高耐受性氧化葡糖桿菌的篩選及鑒定

張珂,趙群,李靜,殷志航,譚海剛*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266000;2.濰坊職業(yè)學(xué)院食品藥品學(xué)院,山東 濰坊 261000)

醋作為我國主要的酸性調(diào)味品之一,釀造歷史悠久,食用人群廣泛[1]。醋酸菌是醋酸發(fā)酵階段的主要菌種,可將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸,并在該過程中產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味,影響成醋的品質(zhì)[2]。目前,國內(nèi)在工業(yè)上廣泛應(yīng)用的醋酸菌種是中科AS1.41和滬釀1.01,但在生產(chǎn)過程中,普遍遇到了產(chǎn)酸能力不足、菌種衰退、發(fā)酵成醋口感不夠柔和、風(fēng)味較單一等問題[3]。因此,篩選發(fā)酵性能好且具有良好耐受性的醋酸菌菌株是解決行業(yè)痛點(diǎn)的重要手段之一。Chen等[4]從醋醅中篩選得到一株對高溫、高醇耐受性好的醋酸菌AAB4,其在10%乙醇、37 ℃條件下,產(chǎn)乙酸達(dá)到42.0 g/L。劉靜等[5]從自然發(fā)酵的咖啡果醋中篩選出一株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的醋桿菌A9,其產(chǎn)酸能力達(dá)到3.62 g/dL。

本研究旨在從天然腐爛的無花果中篩選出一株產(chǎn)酸能力強(qiáng)、高溫耐受性、乙醇耐受性等性能較好的醋酸菌菌株,以期能夠?yàn)榻鉀Q食醋工業(yè)生產(chǎn)中遇到的難題提供技術(shù)和理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

腐爛無花果:山東威海的布蘭瑞克熟果。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖、無水乙醇:萊陽市康德化工有限公司;碳酸鈣、酵母浸粉、瓊脂粉、DNA Marker:北京索萊寶生物科技有限公司;TAE緩沖液、溴化乙錠:生工生物工程(上海)股份有限公司;細(xì)菌DNA 基因組提取試劑盒:天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋 濟(jì)南德強(qiáng)儀器有限公司;全溫振蕩培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;小型PCR 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;凝膠成像系統(tǒng) 上海佳鵬科技發(fā)展有限公司;高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.4 培養(yǎng)基

普通固體培養(yǎng)基:1%酵母浸粉、2%葡萄糖、1.5%碳酸鈣、2%瓊脂,滅菌后加入2%無水乙醇。

乙醇脅迫固體培養(yǎng)基:以普通固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ),按需要加入無水乙醇。

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基:1%酵母浸粉、2%葡萄糖,pH 6.0,使用250 mL三角瓶分裝40 mL,121 ℃、15 min滅菌。

液體種子培養(yǎng)基:液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入3%無水乙醇。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入5%無水乙醇。

乙醇脅迫發(fā)酵培養(yǎng)基:液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基按需要加入無水乙醇。

乙酸脅迫液體培養(yǎng)基:液體種子培養(yǎng)基按需要加入乙酸。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 醋酸菌分離與篩選

1.5.1.1 菌種分離

取腐爛無花果變酸部分1 g置于液體種子培養(yǎng)基,于30 ℃、180 r/min富集培養(yǎng)2 d,然后稀釋、涂布于普通固體培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)3 d,選取產(chǎn)生透明圈的菌株分別編號。

1.5.1.2 平板初篩

將分離的菌株分別點(diǎn)接到6%乙醇脅迫固體培養(yǎng)基(30 ℃)和普通固體培養(yǎng)基(37 ℃)培養(yǎng)3 d,選擇在兩種培養(yǎng)基上菌落的透明圈圈徑比均較大的菌株,利用FeCl3對選取的菌株進(jìn)行乙酸定性分析[6]。

