000 mL，超聲處理（功率200 W，頻率50 kHz） 60 min，放冷，即得。

2.1.4 蘆根鮮品-飲片-水提凍干粉的收率 蘆根由鮮品制備成飲片收率為27.14%，由鮮品制備成水提凍干粉收率為5.44%，由飲片制備成水提凍干粉收率為20.05%，即185 g 蘆根鮮品可得50 g蘆根飲片，可得10 g 蘆根水提凍干粉。

2.2 反相／親水色譜串聯(lián)四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析蘆根共有成分

2.2.1 反相色譜空白對照溶液制備 取超純水，12 000 r／min 離心10 min，即得。

2.2.2 親水色譜空白對照溶液制備 取80% 乙腈，12 000 r／min 離心10 min，即得。

2.2.3 反相色譜供試品溶液制備 取“2.1” 項(xiàng)下蘆根鮮品水煎濾液、蘆根飲片水煎濾液、蘆根水提凍干粉水提液，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，即得蘆根鮮品供試品溶液、蘆根飲片供試品溶液，蘆根水提凍干粉供試品溶液。

2.2.4 親水色譜供試品溶液制備 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液各1 mL，置于10 mL 離心管中，加80% 乙腈定容至10 mL，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2.5 反相色譜條件 WATERS ACQUITY UPLC＠BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0～10 min，10% A；10～45 min，10%～90% A；45～49 min，90%A；49～50 min，90%～10%A；50～60 min，10%A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.6 親水色譜條件 WATERS ACQUITY UPLC＠BEH Amid 色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相乙腈 （A）-水 （B），梯度洗脫 （0～10 min，100%A；10～20 min，100%～70%A；20～30 min，70%A；30～32.5 min，70%～100%A；32.5～45 min，100% A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.7 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m／z100～1 000；噴霧電壓5 500、-4 500 V；霧化氣溫度550 ℃；氣簾氣35 psi （1 psi＝6.895 kPa）；輔助氣、霧化氣50 psi；碰撞能量（35±15） eV。TOF／MS 一級預(yù)掃描、TOF／MS／MS 二級掃描離子累積時(shí)間分別為100、1 150 ms，觸發(fā)二級掃描的方法為信息依賴掃描（IDA），條件為多重質(zhì)量虧損（MMDF）、動態(tài)背景扣除（DBS），滿足者優(yōu)先進(jìn)行。

各供試品溶液總離子流圖（反相負(fù)離子） 見圖1。

圖1 蘆根的UPLC-Q-TOF-MS／MS 總離子流圖Fig．1 Total ion flow diagram of UPLC-Q-TOF-MS／MS for Phragmitis Rhizoma

2.2.8 結(jié)果 共得到290 種成分，通過Cytoscape 3.7.1 軟件找出25 種共有成分，再與蘆根鮮品、蘆根水提凍干粉比較篩選出12 種共有成分，見圖2，各共有成分峰面積（n＝3） 情況見圖3。

圖2 蘆根的UPLC-Q-TOF-MS／MS 共有成分分析Fig．2 Common compounds in UPLC-Q-TOF-MS／MS analysis of Phragmitis Rhizoma

圖3 蘆根的UPLC-Q-TOF-MS／MS 共有成分峰面積（n＝3）Fig．3 Peak areas of common compounds in UPLC-Q-TOF-MS／MS analysis of Phragmitis Rhizoma （n＝3）

