基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探討烏梅-僵蠶治療小兒腺樣體肥大的機(jī)制

劉靈娟，周澤霖，張鵬，蘇浩東，董秀蘭

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

小兒腺樣體肥大（AH）是由于反復(fù)或慢性炎癥刺激導(dǎo)致的腺樣體病理性增大，同時(shí)也是兒童阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征發(fā)生的常見危險(xiǎn)因素[1]。兒童和青少年患病率達(dá)34.46%[2]。腺樣體作為低年齡組兒童重要的免疫器官，6 歲以內(nèi)患兒切除將影響其免疫功能[3]，且仍有13%～29%的患兒出現(xiàn)術(shù)后殘余或復(fù)發(fā)睡眠時(shí)打鼾，這一比例在肥胖患兒中高達(dá)73%[4]。

中醫(yī)藥治療AH 療效顯著，未見明顯不良反應(yīng)[5]。臨床研究顯示，中藥組治療AH 總有效率高于西藥組，且復(fù)發(fā)率較低，具有良好的治療效果[6]。烏梅-僵蠶藥對(duì)出自宋代醫(yī)家嚴(yán)用和《嚴(yán)氏濟(jì)生方》中的烏梅丸，臨床上被廣泛用于治療多部位的息肉性疾病[7]。究其根本病機(jī)多為血瘀痰凝，聚而成痰核、癥瘕，變生惡肉。朱丹溪提出：“自氣成積，自積成痰，痰挾瘀血，遂成窠囊。”中醫(yī)論治AH 也往往從痰、瘀等角度入手[8]，治療以調(diào)理肺脾、化痰散瘀為主。沈中衛(wèi)等[9]發(fā)現(xiàn)，濟(jì)生烏梅丸能降低大腸息肉內(nèi)鏡治療后的復(fù)發(fā)率，具有較強(qiáng)的抗異常增生作用。烏梅、僵蠶均肝經(jīng)之藥，主疏泄，利于氣機(jī)暢達(dá)、血和津布。本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)相結(jié)合，對(duì)烏梅-僵蠶藥對(duì)治療AH 的潛在機(jī)制進(jìn)行研究，以期指導(dǎo)臨床用藥并為后續(xù)科學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 烏梅、僵蠶活性成分及靶點(diǎn)信息獲取 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫獲取烏梅靶點(diǎn)信息，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為條件，篩選出主要生物活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，并查閱既往文獻(xiàn)以進(jìn)一步補(bǔ)充。通過檢索文獻(xiàn)及運(yùn)用BATMAN-TCM、HERB 數(shù)據(jù)庫獲取TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未收錄的僵蠶的活性成分，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫得到相關(guān)成分的SDF 結(jié)構(gòu)，將獲取的三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)靶點(diǎn)。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)的gene symbol。

1.2 AH 疾病靶點(diǎn)獲取及烏梅-僵蠶藥對(duì)潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以“Adenoidal hypertrophy”為檢索詞，查找GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫獲取AH 的相應(yīng)靶點(diǎn)，合并取重復(fù)值。將與AH 發(fā)病相關(guān)的靶點(diǎn)和藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)取交集，得到烏梅-僵蠶作用于AH 的潛在治療靶點(diǎn)。運(yùn)用R 語言繪制韋恩圖，Cytoscape3.7.0 描繪“烏梅-僵蠶藥對(duì)-活性成分-AH”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種類型為“Homo sapiens”，最小蛋白相互作用閾值設(shè)定為最高可信度（0.900），隱藏孤立蛋白后得到交集靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）信息，將PPI 信息輸入Cytoscape3.7.0，建立PPI 網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，篩選出網(wǎng)絡(luò)中作為核心目標(biāo)的、度值高于中位數(shù)2 倍的目標(biāo)蛋白。

