代謝工程強(qiáng)化tolC缺失大腸桿菌的血紅素合成

張鑫,楊燕,段小燕,唐蕾*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

卟啉(porphyrin)是一類由4個(gè)吡咯類亞基互聯(lián)而成的大分子雜環(huán)化合物,主要包括血紅素、葉綠素、維生素B12等,普遍存在于自然界的各種生物體中[1]。血紅素,即鐵原卟啉Ⅸ(Fe-protoporphyrin Ⅸ,Fe-PPⅨ),在生物體內(nèi)發(fā)揮著多種生物學(xué)功能[2-3],它在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá),作為多種酶與蛋白分子的輔因子參與生化反應(yīng),同時(shí)是電子傳遞鏈蛋白的重要組成部分,也是許多生物體的優(yōu)質(zhì)鐵源[4-6]。因此,血紅素在食品、醫(yī)療保健、疾病診斷與治療等方面都有廣泛應(yīng)用[7-9]。目前通過化學(xué)合成、以生物材料為原料進(jìn)行有機(jī)提取或酶水解制備血紅素的工藝[10-12],涉及的步驟多、產(chǎn)量低、時(shí)間長,且環(huán)境不友好。利用重組細(xì)菌如大腸桿菌生物合成血紅素是大規(guī)模生產(chǎn)血紅素最有前途的方法[13-14],但是目前產(chǎn)量低,不適合工業(yè)化生產(chǎn),因此通過代謝工程改造提升重組菌的血紅素合成能力非常有必要。

大腸桿菌通過C5途徑合成血紅素(圖1),強(qiáng)化代謝途徑的關(guān)鍵酶基因可提高關(guān)鍵前體物的產(chǎn)量,如過表達(dá)hemA編碼的谷氨酰t-RNA還原酶,可提高胞內(nèi)5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)的合成,同時(shí)也促進(jìn)了細(xì)胞向外排出5-ALA[15];通過敲除5-ALA 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如RhtA、EamA)減少5-ALA外泌可提高胞內(nèi)血紅素的含量[16-17],但涉及其他前體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對血紅素合成影響的研究非常有限。

圖1 大腸桿菌血紅素合成代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of heme in Escherichia coli注:加粗箭頭:過表達(dá);虛線箭頭:部分代謝過程被省略;×:基因被敲除。

在革蘭氏陰性菌中,TolC具有向胞外排出蛋白質(zhì)、毒素、抗微生物劑的功能[18]。有研究表明,在外源添加5-ALA的情況下,tolC基因缺失會導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞積累大量糞卟啉III[19];也有研究指出MacAB-TolC 流出泵與大腸桿菌中PPⅨ的流出有關(guān)[20]。這些研究表明tolC缺失菌具有積累卟啉化合物的能力,但后續(xù)向血紅素轉(zhuǎn)化的研究未見報(bào)道。

hemH基因編碼的亞鐵螯合酶催化Fe2+與PPⅨ結(jié)合形成血紅素,是血紅素合成的最后一步[21]。因此,本研究通過敲除tolC,并在敲除菌株中過表達(dá)hemH與hemA,結(jié)合外源添加Fe2+促進(jìn)卟啉向血紅素的轉(zhuǎn)化(圖1),為大腸桿菌血紅素產(chǎn)量提升提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)中所用到的菌株和質(zhì)粒相關(guān)信息見表1。

表1 本研究中使用的菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要試劑與儀器

質(zhì)粒提取、純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶, TaKaRa公司;氯高鐵血紅素及草酸,Sigma公司;尿卟啉III鹽酸鹽(uroporphyrin III dihydrochloride,UIII)、糞卟啉III鹽酸鹽(coproporphyrin III dihydrochloride,CIII)標(biāo)準(zhǔn)品,Frontier Scientific公司;原卟啉IX(protoporphyrin IX, PPIX)標(biāo)準(zhǔn)品,源葉生物公司;異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate,Kan)、氨芐青霉素(ampicillin,Amp)、氯霉素,生工生物工程(上海)股份有限公司;七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O),國藥滬試。

分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司;PowerPacTMHC核酸電泳儀、C1000梯度PCR儀、MicroPulser電轉(zhuǎn)儀、Gel DocEZ凝膠成像儀,Bio-Rad公司;Synergy H4多功能酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基加入1.5%～2%瓊脂),抗性固體培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)基滅菌溫度降至60 ℃后再加入抗生素 (終質(zhì)量濃度為50 μg/mL)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1tolC缺失菌株構(gòu)建

