幽門螺桿菌對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道黏膜炎癥的影響*

張夢麗，戈改真，丁瑞峰，王樂樂，忻曉霞，王兆霞

（1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 2.呼吸二科，3.消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一種異質(zhì)性肺疾病，以慢性呼吸道癥狀（呼吸困難、咳嗽、咳痰）為特征，是由于氣道異常（支氣管炎、細支氣管炎）和/或肺泡異常（肺氣腫）導(dǎo)致的持續(xù)性、通常是進行性的氣流阻塞[1]。大約全世界一半的人口均存在幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）感染，其與胃炎、胃潰瘍、胃癌等消化系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，被認為是一級致癌物。目前研究表明，Hp除與胃腸道疾病有關(guān)，還與胃腸外多系統(tǒng)疾病相關(guān)，包括呼吸系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[2]。Hp感染與COPD疾病有關(guān)，但是其機制并未闡明。COPD發(fā)病機制至今未完全明確，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)被認為與該病的發(fā)展密切相關(guān)。本研究擬觀察Hp對COPD大鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）炎癥因子白細胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白細胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）和腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）的影響，探討Hp是否會加重氣道炎癥，從而影響COPD疾病的發(fā)生、發(fā)展，以及Hp影響COPD的可能機制。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及動物

1.1.1 Hp菌株 采用國際統(tǒng)一的悉尼菌株1（SS1）標準菌株（山東大學(xué)提供）。

1.1.2 主要試劑 脂多糖（美國Sigma公司，貨號：L2880），IL-6（批號：20221206E7）、IL-8（批號：20221206C2）、TNF-α（批號：202212053V）酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（江蘇寶萊生物科技有限公司），香煙（云煙牌，焦油量11 mg，煙氣煙堿量1.1 mg），水合氯醛（北京伊塔生物科技有限公司，貨號：YT0533）。

1.1.3 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠25只，8周齡，體重（240±10）g [北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0030]。飼養(yǎng)溫度為22～24 ℃，相對濕度為35%～45%，晝夜時間均等，自由進食水。本實驗嚴格參照動物實驗倫理要求相關(guān)規(guī)定進行，且獲得醫(yī)院倫理委員會審批同意[批號：包醫(yī)倫審動物2021第（041）號]。

1.2 儀器與設(shè)備

C-400大鼠煙熏箱（上海晟廷生物科技有限公司）、AniRes2005肺功能儀（北京貝蘭博科技有限公司）、RT-6100酶標儀（美國Rayto公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 25只大鼠隨機分為Hp+ COPD組11只，COPD組11只，空白對照組3只。

1.3.2 復(fù)制COPD大鼠模型 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將Hp+COPD組與COPD組大鼠置于煙熏箱內(nèi)，每次10支煙，上下午各1次，每次煙熏1 h。第1、14天用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后，在動物喉鏡輔助下暴露聲帶，可視下灌入1 mg/mL 脂多糖溶液200 μL，旋轉(zhuǎn)大鼠，使LPS溶液均勻散布于兩肺?？瞻讓φ战M在第1、14天氣管內(nèi)滴注生理鹽水200 μL，其余時間不做任何處理。

1.3.3 COPD大鼠觀察指標 模型復(fù)制后4周，隨機選取COPD組大鼠3只和空白對照組大鼠3只，腹腔麻醉后剪開頸部皮膚，暴露氣管，連接小動物肺功能儀檢測肺功能，記錄用力肺活量（forced vital capacity,FVC）、0.3秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.3 second,FEV0.3）、0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（FEV0.3/FVC）、呼氣流量峰值（peak expiratory flow,PEF）。

1.3.4 復(fù)制Hp大鼠模型 將-80 ℃ Hp國際標準菌株SS1復(fù)蘇后，經(jīng)尿素酶、脲酶、革蘭染色驗證后，接種于平板培養(yǎng)基上，置于37 ℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)72 h，每24 h換氣1次。用生理鹽水配置成1×1011CFU/L的Hp菌液備用。Hp+COPD組大鼠禁食水12 h，用5 g/L NaHCO3做灌胃預(yù)處理，預(yù)處理后禁食不禁水6 h，經(jīng)口灌注1×1011CFU/L的Hp菌液1.5 mL，灌胃結(jié)束后禁食水4 h，隔天灌胃1次，連續(xù)灌胃5次。COPD組大鼠經(jīng)相同預(yù)處理后灌胃同等劑量的生理鹽水。

1.3.5 Hp模型的檢測 模型復(fù)制后4周，隨機選取3只Hp+COPD組大鼠，取胃竇部黏膜行細菌學(xué)涂片檢測及快速尿素酶試驗。

1.3.6 收集大鼠BALF 將Hp+COPD組與COPD組各剩余8只大鼠麻醉后打開胸腔，結(jié)扎右主支氣管，在4、5氣軟骨之間行一2 mm橫切口，將外徑約1.8 mm的大鼠氣管插管進入氣道約2 cm，灌注4 mL生理鹽水進入左肺，輕揉左肺，緩慢回抽，重復(fù)3次，收集BALF，回收率約為80%，3 000 r/min離心 5 min，收集上清液置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空白對照組和COPD組大鼠的肺功能