1.4 烏梅-僵蠶治療AH 網(wǎng)絡(luò)組建 建立“活性成分-潛在治療靶點(diǎn)-AH”的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.0 中，繪制得到“烏梅-僵蠶”治療AH網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO 功能與KEGG 通路富集分析 借助Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，pvalue Cutoff 設(shè)為0.01，對(duì)GO 富集條目按照P進(jìn)行排序，P越小表示富集程度越高，分別選取BP、CC、MF 中排名前10 的條目繪制條形圖，并將富集得到的顯著性排名前10 的信號(hào)通路（P＜0.01）進(jìn)行展示。通過R 語言對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并制作直方圖和KEGG 氣泡圖。

1.6 分子對(duì)接 從RSCBPDB 數(shù)據(jù)庫下載PPI 網(wǎng)絡(luò)中相互作用的核心蛋白的pdb 結(jié)構(gòu)，并從PubChem數(shù)據(jù)庫下載活性小分子的3D 結(jié)構(gòu)。應(yīng)用PyMOL 和AutoDockTools1.5.7 進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算藥物活性成分與靶蛋白相結(jié)合所需的最低結(jié)合能，獲得復(fù)合體的相互作用結(jié)構(gòu)。結(jié)果以結(jié)合能的高低作為化合物結(jié)合程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，一般化合物分子與受體結(jié)合能量越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生的作用可能性則越大，其對(duì)接結(jié)果越可靠。最終，運(yùn)用PyMOL 對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化操作，用R 語言將分子對(duì)接結(jié)果繪制熱圖。

2 結(jié)果

2.1 烏梅、僵蠶活性成分及靶點(diǎn)信息獲取 見表1、圖1。基于文獻(xiàn)和各數(shù)據(jù)庫，共篩選得到烏梅活性成分8 個(gè)，僵蠶活性成分22 個(gè)，活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)539 個(gè)及烏梅-僵蠶主要成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

圖1 烏梅-僵蠶主要成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表1 烏梅-僵蠶主要活性成分

2.2 烏梅-僵蠶藥對(duì)治療AH 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 見圖2。AH 對(duì)應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)共1 013 個(gè)，與2.1 中得到的539 個(gè)烏梅、僵蠶活性成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到潛在治療靶點(diǎn)165 個(gè)。

圖2 烏梅-僵蠶與AH 交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)建及核心靶點(diǎn)篩選 見圖3、表2。PPI 網(wǎng)絡(luò)中包含154 個(gè)節(jié)點(diǎn)，973 條邊，圖中節(jié)點(diǎn)顏色深淺和大小與degree 值有關(guān)，顏色越深，節(jié)點(diǎn)越大，其degree 越大，代表該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。該網(wǎng)絡(luò)中超過度值2 倍中位數(shù)的靶點(diǎn)蛋白有27 個(gè)，考慮為“烏梅-僵蠶”治療AH 起主要作用的核心靶點(diǎn)。

圖3 潛在作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)示意圖

表2 烏梅-僵蠶藥對(duì)治療AH 核心靶點(diǎn)

2.4 關(guān)鍵活性成分獲取 見圖4。構(gòu)建“活性成分-潛在治療靶點(diǎn)-AH”的對(duì)應(yīng)關(guān)系，借助Cytoscape3.7.0得到烏梅僵蠶治療AH 網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)由547 條邊和193 個(gè)節(jié)點(diǎn)（包含2 個(gè)為藥物節(jié)點(diǎn)，25 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)，165 個(gè)靶點(diǎn)和1 個(gè)為疾病節(jié)點(diǎn)）組成。槲皮素（C）、蛻皮素（JC8）、山奈酚（B）是度值排名前3 的化學(xué)成分。

圖4 活性成分-潛在治療靶點(diǎn)-AH 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能富集分析 見圖5。獲得差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）的GO 功能富集條目，包含生物過程（BP）2 188 條，主要參與對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)肽的反應(yīng)等過程。分子功能（MF）3 478 條，包括癌癥的通路、胃泌素信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-13 信號(hào)傳導(dǎo)等。細(xì)胞組分（CC）92 條，主要包括膜筏、膜微域、質(zhì)膜小窩等。

圖5 GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析 見圖6。KEGG 分析提示，165 個(gè)交集靶點(diǎn)共涉及到200 條信號(hào)通路，對(duì)前10 條通路進(jìn)行可視化處理，包括癌癥的通路、C 型凝集素受體信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化通路等關(guān)鍵通路。