1.5.1.3 平板復(fù)篩

經(jīng)平板初篩的菌株接入液體種子培養(yǎng)基,于30 ℃、180 r/min培養(yǎng)20 h,得種子液。取3 μL平板初篩的菌株種子液,點(diǎn)接到普通固體培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)3 d,計(jì)算菌落透明圈圈徑比。

1.5.1.4 發(fā)酵篩選

取 5 mL平板復(fù)篩的菌株種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,于30 ℃、180 r/min發(fā)酵4 d,測定發(fā)酵液中總酸含量,確定目標(biāo)菌株。產(chǎn)酸量測定方法參考GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》[7]。

1.5.1.5 產(chǎn)乙酸能力分析

取5 mL目標(biāo)菌株的種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,于30 ℃、180 r/min發(fā)酵5 d,測定發(fā)酵液中乙酸含量。為確定所篩選目標(biāo)菌株W-1產(chǎn)乙酸的能力,采用高效液相色譜法測定其在5%乙醇(30 ℃)條件下發(fā)酵5 d的發(fā)酵液中乙酸的含量,使用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);于紫外波長210 nm處檢測;柱溫25 ℃;流動(dòng)相為0.05 mol/L的KH2PO4-H3PO4緩沖液(pH 2.8);流速0.7 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。該曲線擬合公式為y=2 396.37+4 879.77x,R2為0.999 8。

圖1 HPLC法測定乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of acetic acid determined by HPLC method

1.5.2 醋酸菌鑒定

1.5.2.1 生理生化鑒定

參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[8]對菌株W-1進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5.2.2 16S rRNA鑒定

使用細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒提取菌株W-1的DNA,使用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(上游引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';下游引物1492R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。用1%(質(zhì)量與體積比)瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增DNA,溴化乙錠染色后檢測。

委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rRNA測序,通過BLAST程序提交測序結(jié)果,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列檢索,并利用MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5.3 菌株W-1生理特性

1.5.3.1 菌株W-1對溫度的耐受能力

取3 μL菌株W-1的種子液點(diǎn)接到普通固體培養(yǎng)基,分別于30,35,37,39,41 ℃培養(yǎng)3 d,觀察醋酸菌生長及產(chǎn)酸情況。

1.5.3.2 菌株W-1對乙醇的耐受能力

取3 μL菌株W-1的種子液分別點(diǎn)接到含有2%、6%、8%、10%、12%乙醇的乙醇脅迫固體培養(yǎng)基,于30 ℃培養(yǎng)3 d,觀察醋酸菌生長及產(chǎn)酸情況。

1.5.3.3 菌株W-1生長曲線測定

取5 mL菌株W-1的種子液接于液體種子培養(yǎng)基,于30 ℃、180 r/min 培養(yǎng),每隔2 h測定細(xì)胞濃度(波長540 nm處的吸光值,用OD540 nm表示),繪制菌株W-1生長曲線。

1.5.3.4 菌株W-1發(fā)酵曲線測定

取5 mL菌株W-1的種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,于30 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng),每隔1 d測定細(xì)胞濃度和總酸含量,并計(jì)算產(chǎn)酸率,繪制菌株W-1發(fā)酵曲線。

1.5.3.5 菌株W-1遺傳穩(wěn)定性

菌株W-1于試管斜面?zhèn)鞔?0次,分別進(jìn)行液體種子培養(yǎng),各取5 mL種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,于30 ℃、180 r/min發(fā)酵4 d,測定發(fā)酵液中細(xì)胞濃度和總酸含量。

2 結(jié)果和分析

2.1 醋酸菌分離與篩選

2.1.1 平板初篩

從腐爛無花果中分離出153株產(chǎn)生透明圈的菌株,分別以37 ℃(2%乙醇)和6%乙醇(30 ℃)作為脅迫條件進(jìn)行平板初篩,挑選出在兩種條件下透明圈圈徑比均較大的8株菌株,分別為Z-3、Z-8、Z-11、Y-3、X-1、X-7、W-1、W-9。對這8株菌株發(fā)酵液進(jìn)行乙酸定性分析,結(jié)果見圖2。