由圖3 可知，對香豆酸、對羥基苯甲醛、L-天冬氨酸、異阿魏酸含量較高。蘆根鮮品制備成蘆根飲片后，金線蓮苷、次黃嘌呤、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、谷氨酸、芹菜素、阿魏酸、leucosceptoside A、洋川芎內(nèi)酯A、秦皮素、馬錢子堿、異鼠李素、L-焦谷氨酸、L-色氨酸、苯丙氨酸、L-絡(luò)氨酸、D-蘇氨酸、L-絲氨酸、天冬氨酸、精氨酸、組氨酸這20 種成分含量減少；蘆根飲片制備成蘆根水提凍干粉后，咖啡酸、維生素B2、（-）-松脂素、D-哌啶酸、山梨糖醇、脯氨酸、腺嘌呤、鳥嘌呤這8 種成分含量減少，高香草酸、2-吲哚甲酸、肉桂酸、異夏佛塔苷、尼泊金甲酯、京尼平苷、4-羥基香豆素、紅車軸草素-7-O-D-葡萄糖苷、橙皮苷、棕矢車菊素、芒柄花素、姜糖脂B這12 種成分含量增加。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理-分子對接技術(shù)預(yù)測蘆根共有成分活性 參考文獻(xiàn)［15-16］報(bào)道，利用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測蘆根共有成分作用于157 個(gè)靶點(diǎn)，選擇其中度值排名前二十的作用靶點(diǎn)，通過KEGG 預(yù)測可以作用于57 條通路，其中可以從AKT1、NFKB1、TLR4 靶點(diǎn)調(diào)控酒精性肝疾病信號通路，見圖4。再根據(jù)AKT1 （7nh4） 靶點(diǎn)蛋白計(jì)算蘆根共有成分結(jié)合能大小，作為其活性評價(jià)依據(jù)，部分成分結(jié)合情況見圖5，11 種成分結(jié)合能見表2。分子對接結(jié)果顯示，腺苷環(huán)磷酸酯、鳥嘌呤核糖苷-3，5-環(huán)磷酸酯、刺五加苷E、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5 等4 種成分有相對較高活性。

圖4 蘆根共有成分在酒精性肝疾病信號通路中作用靶點(diǎn)Fig．4 Target effects of common compounds from Phragmitis Rhizoma in signalling pathway of alcoholic liver disease

圖5 對香豆酸與AKT1 靶點(diǎn)蛋白結(jié)合情況Fig．5 Binding between p-coumaric acid and AKT1 target protein

表2 蘆根共有成分與靶蛋白AKT1 的結(jié)合能Tab．2 Binding energy of target protein AKT1 with common compounds of Phragmitis Rhizoma

2.4 基于分子排阻色譜串聯(lián)示差折光法分析蘆根中糖類成分分子量

2.4.1 空白溶液制備 取超純水，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4.2 對照品溶液制備 制備質(zhì)量濃度為10.11、10.35、10.21、10.32、10.04、11.32、10.01 mg／mL的葡聚糖T100、葡聚糖T50、葡聚糖T20、葡聚糖T10、葡聚糖T5、葡聚糖T2、葡聚糖T1 （分子量分別為100、50、20、10、5、2、1 kDa） 的照品溶液。

2.4.3 供試品溶液制備 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4.4 分子排阻色譜條件 Shodex SUGAR KS-804色譜柱（8.0 mm×300 mm，7 μm）；流動相水；體積流量0.5 mL／min；柱溫50 ℃；進(jìn)樣量10 μL；示差折光檢測，色譜圖見圖6。

圖6 蘆根分子排阻色譜圖Fig．6 Molecular exclusion chromatogram of Phragmitis Rhizoma

2.4.7 分子排阻色譜結(jié)果分析 蘆根多糖的分子量集中分布在1～2 kDa 及100～200 kDa 這2 個(gè)區(qū)間段，其中糖類共有成分分子量為1 600、1 000 Da （命名為蘆根多糖1600、1000），蘆根飲片經(jīng)過水煎濃縮冷凍干燥為干浸膏粉過程中，蘆根多糖1600 相對峰面積減少，而蘆根多糖1000 相對峰面積小幅度增加，結(jié)果見圖7。

圖7 蘆根分子排阻共有峰面積（n＝3）Fig．7 Common peak areas in molecular exclusion chromatogram of Phragmitis Rhizoma （n＝3）

