核酸擴增技術(shù)檢測circRNA研究進展

王 剛 許 艷 高雪芹

1. 山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）腫瘤中心，山東 濟南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，山東 濟南 250355

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子，在真核生物細胞中廣泛表達，且參與多種生命活動的調(diào)控［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 可以作為“海綿”吸附相應的小分子RNA（microRNA, miRNA），從而調(diào)節(jié)疾病的進展［3-4］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 也可以直接與信使RNA（messenger RNA， mRNA）作用，通過募集RNA結(jié)合蛋白的來增加mRNA的穩(wěn)定性，并促進其翻譯［1］。另有研究發(fā)現(xiàn)，有些circRNA 也具有指導多肽翻譯的潛質(zhì)［5］。

circRNA在生物體內(nèi)相對穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和重要生物調(diào)節(jié)作用逐漸受到研究者的重視，有望成為臨床疾病診斷的新型指標。目前，檢測circRNA的方法有RNA 測序（RNA-Seq）［6-7］，RNA 印記技術(shù)（northern blotting）［8］，微型矩陣［9］和以核酸擴增為基礎(chǔ)的檢測方法（PCR和等溫擴增技術(shù)）［10］。RNA測序流程相對復雜，需要昂貴的儀器和專業(yè)的人員分析檢測結(jié)果［11］；微型矩陣更適合circRNA定性檢測［9］；RNA印記技術(shù)靈敏度較低，且操作復雜［12］，而核酸擴增為基礎(chǔ)的檢測方法操作相對簡單，且能定量檢測circRNA，最有可能成為臨床circRNA檢測技術(shù)。本文主要總結(jié)、比較以核酸擴增為基礎(chǔ)的circRNA 檢測方法（詳見表1），以期為circRNA的檢測提供理論依據(jù)。

表格1 以核酸擴增為基礎(chǔ)檢測技術(shù)檢測circRNA的比較

1 PCR

1.1 實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（quantitative real time polymerase chain reaction， qRT-PCR）

研究circRNA 表達變化時， qRT-PCR 是最常用的方法，其重復性高、檢測靈敏［13］，是circRNA 定量檢測的“金標準”。使用qRT-PCR 檢測circRNA 時，首先提取細胞或組織中的總RNA，接下來用核糖核酸酶R（ribonuclease R， RNase R）水解掉線性的RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，PCR 檢測cDNA 濃度［20］。檢測、確認circRNA時，關(guān)鍵是驗證引物的設(shè)計，其引物設(shè)計的原則和其他核酸序列引物設(shè)計原則一致，比如引物長度為20 nt 左右，Tm 為58 ℃ ～60 ℃，產(chǎn)物長度120 ～ 200 nt［13］。但是，與其他線性RNA 檢測相比，還需要增加成環(huán)的驗證，因此circRNA 引物設(shè)計時需要將引物設(shè)計在連接點兩側(cè)，其PCR產(chǎn)物里包括了首尾相接的連接點［21］。

相應circRNA 驗證引物設(shè)計需要以下幾個步驟［21］，①查找circRNA 的堿基序列：在“UCSC genome browser（https：//genome.ucsc.edu/）”查找相應circRNA 序列；②模板準備：將circRNA 序列3'末端100 nt 堿基序列加到5'末端的100 nt 的序列上；③引物設(shè)計：利用Primer 3或者NCBI primer-BLAST設(shè)計引物，最終PCR產(chǎn)物包含120 ～ 200 nt堿基。

目前，qRT-PCR 是circRNA 定量檢測重復性最好的方法，但是在檢測過程中也會存在一些缺點。首先，與線性RNA 相比，circRNA 在相應細胞或組織里的濃度較低，不利于其定量［22］。其次，qRTPCR 檢測需要RNase R 水解線性RNA，但在此過程中可能無法水解具有二級結(jié)構(gòu)的線性RNA。另外，RNase R也可水解分子量較大的circRNA，給最終結(jié)果帶來較大的誤差［8］。更重要的是，在逆轉(zhuǎn)錄的過程中，1 個circRNA 分子可能產(chǎn)生多個cDNA，可使最終的結(jié)果偏高［23］。