空白對照組和COPD組大鼠的PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC比較，經(jīng)t檢驗，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；COPD組PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC均降低，提示COPD模型復(fù)制成功。見表1。

表1 空白對照組與COPD組大鼠肺功能比較（n=8，±s）

表1 空白對照組與COPD組大鼠肺功能比較（n=8，±s）

組別空白對照組COPD組t 值P 值PEF/（mL/min）51.45±2.43 42.17±2.92-4.229 0.013 FEV0.3/mL 12.64±0.31 3.56±1.36-11.240 0.000 FEV0.3/FVC/%78.92±1.16 41.44±7.64-8.402 0.001

2.2 Hp+COPD組大鼠胃黏膜組織檢查結(jié)果

將Hp+COPD組大鼠胃竇部黏膜面分為兩部分，一部分貼于載玻片上進行涂片，革蘭染色后鏡檢，可檢測出紅色短桿狀菌體（見圖1A）；另一部分進行快速尿素酶試驗，出現(xiàn)紅色提示結(jié)果呈陽性（見圖1B）。2種結(jié)果均為陽性，提示Hp+COPD組大鼠幽門螺桿菌定植模型復(fù)制成功。

圖1 幽門螺桿菌涂片及快速尿素酶試驗結(jié)果

2.3 Hp+COPD組與COPD組大鼠炎癥因子比較

Hp+COPD組與COPD組大鼠BALF的IL-6、IL-8、TNF-α水平比較，經(jīng)t檢驗，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Hp+COPD組的IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于COPD組。見表2。

表2 Hp+COPD組與COPD組大鼠炎癥因子水平比較（n=8，pg/mL，±s）

表2 Hp+COPD組與COPD組大鼠炎癥因子水平比較（n=8，pg/mL，±s）

組別Hp+COPD組COPD組t 值P 值IL-6 87.51±7.66 51.20±14.13 6.387 0.000 IL-8 188.73±6.83 103.33±15.36 14.367 0.000 TNF-α 227.78±33.16 150.40±19.82 5.666 0.000

3 討論

1983年Hp在胃黏膜中被首次分離發(fā)現(xiàn)，并證實與胃炎、消化系統(tǒng)潰瘍、胃癌等疾病密切相關(guān)，越來越多的研究證明Hp感染與胃腸外疾病也密切相關(guān)，也包括呼吸系統(tǒng)疾病。其中，Hp和COPD的相關(guān)性更是引起了醫(yī)務(wù)人員的重視。COPD患者Hp感染率及血清抗體陽性率較對照組增高，Hp感染可能促進穩(wěn)定期COPD患者病情的進展[3]，加重急性加重期COPD患者的肺功能和凝血功能障礙，Hp感染與COPD嚴重程度有關(guān)[4]。根除Hp可以改善肺功能，減少COPD急性發(fā)作次數(shù)[5]。但是Hp感染影響COPD的機制并不清楚。IL-6作為一種炎癥因子，與大量肺內(nèi)和肺外炎癥性疾病相關(guān)，參與COPD氣道及肺實質(zhì)的炎癥反應(yīng)、氣流受限及氣道重塑[6]。IL-8可趨化、激活中性粒細胞，導(dǎo)致中性粒細胞變形，釋放各種蛋白酶，生成氧自由基，致使氣道上皮細胞損傷、脫落，進而導(dǎo)致氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)，被證明是COPD急性加重和進展的原因之一[7]。TNF-α是炎癥反應(yīng)中首先出現(xiàn)的炎癥因子，可激活淋巴細胞、中性粒細胞，影響核因子κB細胞通路，啟動、擴大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，并且可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9，導(dǎo)致肺氣腫變化[8]。本研究結(jié)果顯示，Hp感染使COPD大鼠BALF的炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，加重COPD大鼠氣道炎癥，這提示Hp可通過加重氣道炎癥而促進COPD疾病進展。但Hp加重COPD大鼠氣道炎癥的機制并不清楚，筆者分析可能如下所述。

Hp及其毒素誤吸。SAMAREH-FEKRI等[9]在肺癌患者的BALF中檢測出Hp DNA。ARISMENDI等[10]對小鼠經(jīng)口氣管內(nèi)灌注Hp懸液，結(jié)果顯示，小鼠肺組織炎癥標志物TNF-α、IL-8、IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達增多；病理檢測提示肺結(jié)構(gòu)破壞、肺纖維化，且肺纖維化隨著時間逐漸加重，但是Hp DNA經(jīng)PCR檢測，強度逐漸減弱，至30 d為陰性。也有研究證明Hp在胃以外的很多部位包括眼睛、皮膚、膽囊定植，但是目前并沒有研究直接從支氣管肺組織中分離培養(yǎng)得到Hp。另外，Hp能夠產(chǎn)生多種酶，包括尿素酶、過氧化氫酶、蛋白酶、磷脂酶等，并釋放促炎癥反應(yīng)介質(zhì)，吸入Hp及Hp外毒素能夠引起支氣管系統(tǒng)的組織損傷[11]。Hp空泡細胞毒素A（VacA）被證實存在于人肺中[12]，可能通過核因子κB信號傳導(dǎo)促進IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的產(chǎn)生，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，導(dǎo)致肺損傷[13]。而COPD患者因為急性加重及呼吸科藥物的使用更容易發(fā)生胃食管反流。總之，目前研究不支持Hp在肺組織內(nèi)直接定植，但是可以解釋Hp及其毒素通過吸入或誤吸直接損傷肺組織并導(dǎo)致慢性炎癥。