2.5 電子舌分析蘆根滋味

2.5.1 供試品溶液制備 取“2.2.3” 項(xiàng)下供試品溶液，即得。

2.5.2 電子舌分析條件 數(shù)據(jù)采集前，對電子舌進(jìn)行傳感器活化、校準(zhǔn)等操作，確保檢測數(shù)據(jù)的可靠性與穩(wěn)定性。將50 mL 濾液置于電子舌專用容器中，樣品采集與清洗交替進(jìn)行。樣品測定時(shí)間為90 s，采集周期1.0 s，采集延遲0 s，攪拌速率1 r／s，清洗（基準(zhǔn)液） 時(shí)間336 s，截止時(shí)間20 s。

2.5.3 分析方法 檢測環(huán)境溫度為室溫，每個(gè)樣品除甜味測定5 次外，其余均測定4 次，選取后3次穩(wěn)定的電子舌響應(yīng)值取平均值進(jìn)行分析。

2.5.4 電子舌雷達(dá)圖 見圖8。

圖8 蘆根的電子舌雷達(dá)圖（n＝3）Fig．8 Electronic tongue radar map of Phragmitis Rhizoma （n＝3）

2.5.5 結(jié)果分析 蘆根鮮品制備成蘆根飲片后，酸味、苦味和苦味回味值增加，甜味值、澀味值、鮮味、咸味值減小。蘆根飲片經(jīng)過水煎濃縮冷凍干燥為凍干粉后，甜味值增加，澀味、鮮味值基本不變，酸味值小幅度減小，苦味和苦味回味值大幅度減小。

2.6 蘆根飲片水煎濾液對急性酒精性肝損傷大鼠的影響 參照文獻(xiàn)［7］ 報(bào)道，制備蘆根飲片水煎濃縮湯劑，大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、給藥組（S1～S12），每組7 只，各組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物10 mL／kg，每天1 次，空白組、模型組灌胃給予等體積純化水，連續(xù)灌胃14 d。模型組、給藥組于第15 天一次性灌胃給予50%乙醇14 mL／kg，空白組給予等體積純化水，禁食16 h。各組大鼠腹腔注射60 mg／kg 的戊巴比妥鈉溶液麻醉后腹主動脈取血，并取肝組織。

2.6.1 大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)結(jié)果 將各組大鼠肝臟左葉保存在10%福爾馬林溶液中固定，經(jīng)過乙醇脫水、石蠟包埋后，每片肝組織制成5 μm 超薄切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木精、伊紅染色，在顯微鏡下連續(xù)觀察整張組織切片中脂滴在肝臟的分布范圍和面積，結(jié)果見圖9。由此可知，空白組大鼠肝細(xì)胞較為清晰，肝細(xì)胞索整齊有序，顏色鮮艷，胞漿內(nèi)未現(xiàn)脂滴，肝組織未現(xiàn)異常；與空白組比較，模型組大鼠肝細(xì)胞較為模糊，肝細(xì)胞索紊亂，肝細(xì)胞呈現(xiàn)多處脂滴，隨有炎細(xì)胞浸潤，表明一次性給予大量酒精對大鼠肝臟造成損傷；與模型組比較，各給藥組大鼠肝細(xì)胞均可見有一定炎癥細(xì)胞浸潤，但S4～S5、S7～S9 組大鼠肝細(xì)胞脂滴減少，肝索排列較為整齊，結(jié)構(gòu)趨于正常。

圖9 各組大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)Fig．9 Pathological morphology of rat liver in each group

2.6.2 大鼠血清ALT、AST、LDH、TG、VLDL 水平 將大鼠血液于4 ℃、4 000 r／min 離心15 min，取上清液，嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書操作，檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、甘油三酯（TG）、極低密度脂蛋白（VLDL） 水平，結(jié)果見圖10。與空白組比較，模型組大鼠血清 ALT、AST、LDH、TG、VLDL 水平升高（P＜0.05），表明造模成功；與模型組比較，S4、S7～S9 組ALT 水平降低 （P＜0.05），S4～S5、S7～S8 組AST 水平降低 （P＜0.05），各給藥組LDH 水平降低（P＜0.05），S4、S7、S9 組TG、VLDL 水平降低（P＜0.05）。