圖6 KEGG 通路富集分析

2.7 分子對(duì)接 見圖7～8。為了闡明“烏梅-僵蠶”治療AH 的潛在分子機(jī)制，選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3 位的核心靶點(diǎn)TP53、STAT3、SRC、MAPK3作為受體，度值排名前3 位的活性成分槲皮素、蛻皮素、山奈酚作為配體。當(dāng)配體與受體結(jié)合時(shí)，二者結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，相互作用的可能性越大。分子對(duì)接中，槲皮素、蛻皮素分別與STAT3、TP53 的對(duì)接結(jié)合能均小于-7 kJ/mol，具有較好的結(jié)合活性（圖7）。為分析活性成分與核心靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，利用PyMOL 對(duì)對(duì)接最佳構(gòu)象進(jìn)行可視化（圖8）。

圖7 主要活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能

3 討論

AH 在中醫(yī)學(xué)上屬于痰核、鼻窒、鼾眠的范疇?！侗静萸笳妗罚骸盀趺贰胗谒兰喝?、惡痣則除。”烏梅酸澀而溫，斂肺化瘀，既能化痔消息肉，又能收伏惡肉，為僵蠶破痰瘀起到“欲散先收”的作用。僵蠶歸肝、肺經(jīng)，色白，五行屬金，金曰從革，遇結(jié)無不能開。僵蠶不僅可以散痰結(jié)，還可以消瘀滯，兼顧風(fēng)、痰、瘀等病機(jī)?！夺t(yī)學(xué)入門》：“僵蠶辛咸散痰結(jié)，中風(fēng)喉痹瘡瘢滅?！笨梢娖湎⒅?。二者一收一散，長(zhǎng)于化痰散結(jié)，是臨床治療小兒AH 的核心藥對(duì)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，槲皮素、蛻皮素、山奈酚等為烏梅-僵蠶治療AH 的核心成分。流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌是兒童AH 的菌群分布中3 種主要的條件致病菌[10]。槲皮素通過抑制Akt 磷酸化降低流感嗜血桿菌氣道上皮侵襲，并降低細(xì)菌誘導(dǎo)的促炎標(biāo)志物的表達(dá)，對(duì)流感嗜血桿菌有殺菌作用[11]。在一項(xiàng)關(guān)于慢性扁桃體炎患者氧化應(yīng)激狀態(tài)的研究中，AH 的另一刺激因素為脂質(zhì)過氧化[12]。大量文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素可以對(duì)抗自由基，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過氧化[13]。蛻皮素是一種常見的蛻皮類固醇，可以通過核激素受體復(fù)合物直接或通過蛻皮素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)靶基因的表達(dá)，來控制凋亡和自噬[14]。山奈酚能夠有效干擾STAT3 轉(zhuǎn)錄激活，抑制炎癥細(xì)胞功能和促炎細(xì)胞因子進(jìn)一步激活和趨化因子的表達(dá)[15]。過敏原刺激是導(dǎo)致AH 的原因之一[16]。嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）水平在AH 患兒組織和外周血液中的浸潤(rùn)是變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的具體表現(xiàn)，變態(tài)反應(yīng)因素Th1/Th2 相關(guān)細(xì)胞因子INF-γ/IL-4分泌失衡使腺樣體組織可能存在局部變態(tài)反應(yīng)，增加AH 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[17]。山奈酚抑制T 細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ和IL-2，使TH1/TH2 平衡向Th2 表型偏移，用于治療細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性疾病[18]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，烏梅-僵蠶可能作用于MAPK3、STAT3、TP53、SRC 等核心靶點(diǎn)對(duì)AH 起治療作用。絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）是細(xì)胞促增生和傳遞應(yīng)激信號(hào)的關(guān)鍵激酶，參與調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá)。Xue XC 等[19]調(diào)研發(fā)現(xiàn)69%的AH 中國患兒腺樣體組織中存在EB 病毒感染[20]。槲皮素可以抑制EB 病毒感染誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的活化，減少白細(xì)胞介素-6 和活性氧等重要分子，起到抗增殖作用[21]。山奈酚通過抑制SRC 激酶活性降低環(huán)氧化酶COX-2 的表達(dá)，是有效的抗氧化劑和抗炎劑[22]。尚未有研究表明SRC 與AH 有關(guān)，但有研究報(bào)道，SRC 與細(xì)胞增殖、血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