以NCBI上公布的E.coliBL21(DE3)基因組序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM946981.2)為模板,設(shè)計(jì)敲除tolC上下游同源序列的引物。引物UtolCF/R、DtolCF/R分別擴(kuò)增出tolC基因上下游500 bp左右的同源序列基因UtolC,分別經(jīng)XbaI、EcoRI 與XhoI、HindIII 雙酶切。以 pKD4質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物tkanF/R,擴(kuò)增含兩端 FRT位點(diǎn)的Kan抗性基因kan2,經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切,質(zhì)粒pET22b經(jīng)XbaI和XhoI雙酶切,使用T4連接酶,將3個(gè)基因片段與線性化質(zhì)粒進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliJM109中,在Kan和Amp雙抗平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子,得到質(zhì)粒pEUTD。以質(zhì)粒pEUTD為模板,利用引物KtolCF/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到線性打靶片段,用于敲除tolC基因。

大腸桿菌tolC基因的敲除參考DATSENKO等[23],將上述打靶片段(2 493 bp)電轉(zhuǎn)入含pKD46質(zhì)粒的菌株中37 ℃,200 r/min旋轉(zhuǎn)振蕩過夜復(fù)蘇后,37 ℃篩選陽性單克隆菌落。利用引物tkanF/R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證條帶大小正確后,再導(dǎo)入pCP20質(zhì)粒,涂布至氯霉素抗性平板上,30 ℃過夜培養(yǎng)后,挑轉(zhuǎn)化子,利用引物QtolCF/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證后,送至華大基因有限公司測序驗(yàn)證,測序正確的轉(zhuǎn)化子,再通過42 ℃搖床培養(yǎng),得到?jīng)]有任何抗性的菌株。

1.2.2 過表達(dá)菌株構(gòu)建

使用TaKaRa質(zhì)粒提取試劑盒提取實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pEA、pEAH,使用引物hemAF/R、hemHF/R對質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證正確后導(dǎo)入WTΔT感受態(tài)細(xì)胞中,獲得菌株WTΔT-A、WTΔT-AH。本研究中使用的引物序列見表2。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.3 培養(yǎng)方法

各菌株接種于含有50 mL LB液體培養(yǎng)基的搖瓶中,在37 ℃、200 r/min的搖床中過夜活化后,以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種至150 mL LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h,含質(zhì)粒菌株加入Kan抗生素,需要添加誘導(dǎo)劑的菌株,在培養(yǎng)2 h后加入終濃度0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)10 h。

1.2.4 血紅素濃度檢測

參考文獻(xiàn)[22]和文獻(xiàn)[24]的方法檢測血紅素濃度。取8/OD600mL菌體量(3個(gè)平行)于4 ℃、12 000×g離心5 min后棄上清液,10 mL超純水重懸后4 ℃、12 000×g離心5 min后棄上清液,每管加入500 μL的20 mmol/L草酸溶液重懸后轉(zhuǎn)移至棕色離心管,4 ℃冰箱放置16 h后加入2 mol/L草酸溶液,混勻后均分至棕色離心管,一份室溫放置,另一份95 ℃水浴30 min。冷卻后于4 ℃、12 000×g離心5 min后在激發(fā)波長400 nm、發(fā)射波長620 nm下檢測其熒光值。計(jì)算測定的熒光差值后由血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)血紅素濃度。

血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法為:稱取一定量的氯高鐵血紅素溶解于0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3作為血紅素母液,將血紅素母液稀釋為不同濃度的血紅素標(biāo)準(zhǔn)液后各取50 μL加入500 μL的20 mmol/L草酸溶液,后續(xù)操作與樣品測定方法相同,計(jì)算測定的熒光差值后與血紅素濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 PPⅨ熒光檢測

PPⅨ檢測方法同1.2.4節(jié),其中室溫放置樣品在激發(fā)波長400 nm、發(fā)射波長620 nm下的熒光值作為胞內(nèi)PPⅨ的積累量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的驗(yàn)證

2.1.1 缺失與過表達(dá)基因的驗(yàn)證

以質(zhì)粒pEUTD為模板,利用引物KtolCF和KtolCR擴(kuò)增得到長度為2 493 bp的打靶片段。將打靶片段電轉(zhuǎn)進(jìn)WT-pKD46后,利用引物tkanF/R對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定,同源重組成功后理論上可獲得1 533 bp片段,而BL21(DE3)則無法擴(kuò)增出片段。轉(zhuǎn)入pCP20質(zhì)粒后,利用引物QtolCF/R對陽性菌進(jìn)行菌落PCR鑒定,tolC基因敲除成功的菌落理論上PCR結(jié)果為1 503 bp,而WT菌株P(guān)CR結(jié)果為3 022 bp,圖2-a結(jié)果表明Kan抗性基因被成功消除,對驗(yàn)證正確的敲除菌進(jìn)行測序,結(jié)果正確,表明tolC基因被成功敲除,42 ℃高溫培養(yǎng)后消除質(zhì)粒,并將敲除菌命名為 WTΔT。