圖10 各組大鼠血清ALT、AST、LDH、TG、VLDL 水平（±s，n＝6）Fig．10 The serum levels of ALT，AST，LDH，TG，VLDL in rats of each group （±s，n＝6）

2.7 蘆根共有成分的“譜-效-味” 相關(guān)分析 以藥效評價(jià)指標(biāo)濃度為縱坐標(biāo)（Y），UPLC-Q-TOFMS／MS 共有成分峰、分子排阻共有峰面積、電子舌味覺值為橫坐標(biāo) （X），采用偏最小二乘法（PLS） 進(jìn)行相關(guān)分析，采用皮爾遜法進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見圖11。根據(jù)最小二乘法及皮爾遜相關(guān)分析，ΔALT、ΔAST 與腺苷環(huán)磷酸酯、鳥嘌呤核糖苷-3，5-環(huán)磷酸酯相關(guān)性極顯著，ΔLDH 與對香豆酸峰面積、酸味覺值相關(guān)性極顯著，ΔTG、ΔVLDL與蘆根多糖1600 峰面積、蔗糖含量相關(guān)性極顯著，ΔAST、ΔVLDL 還與甜味覺值相關(guān)性極顯著。

圖11 最小二乘法及皮爾遜相關(guān)分析蘆根共有成分的“譜-效-味” 結(jié)果Fig．11 Results of “spectrum-effect-taste” for common compounds of Phragmitis Rhizoma by PLS and pearson correlation analyses

3 討論

本研究在探索蘆根成分同時(shí)結(jié)合親水色譜、分子排阻色譜、藥效實(shí)驗(yàn)及電子舌味覺分析，拓展了傳統(tǒng)中藥“譜-效” 學(xué)范圍，建立了藥食同源類原料蘆根“譜-效-味” 相關(guān)分析數(shù)據(jù)庫，不僅可為蘆根親水性成分及質(zhì)量標(biāo)志物的尋找提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為藥食同源、鮮藥、中藥中親水性化學(xué)成分分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供了一條新思路。

蘆根多糖1600、腺苷環(huán)磷酸酯、鳥嘌呤核糖苷-3，5-環(huán)磷酸酯、刺五加苷E［17-19］、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5［20-22］等可作為蘆根活性成分，雖然蔗糖、葡萄糖、果糖、對香豆酸、L-天冬氨酸的特有性、有效性不強(qiáng)，但其在蘆根中有相對較高含量，也是蘆根重要組成成分。

對于蘆根多糖類成分，分子量在10 kDa 以上的活性遠(yuǎn)不如分子量在1～2 kDa 的，推測可能原因?yàn)槎嗵欠肿恿吭酱?，越不容易與靶蛋白結(jié)合，而多糖分子量太小又容易導(dǎo)致在胃、腸道中被分解、吸收，而難以分布到靶蛋白周圍［23］。

甜味值越高，糖類成分含量越高；酸味值越高，酚酸類成分峰面積越大，藥效越高。蘆根鮮品在制備成蘆根飲片后，氨基酸、苷類、生物堿、苯丙素類成分含量會降低，而氨基酸含量降低可能是導(dǎo)致鮮味值下降的原因［24］。在蘆根飲片制備成蘆根水提凍干粉后，生物堿、部分苯丙素、蘆根多糖1600 等成分含量會降低，而分子量小于1 kDa 的低聚糖、單糖等成分含量會增加，多糖分解為低聚糖、單糖可能是導(dǎo)致甜味增加的原因。

在本研究中，親水作用色譜供試品含量為反相色譜的10%，而所分析出成分?jǐn)?shù)量與反相色譜的相近，一方面說明親水色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法具有很高的靈敏度，這是因?yàn)橛H水作用色譜高比例有機(jī)相在質(zhì)譜中湮滅易產(chǎn)生“庫侖爆炸” 效應(yīng)從而帶有高電荷響應(yīng)［25］。另一方面說明親水色譜與反相色譜聯(lián)用，可以很好地改進(jìn)對強(qiáng)極性親水性化學(xué)成分分析方法，擴(kuò)展目前藥食同源、鮮藥、中藥成分分析的范圍。