GO 功能和KEGG 通路富集分析結(jié)果一致，提示烏梅-僵蠶藥對(duì)治療AH 主要涉及癌癥的通路、C 型凝集素受體信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化通路等關(guān)鍵通路。在病理形態(tài)上，長(zhǎng)期增殖的腺樣體內(nèi)部血管豐富，表面凹凸不平，周圍組織之間無纖維包膜，與腫瘤組織的特征表現(xiàn)出一定的相似性[23]。山奈酚對(duì)各種類型的癌癥具有有效抗增殖和促凋亡活性，其機(jī)制與其能夠阻滯細(xì)胞周期、影響MEK/EK 和STAT3等多種信號(hào)通路、抑制血管形成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[24]，與AH 的生物學(xué)機(jī)制密切相關(guān)。C 型凝集素受體（CLRs）可誘導(dǎo)各類炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，并能通過調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝，產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)功能的脂質(zhì)。CTLs 在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)可能影響對(duì)病毒感染的吞噬作用。此外，CTLs 亦參與多種細(xì)菌如肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌感染的免疫調(diào)控[25]。由于腺樣體機(jī)械性阻塞、細(xì)菌刺激、免疫失調(diào)、變態(tài)反應(yīng)等原因，分泌性中耳炎（OME）、變應(yīng)性鼻炎與AH 常常伴隨發(fā)病[26]。研究發(fā)現(xiàn)，伴鼻竇炎、AH 或腺樣體炎、變應(yīng)性鼻炎的OME 患者CLRs mRNA 表達(dá)水平明顯高于不伴以上情況的患者。CLRs 可能在OME 中發(fā)揮免疫反應(yīng)的作用[27]。20-羥基蛻皮素和非甾體類蛻皮素激動(dòng)劑能夠調(diào)控血細(xì)胞和脂肪體中CTLs mRNA 的表達(dá)，以及血細(xì)胞和血淋巴血漿中CTLs 的表達(dá)[28]。Th17 細(xì)胞是一群具有潛在促炎功能的CD4+T 細(xì)胞，在AH 患兒外周血及腺樣體局部Th17/Treg 均升高，與腺樣體肥大程度相關(guān)[29]，并且腺樣體局部Th17/Treg 失衡導(dǎo)致鼻咽部肺炎鏈球菌的攜帶增加。槲皮素通過恢復(fù)Th17/Treg 平衡和激活血紅素加氧酶1 介導(dǎo)的抗炎作用抑制炎癥[30]。

分子對(duì)接結(jié)果表明，槲皮素、蛻皮素與STAT3、TP53 的對(duì)接結(jié)合能均小于-7 kJ/mol，提示有良好的對(duì)接活性。此外，除山奈酚與MAPK3 外，其余化合物分子與受體結(jié)合能均小于-6 kJ/mol，表現(xiàn)出較穩(wěn)定的結(jié)合能力，驗(yàn)證了烏梅-僵蠶的有效成分與AH 疾病核心靶點(diǎn)蛋白之間良好的親和力。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，發(fā)現(xiàn)烏梅-僵蠶治療AH 的分子機(jī)制可能是槲皮素、蛻皮素、山奈酚等活性成分通過MAPK3、STAT3、TP53、SRC 等潛在作用靶點(diǎn)，經(jīng)過癌癥的通路、C 型凝集素受體信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化通路等信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎、免疫、抗氧化、促凋亡和抑制血管生成等作用，后期將進(jìn)行深入的機(jī)制研究，以期為臨床藥物研發(fā)和防治小兒AH 提供較科學(xué)的理論基礎(chǔ)。