圖2 乙酸定性分析Fig.2 Qualitative analysis of acetic acid

由圖2可知,菌株的發(fā)酵液可以與FeCl3反應(yīng)產(chǎn)生紅褐色沉淀,所以判斷發(fā)酵產(chǎn)物中存在乙酸。

2.1.2 平板復(fù)篩

由圖3和表1可知,菌落透明圈圈徑比較大的菌株分別是W-1、Z-8、Y-3和W-9,其中菌株W-1的圈徑比最大,為(3.16±0.08)。

表1 普通固體培養(yǎng)基平板復(fù)篩菌落透明圈圈徑比Table 1 Ratios of diameters of transparent circles of plate rescreened colonies on the common solid medium

圖3 普通固體培養(yǎng)基平板復(fù)篩菌落Fig.3 Rescreened colonies on the common solid medium

2.1.3 發(fā)酵篩選

由圖4可知,菌株W-1總酸含量最高,為(4.22±0.06) g/dL,比Z-8、Y-3和W-9分別提高了2.9%、17.35%、170.51%,最終確定菌株W-1為目標(biāo)菌株。

圖4 菌株發(fā)酵篩選Fig.4 Screening and fermentation of strains

圖5 菌株W-1發(fā)酵液高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatogram of strain W-1 fermentation broth

2.1.4 產(chǎn)乙酸能力分析

通過圖1乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酸含量為(4.01±0.16) g/dL。

2.2 醋酸菌鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

由圖6和表2可知,菌株W-1為革蘭氏陰性菌株,菌體呈短桿狀,大小為(0.63～0.76) μm×(1.19～1.51) μm,可以氧化乙醇產(chǎn)生乙酸,不能氧化乙酸和乳酸,其他試驗(yàn)結(jié)果也均符合葡糖桿菌屬的生理生化特征。

表2 菌株W-1生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain W-1

圖6 菌株W-1革蘭氏染色結(jié)果(G-)Fig.6 Gram staining results of strain W-1 (G-)

2.2.2 16S rRNA鑒定

對菌株W-1進(jìn)行16S rRNA鑒定,其PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖7。

圖7 瓊脂糖凝膠電泳Fig.7 Agarose gel electrophoresis

由圖7可知,在1 500 bp左右有一條清晰的條帶,測得菌株W-1的16S rRNA基因序列,其含有1 394 bp堿基。通過BLAST程序提交序列,進(jìn)行同源序列檢索,并通過MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖8。

圖8 菌株W-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of strain W-1

菌株W-1與氧化葡糖桿菌GluconobacteroxydansDSM 3503(NR 026118.1)為同一種屬,基因序列同源性為99.64%,確定菌株W-1為氧化葡糖桿菌(CGMCC No.18500)。

2.3 菌株W-1生理特性

2.3.1 菌株W-1的高溫耐受能力

溫度過高導(dǎo)致菌體產(chǎn)酶能力下降,因此生長及產(chǎn)酸受到抑制[9]。將菌株W-1接種到普通固體培養(yǎng)基(2%乙醇),分別在不同溫度下培養(yǎng),其生長及產(chǎn)酸結(jié)果見圖9。

圖9 菌株W-1的溫度耐受性Fig.9 Temperature tolerance of strain W-1

由圖9可知,菌株W-1在30～39 ℃范圍內(nèi)生長沒有明顯差異,均能較快生長且沒有明顯的延滯期,這與Perumpuli等在斯里蘭卡椰子醋中篩選的醋酸菌Gluconobacter菌株SL13E-2和SL13E-3的耐高溫特性相近,但這兩株菌株延滯期長達(dá)2 d和3 d且乙酸產(chǎn)量較低,只有3.15 g/dL和3.02 g/dL[9]。