1.2 微滴數(shù)字逆轉(zhuǎn)錄PCR（droplet digital PCR，ddPCR）

為了克服RT-PCR 中的缺點，李天文等［24］采用ddPCR 技術(shù)檢測胃癌相關(guān)的circRNA。ddPCR 技術(shù)是近些年開發(fā)的第三代PCR技術(shù)，可對目標核酸分子進行定量檢測。結(jié)合流體技術(shù)和乳化化學，樣品被分成成千上萬納升大小的液滴，每個液滴都支持單端點PCR擴增。最后，根據(jù)泊松算法，計算出原始樣本中目標核酸的絕對含量［25］。與常規(guī)定量PCR相比，ddPCR耗時，成本較高，但其定量不依賴標準曲線或者Ct值，定量更加準確［26］。

目前，ddPCR 應用在臨床、食品、飼料等多方面，可以用于細菌、病毒、基因突變和甲基化等的檢測［27-30］。其檢測目標樣品時包括了多個檢測步驟，主要為樣品準備、液滴準備、PCR 擴增、液滴統(tǒng)計、數(shù)據(jù)分析，具體的操作流程如下［31］：①準備PCR 反應體系：此過程和常規(guī)PCR 類似，將反應所需要的PCR 反應液、擴增引物，待檢測cDNA 混勻，注意無模板樣品和陰性樣品的設(shè)置。②微滴制備：將A過程中混勻的PCR 反應液加入到微滴發(fā)生器的樣品孔道，與此同時油性乳濁液也注射到微滴發(fā)生器中的油孔道，隨后將其放入微滴產(chǎn)生儀中，使PCR 反應液和乳濁液混合。③PCR反應：將油水混合液移到96 孔板中，預熱后進行PCR 反應。④數(shù)據(jù)統(tǒng)計：PCR反應結(jié)束后，將96孔板放入微滴計數(shù)儀中分析結(jié)果。

1.3 連接酶-PCR

2020 年，Zhang 等［10］建立了連接酶-PCR 技術(shù)特異檢測circRNA。此方法具體檢測原理和過程如下：針對circRNA 反向剪接連接點兩側(cè)的序列設(shè)計探針（探針A 和B），每一條探針包括了引物特異性序列和circRNA 特異性識別序列。檢測相關(guān)circRNA時，首先時是探針和待檢測目標雜交，接下來splintR 連接酶作用于雜交產(chǎn)物。如果待檢測目標是相關(guān)circRNA，會產(chǎn)生DNA 模板，啟動PCR 反應，反之最后無法進行PCR 擴增。連接酶-PCR 能夠定量檢測circRNA，可以跨5 個梯度濃度對相應circRNA 定量，最低檢測濃度為1 fM。這種檢測方法不用進行逆轉(zhuǎn)錄過程，且操作簡單。

2 等溫擴增方法

20 世紀90 年代，等溫擴增技術(shù)的出現(xiàn)為核酸擴增檢測提供了更多的選擇，其能在恒溫下迅速、高效的擴增目的序列［32］。目前，等溫擴增技術(shù)已經(jīng)用于circRNA 的檢測，近些年，人們采用滾環(huán)擴增、環(huán)介導的等溫擴增等擴增技術(shù)檢測circRNA，實現(xiàn)了circRNA的高效、低成本檢測。

2.1 滾環(huán)擴增檢測circRNA

滾環(huán)擴增（rolling cycle amplification， RCA）以單鏈環(huán)形核苷酸鏈為模板，以一段單鏈核酸（可以是待檢測的miRNA 或者長核酸鏈）為引物，對其進行延伸擴增，最終產(chǎn)物里面包含了大量重復的DNA序列［33］。目前，滾環(huán)擴增是檢測circRNA 使用頻率最高的等溫擴增技術(shù)。

2019 年，Boss 等［34］建立了檢測circRNA 的RCA 平臺。在該方法中以待檢測circRNA 直接作為RCA 擴增的模板，針對其設(shè)計特異性擴增逆轉(zhuǎn)錄引物，具體的檢測原理為：針對circRNA 設(shè)計特異性逆轉(zhuǎn)錄引物1 或者逆轉(zhuǎn)錄引物2，如果采用逆轉(zhuǎn)錄引物1 檢測，circRNA 能進行逆轉(zhuǎn)錄滾環(huán)擴增，最終得到不同分子量大小的cDNA，而相應的線性RNA 只能產(chǎn)生一種分子量的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄引物2 針對circRNA 反向剪接位點設(shè)計，只能擴增circRNA。2020 年，Liu 等［11］也采用了相似的思路檢測建立了RT-RCA 檢測circRNA，其在檢測過程中針對RCA 產(chǎn)物設(shè)計特異性分子信標，通過熒光信號的收集判讀結(jié)果。