將提取的pEA、pEAH質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證,hemA、hemH基因大小片段分別為1 257和963 bp,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳位置在理論值附近,表明質(zhì)粒正確(圖2-b)。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒導(dǎo)入WTΔT感受態(tài)中,涂布至Kan抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子,進(jìn)一步進(jìn)行菌落PCR和測序驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的菌株分別命名為WTΔT-A、WTΔT-AH。

2.1.2 HemA與HemH的蛋白表達(dá)

WTΔT-A、WTΔT-AH菌株過夜活化后轉(zhuǎn)接至150 mL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h(2 h時(shí)加入誘導(dǎo)劑)后收集菌體,破碎、離心,收集上清液與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳驗(yàn)證。

HemA、HemH分別由419和321個(gè)氨基酸構(gòu)成,理論計(jì)算分子質(zhì)量大小為46.3和35.9 kDa,SDS-PAGE蛋白電泳驗(yàn)證結(jié)果顯示,HemA、HemH蛋白在上清液與沉淀中均有表達(dá),且與計(jì)算值相符(圖3-a)。

圖3 HemA與HemH的SDS-PAGE驗(yàn)證Fig.3 SDS-PAGE verification of HemA and HemH注:M:蛋白marker;1:WTΔT-AH破碎沉淀;2:WTΔT-AH破碎上清液;3:WTΔT破碎上清液;4:WTΔT-A破碎上清液圖中箭頭指向HemA與HemH蛋白。

由于HemA和HemH的分子質(zhì)量較為接近,進(jìn)一步使用分子質(zhì)量范圍為14.3～97.2 kDa的Marker并與WTΔT菌株對比,進(jìn)一步表明重組蛋白表達(dá)成功(圖3-b),后續(xù)卟啉與血紅素含量的分析也證實(shí)了這一點(diǎn)。

2.2 tolC缺失對大腸桿菌生長的影響

各菌株每間隔2 h測定其OD600,檢測了各菌株12 h內(nèi)的生長趨勢,并繪制成相應(yīng)的生長曲線(圖4)。

a-未添加誘導(dǎo)劑;b-添加誘導(dǎo)劑圖4 各菌株生長曲線Fig.4 Growth curve of each strain

如圖4所示,tolC的缺失對大腸桿菌的前期生長無影響,在4 h后敲除菌OD600略高于野生菌,說明tolC的缺失對于大腸桿菌生長無不利影響。將空載質(zhì)粒pET28a、過表達(dá)質(zhì)粒pEA、pEAH導(dǎo)入敲除菌,在未添加誘導(dǎo)劑IPTG時(shí)也顯示對生長無不利影響,但在添加IPTG后,相較于WTΔT菌株,WTΔT-A菌株OD600有較明顯提升,而WTΔT-AH菌株OD600則有所下降。其原因可能是hemA單獨(dú)過表達(dá)使得血紅素產(chǎn)量增加,血紅素在細(xì)胞內(nèi)作為多種酶的輔因子[4](如呼吸鏈中的細(xì)胞色素c)在生命活動中作用較大,因此hemA過表達(dá)有利于細(xì)胞生長;而由于胞內(nèi)游離鐵離子的缺乏,且hemH的共同過表達(dá)將耗費(fèi)更多的能量,因此使得生長受到了一定的抑制。

2.3 在tolC缺失菌中過表達(dá)hemA對卟啉和血紅素合成的影響

tolC缺失大腸桿菌可在胞內(nèi)積累卟啉用于血紅素的合成,之前的報(bào)道表明外源添加5-ALA可在tolC缺失大腸桿菌中積累大量卟啉,因此過表達(dá)hemA基因用于增加內(nèi)源5-ALA,進(jìn)一步積累卟啉并轉(zhuǎn)化為血紅素。

相較于野生菌,WTΔT菌株胞內(nèi)卟啉增加了64%,而血紅素產(chǎn)量略有下降,為8.35 μmol/L;WTΔT-A菌株胞內(nèi)卟啉大幅增加,血紅素產(chǎn)量為WT菌株的2.62倍,達(dá)到26.47 μmol/L(圖5)。表明hemA的過表達(dá)大幅提升了胞內(nèi)卟啉與血紅素產(chǎn)量,這與之前的報(bào)道一致[19,25]。

圖5 hemA過表達(dá)對tolC缺失菌PPIX與血紅素含量的影響Fig.5 Effect of hemA over-expression on PPIX and heme contents in tolC-deleted strain注:以WT菌株為對照;*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2.4 在tolC缺失菌中過表達(dá)hemA與hemH對卟啉和血紅素合成的影響