局部炎癥因子或Hp產(chǎn)物進入循環(huán)。Hp定植于胃黏膜上皮細胞，釋放毒素或直接損害黏膜屏障，引起炎癥與免疫反應(yīng)，導(dǎo)致患者胃液及循環(huán)中促炎細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8和IL-6水平升高，炎癥因子進入循環(huán)，引起胃腸外疾病[14]。另外Hp根據(jù)菌株不同分泌不同的外膜囊泡，作為攜帶物質(zhì)黏附素、毒力因子（CagA、VacA、脲酶、OipA）、代謝蛋白、磷脂、遺傳物質(zhì)等的功能載體，釋放到胃環(huán)境或者通過胃黏膜易位到組織中的免疫細胞甚至循環(huán)，間接誘導(dǎo)全身效應(yīng)[15]。Hp外膜囊泡在體外可以誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α產(chǎn)生，且Hp外膜囊泡穿透胃上皮細胞能力高于細菌。宿主細胞在感染病原體或可溶性物質(zhì)后，分泌細胞外囊泡[16]。外泌體是直徑40～160 nm的細胞外囊泡，相對較小的尺寸和統(tǒng)一的形狀使外泌體能夠成功地逃脫單核吞噬細胞系統(tǒng)的清除，保護其攜帶物質(zhì)免受降解，并被遠離其釋放的細胞選擇性地吸收，通過抗原呈遞、免疫激活、免疫抑制、免疫耐受發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。外泌體作為CagA載體能夠突破腸屏障進入循環(huán)，將CagA輸送到遠處的器官和組織[17]。腸屏障功能障礙時脂多糖陽性的細菌外膜囊泡存在于血漿中，誘導(dǎo)免疫激活[18]。COPD大鼠有腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，Hp又可破壞上皮屏障功能，使Hp相關(guān)的外膜囊泡、細胞外囊泡、炎癥因子等更容易突破腸屏障進入循環(huán)。Hp毒力因子的這種易位方式可以闡明Hp產(chǎn)物參與局部和全身炎癥的進展。綜上，Hp可能通過局部炎癥或者可溶性物質(zhì)進入循環(huán)，導(dǎo)致胃腸外疾病與癥狀。

Hp可能導(dǎo)致患者微量元素的降低。Hp由于在消化道長期定植引起慢性感染，破壞上皮細胞，干擾胃分泌、酸化功能，而影響微量元素（鐵、鋅、葉酸、維生素B12等）的吸收[19-20]。鋅作為多種酶及酶的激活因子，是免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵元素。鋅可通過調(diào)節(jié)T細胞功能、抑制IKK活性和隨后的核因子κB信號通路及伴隨的促炎細胞因子基因的表達（如IL-1和TNF-α）而發(fā)揮抗炎作用[21]。鋅對黏膜有保護作用，鋅還可以降低人體的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激[22]。葉酸和維生素B12是真核細胞一碳代謝中必不可少的輔助因子，維生素B12中的Corrin環(huán)清除氰化物離子和活性氧。葉酸和維生素B12缺乏與腦、脈管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肝臟和胃腸道的炎癥和損傷加重有關(guān)。當葉酸和維生素B12缺乏時，巨噬細胞促炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α表達明顯上調(diào)，而補充葉酸和維生素B12則明顯減少其表達，補充葉酸和維生素B12患者的血清TNF-α水平較對照組顯著降低[23]。這些研究表明Hp可能通過影響微量元素的吸收而影響機體局部及全身炎癥水平，從而促進COPD病情進展。

Hp感染導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)而影響機體炎癥狀態(tài)。Hp感染與根除均可引起腸道菌群失調(diào)[24]。而腸道微生物又與機體炎癥密切相關(guān)，腸道菌群可以通過Toll樣受體、核因子κB和髓系分化因子88等多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[25]。腸道菌群變化與血清炎癥指標C反應(yīng)蛋白、IL-6、TNF-α顯著相關(guān)，且與雙歧桿菌、乳酸桿菌呈負相關(guān)，與大腸桿菌、腸球菌呈正相關(guān)[26]。所以Hp可能通過影響腸道菌群而影響機體炎癥反應(yīng)。

綜上所述，Hp可以導(dǎo)致COPD大鼠氣道炎癥因子水平升高，從而參與COPD發(fā)生、進展，這可能與Hp及其毒素誤吸、局部炎癥因子或Hp產(chǎn)物進入循環(huán)、微量元素降低、菌群失調(diào)相關(guān)，根除Hp可能使COPD患者受益。