Jiao 等［35］設(shè)計了線性DNA 納米結(jié)構(gòu)來檢測circRNA，其針對RCA產(chǎn)物設(shè)計2個發(fā)卡狀的探針1和2。在檢測時，RCA 產(chǎn)物、檢測探針1 和2 共同組成線性DNA 納米結(jié)構(gòu)，接下來相應circRNA 存在時，與探針1雜交促使2條探針構(gòu)象都發(fā)生變化，從而促使探針1與探針2結(jié)合，最終產(chǎn)生熒光信號［35］。Dong 等［18］以網(wǎng)狀雜交鏈式反應為基礎(chǔ)，聯(lián)合RCA建立了circRNA 快速檢測的技術(shù)。首先，對目標circRNA 進行逆轉(zhuǎn)錄滾環(huán)擴增，得到RCA 產(chǎn)物。接下來對RCA 產(chǎn)物特異設(shè)計了Trigger、H1，H2 3條探針進行雜交鏈式反應，實現(xiàn)檢測信號的放大。這種方法，提高了檢測的靈敏度，可檢測到0.1 pM 的circRNA，但是設(shè)計本身比較復雜，較難控制。

RT-RCA 檢測circRNA 時可以針對反向剪接位點設(shè)計引物，不用RNaseR 消化線性RNA，實現(xiàn)circRNA 特異性擴增，避免了RNaseR 的影響。但是，circRNA 的分子量大小不一樣，RT-RCA 是否適合不同分子量大小的circRNA進行擴增，尚需驗證。

2.2 環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）檢測circRNA

LAMP 是2000 年由日本科學家Notomi 建立的體外核酸檢測技術(shù)，其針對目的序列設(shè)計2對引物，識別目的序列的6 個區(qū)域，實現(xiàn)快速、高效的檢測［36］。目前LAMP已經(jīng)應用于各種病原菌的檢測，以此技術(shù)開發(fā)的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒已經(jīng)受到WHO的推薦，應用于臨床結(jié)核的診斷［37］。2020年，Zhang等［16］針對circRNA反向連接點設(shè)計了2對莖環(huán)引物，在不需要RNaseR消化線性RNA的情況下，能實現(xiàn)circRNA 特異性檢測，最終檢測靈敏度能達到10 aM。LAMP 是目前檢測circRNA 最靈敏的方法，但其容易出現(xiàn)非特異性擴增，導致假陽性結(jié)果［17］。

2.3 雙鏈特異性核酸酶依賴檢測方法

2018 年，Jiao 等［35］建立了可直接檢測真實樣品中circRNA 的技術(shù)，該技術(shù)利用了circRNA 可以吸附miRNA 的特性以及雙鏈特異性核酸酶的優(yōu)勢。雙鏈特異性核酸酶特異性的水解雙鏈DNA 或DNA：RNA 異源雙鏈，對單鏈DNA 或單鏈或雙鏈RNA 沒有作用。其檢測選取circRNA中7個吸附位點設(shè)計相應的分子信標，分子信標兩個游離端分別標記熒光集團和猝滅集團。當分子信標與目的circRNA雜交后，分子信標中的熒光集團和猝滅集團達到發(fā)光距離，樣品中熒光信號增強。接下來雙鏈特異性核酸酶能夠水解DNA/circRNA復合物中的DNA部分，使熒光信號大幅度增強［19］。這種方法檢測circRNA操作簡單，但是需要RNase R處理樣品。

3 展 望

circRNA作為臨床新的靶標分子已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，但只有少部分circRNA 作用機理已經(jīng)清楚，大部分circRNA的作用還有待研究。另外，作為臨床疾病的診斷指標，在臨床應用時涉及到臨界值的問題，即circRNA 濃度達到多少，標志疾病出現(xiàn)。更重要的是，雖然circRNA的檢測方法較多，但各有優(yōu)缺點，而臨床需要穩(wěn)定且靈敏的檢測方式，因此circRNA的檢測仍需要進一步完善。

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