考慮到大腸桿菌自身卟啉轉(zhuǎn)化能力有限,較多的卟啉積累而未轉(zhuǎn)化為血紅素,因此在過表達(dá)hemA的同時(shí)過表達(dá)hemH,以促進(jìn)卟啉向血紅素的轉(zhuǎn)化。

如圖6所示,hemH與hemA的過表達(dá)使得OD600減少了32%,胞內(nèi)血紅素為WTΔT菌株的4.15倍,為WT菌株的3.44倍,達(dá)到34.69 μmol/L。該結(jié)果表明,hemH的過表達(dá)雖然在一定程度上降低了大腸桿菌的生長,但hemH基因編碼的亞鐵螯合酶催化Fe2+與PPⅨ結(jié)合形成血紅素,對于卟啉向血紅素的轉(zhuǎn)化有積極作用[21]。

圖6 hemA、hemH共表達(dá)對TolC缺失菌生長及血紅素含量的影響Fig.6 Effect of co-expression of hemA and hemH on growth and heme content of tolC-deleted strain注:以WT-ΔT菌株為對照;*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2.5 Fe2+對胞內(nèi)血紅素含量的影響

hemH與hemA共表達(dá)促進(jìn)了卟啉向血紅素的轉(zhuǎn)化,但考慮到胞內(nèi)Fe2+供應(yīng)可能不足,因此設(shè)置了終濃度0、40、80、160、240 μmol/L的FeSO4梯度,進(jìn)一步促進(jìn)血紅素的合成。

首先比較了野生菌與WTΔT菌株添加不同濃度Fe2+后生長與胞內(nèi)血紅素濃度差異,結(jié)果顯示,在不添加Fe2+時(shí),野生菌血紅素濃度(10.09 μmol/L)略高于敲除菌(8.35 μmol/L),生長狀況一致;在添加一定濃度的Fe2+后,敲除菌生長狀況好于野生菌,且血紅素濃度高于野生菌,在添加濃度80 μmol/L時(shí),獲得了最高的血紅素濃度15.46 μmol/L(圖7),表明在適當(dāng)濃度的Fe2+存在下,tolC缺失菌中積累的卟啉轉(zhuǎn)化為血紅素,因而與野生菌相比更適合作為血紅素的生產(chǎn)菌株。

圖7 Fe2+對菌株生長和血紅素含量的影響Fig.7 Effect of Fe2+ on growth and heme content of strains注:以未添加Fe2+菌株為對照,對添加80 μmol/L的Fe2+菌株進(jìn)行顯著性分析;*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

對于WTΔT-AH菌株,添加不同濃度Fe2+后OD600也有所提升,并且同樣在80 μmol/L的添加濃度獲得了最高的血紅素濃度,達(dá)到40.18 μmol/L(圖8),是WT菌株血紅素含量(10.09 μmol/L)的3.98倍。

圖8 Fe2+對WTΔT-AH菌株生長與血紅素的影響Fig.8 Effect of Fe2+ on growth and heme content of WTΔT-AH

3 結(jié)論

目前,對于增強(qiáng)血紅素合成代謝的研究多集中于關(guān)鍵前體5-ALA含量的提升,例如:促進(jìn)C5途徑中前體谷氨酸的合成與向5-ALA的轉(zhuǎn)化[25]、過表達(dá)內(nèi)源hemA基因[25-26]、異源表達(dá)C4途徑中5-ALA合成酶基因[21]等,而5-ALA之后的下游中間代謝物向血紅素轉(zhuǎn)化的研究相對較少。盡管有研究表明tolC缺失可導(dǎo)致卟啉化合物的積累[19-20],但后續(xù)向血紅素轉(zhuǎn)化的研究未見報(bào)道。本研究以tolC缺失菌為出發(fā)菌株,過表達(dá)hemA基因,積累了大量卟啉;再對hemH進(jìn)行過表達(dá),并添加Fe2+以確保鐵源充足,使卟啉與血紅素螯合。與野生菌對比,結(jié)果顯示tolC缺失菌在添加Fe2+能積累更多的血紅素,表明缺失菌更適合作為血紅素生產(chǎn)的出發(fā)菌株,在tolC缺失菌中共表達(dá)hemA和hemH,并外源添加80 μmol/L的Fe2+,血紅素水平達(dá)到40.18 μmol/L,是野生菌的3.98倍。以上結(jié)果為進(jìn)一步通過發(fā)酵優(yōu)化控制,提高血紅素的生產(chǎn)水平,進(jìn)而利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)血紅素奠定了一定的基礎(chǔ)。