2.3.2 菌株W-1的乙醇耐受能力

將菌株W-1分別接種到含有不同乙醇濃度的固體培養(yǎng)基,30 ℃條件下培養(yǎng),其生長及產(chǎn)酸結(jié)果見圖10。

圖10 菌株W-1的乙醇耐受性Fig.10 Ethanol tolerance of strain W-1

由圖10可知,菌株W-1在10%乙醇中可以生長并產(chǎn)酸,說明其乙醇耐受能力較熱帶醋桿菌JM2和巴氏醋桿菌B103強(qiáng)。同時(shí)可以看出,菌株W-1的生長和產(chǎn)酸能力隨著乙醇濃度的升高而逐漸變?nèi)?。在?%～8%乙醇的固體培養(yǎng)基,菌株W-1生長1 d便形成了明顯的菌落,而在10%乙醇的培養(yǎng)基上2 d才形成菌落,說明乙醇對菌株W-1的生長及產(chǎn)酸產(chǎn)生抑制作用[10]。

2.3.3 菌株W-1生長曲線

由圖11可知,菌株W-1的延滯期為0～2 h,對數(shù)期為2～28 h,穩(wěn)定期為28～36 h,處于對數(shù)期的細(xì)菌對外界因素敏感、形態(tài)典型、活性好,因此選擇菌株W-1的種子培養(yǎng)時(shí)間為20 h。

圖11 菌株W-1生長曲線Fig.11 Growth curve of strain W-1

2.3.4 菌株W-1發(fā)酵曲線

菌株W-1生長和產(chǎn)酸受到高濃度乙醇的抑制,因此菌株W-1在 3%乙醇(30 ℃)種子培養(yǎng)后,再將其種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基(5%乙醇、30 ℃)進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵曲線見圖12。

圖12 菌株W-1發(fā)酵曲線Fig.12 Fermentation curves of strain W-1

由圖12可知,菌株W-1發(fā)酵過程中,細(xì)胞濃度和總酸含量呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢,而產(chǎn)酸率則先上升后下降。4 d時(shí)產(chǎn)酸率為(11.94±0.69) g/d,此時(shí)總酸含量達(dá)到(4.26±0.06) g/dL;4 d之后產(chǎn)酸率迅速降低,總酸含量增長緩慢,發(fā)酵6 d后總酸含量達(dá)到(4.70±0.02) g/dL。其總酸含量均高于已篩選的氧化葡糖桿菌E3[11]和葡糖桿菌Gra904[12],二者的總酸產(chǎn)量分別為3.35 g/dL和3.57 g/dL。

2.3.5 菌株W-1傳代穩(wěn)定性

將菌株W-1傳代10次后分別在5%乙醇條件下發(fā)酵4 d,其生長和發(fā)酵情況見表3。

表3 菌株W-1傳代穩(wěn)定性Table 3 Passage stability of strain W-1

由表3可知,菌株 W-1傳代10次后在波長540 nm處的吸光值維持在1.178～1.213之間,發(fā)酵液總酸含量維持在4.15～4.32 g/dL之間,生長和產(chǎn)酸情況均無明顯變化,說明菌株W-1穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

本研究以腐爛無花果為來源,采用平板分離法經(jīng)過初篩、復(fù)篩及發(fā)酵篩選,最終篩選出一株高溫耐受性好、乙醇耐受能力強(qiáng)的醋酸菌菌株W-1,并經(jīng)過生理生化鑒定、16S rRNA測序分析,確定該菌株為氧化葡糖桿菌。研究菌株W-1的生理特性發(fā)現(xiàn),菌株W-1可以耐受39 ℃高溫或10%乙醇;在含5%乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中,菌株W-1發(fā)酵4 d和6 d,總酸含量分別達(dá)到(4.26±0.06) g/dL和(4.70±0.02) g/dL,產(chǎn)酸能力較強(qiáng);傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,菌株W-1的生長和產(chǎn)酸穩(wěn)定性較好。