注射和口服GnRH對小黃魚人工催產(chǎn)效果的評估

方馨正 胡偉華 陳睿毅 曾延清 柴學軍 徐冬冬

(1. 浙江海洋大學水產(chǎn)學院, 舟山 316022; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 舟山 316021;3. 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 舟山 316021)

在人工養(yǎng)殖條件下, 有些魚類的親體必須依賴催產(chǎn)素才能夠排卵[1—3]。隨著催產(chǎn)激素的研制和應用, 突破了多種淡、海水魚類的人工繁殖技術, 結束了以捕撈天然苗種的時代[4]。目前, 常用的催產(chǎn)激素種類主要有人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic gonadotrophins, hCG)、地歐酮(Domperidone,DOM)、鯉魚腦垂體(Carp pituitary extraction, CPE)和促黃體素釋放激素類似物(Luteinizing hormone releasing hormone along, LHRH-A)和促性腺激素釋放激素類似物(Gonadotrophin releasing hormone,GnRH)等[5—7]。雖然催產(chǎn)激素種類眾多, 但不同的催產(chǎn)激素在不同魚類中的給藥方式、劑量及其效果差異很大, 如黃顙魚[8](Pelteobagrus fulvidraco)、加州鱸[9](Micropterus salmoides)和泥鰍[10](Misgurnus anguillicaudatus)等常用LHRH-A2、DOM及HCG組合進行腹腔或肌肉注射催產(chǎn); 大黃魚[11](Larimichthys crocea)則常采用LHRH-A3注射催產(chǎn); 金槍魚[12](Thunnusthynnus)和虹鱒[13](Oncorhynchus mykiss)等采用GnRH肌肉注射埋植法。采用注射的方式催產(chǎn)是魚類中最為常見的給藥方式, 埋植和口服等給藥方法的報道較少[14—16]。對于應激性強的魚類, 如大黃魚、金槍魚等, 人工注射容易引發(fā)親魚損傷、引起炎癥, 從而引發(fā)疾病甚至死亡。研發(fā)口服型的催產(chǎn)激素不僅能夠降低催產(chǎn)對于親本的損傷, 而且還能夠提高產(chǎn)卵效率, 節(jié)省人力成本。

GnRH作為動物下丘腦-垂體-性腺(Hypothalamus-pituitary-gonad, HPG)軸中最先發(fā)現(xiàn)激素, 由10個氨基酸組成, 其在魚類中的序列保守, 且易于人工合成, 是研發(fā)口服型催產(chǎn)激素的首選目標。研究發(fā)現(xiàn)在豬、馬、牛和羊等畜禽類動物中, 通過投喂GnRH能提高發(fā)情頻率和受精率, 提高產(chǎn)出的子代數(shù)量和質(zhì)量[17,18]。但與注射或包埋給藥方式相比, 口服激素由于合成價格高、催產(chǎn)效果不佳等原因, 所以尚未大規(guī)模投入使用。但近年來, 隨著生物藥物加工技術水平的飛速發(fā)展, 人工合成的多肽費用顯著下降[19,20], 已有激素、單克隆抗體及多肽疫苗等超百種多肽藥物問世[21,22], 這些為口服激素在水產(chǎn)中的研制和應用提供了良好基礎。同時, 因口服激素無須注射或埋植等操作, 可有效避免麻醉和捕撈等人工處理給親魚帶來的損傷, 其應用相關的探索越來越受到人們的關注。

小黃魚(Larimichthys polyactis), 俗稱黃花魚,屬鱸形目、石首魚科、黃魚屬, 廣泛分布于我國東海、黃海和渤海海域及朝鮮半島附近海域, 因其肉質(zhì)細膩鮮美, 營養(yǎng)豐富, 深受消費者喜愛, 是我國的“四大海產(chǎn)”之一[23—25]。隨著漁業(yè)資源過度捕撈, 小黃魚種群中呈現(xiàn)出個體性成熟提前、低齡化和小型化等資源衰退現(xiàn)象[26,27]。近年來, 浙江省海洋水產(chǎn)研究所等單位對小黃魚人工繁育進行了系統(tǒng)研究, 突破了其全人工規(guī)?；敝臣夹g[28]。小黃魚的人工繁殖必須依靠催產(chǎn)激素才能排卵, 已有研究表明LHRH-A2能夠有效誘導小黃魚排卵, 但催產(chǎn)效果有待提高, 且因其應激性強, 采用注射的方式容易造成魚體損傷, 亟須研發(fā)新型催產(chǎn)激素并改變催產(chǎn)方式。本研究旨在探索新型催產(chǎn)激素和給藥方式, 采用注射和口服兩種方式開展小黃魚催產(chǎn)試驗,以生理鹽水注射為對照, 設置LHRH-A2注射組、GnRH注射組和GnRH口服組, 比較各實驗處理組的產(chǎn)卵情況、血清激素水平及組織生理變化, 評價不同催產(chǎn)方法的繁殖性能, 綜合評估GnRH的催產(chǎn)效果。研究結果為提高小黃魚的人工繁育技術水平提供理論和技術參考。

1 材料與方法

1.1 親魚來源及強化培育

小黃魚親魚來自2019—2020年人工培育的2—3齡無病無傷, 活力良好的性成熟個體, 雌雄魚初始平均體重分別為(64.49±8.81)和(65.28±7.87) g。2021年2月從網(wǎng)箱移至室內(nèi)50 m3水泥池強化培育,采用經(jīng)沉淀砂濾而得的自然海水養(yǎng)殖, 每天吸污、換水, 保持溶氧6 mg/L以上, 日換水量100%以上, 每天投喂兩次配合飼料和沙蠶進行營養(yǎng)強化。

1.2 試驗方法

待自然水溫上升至16℃, 挑選親本120尾, 腹部柔軟且生殖孔紅腫的雌魚72尾, 輕壓腹部有精液流出的雄魚48尾, 按雌雄比1.5﹕1隨機分至1 m3玻璃鋼試驗桶中暫養(yǎng), 每組30尾。暫養(yǎng)1周后, 將實驗分為生理鹽水注射組、LHRH-A2注射組、GnRH注射組和GnRH口服組, 共分為4組, 每組兩個平行。根據(jù)文獻報道設置A2注射組劑量為2.4 μg/kg, GnRH注射組劑量為75 μg/kg, 采用腹腔注射法進行催產(chǎn)[29,30];GnRH口服組劑量為6 mg/kg[31]。口服GnRH的制備方法是優(yōu)化了激素飼料制備和包埋方式, 具體為將溶于無水乙醇的GnRH均勻噴灑在飼料上, 然后用海藻酸鈉-殼聚糖凝膠進行藥物包埋, 待晾干后投喂給藥[31,32]。在試驗開始后, GnRH口服組每天飽食投喂, 至親魚產(chǎn)卵停止激素處理, 轉為正常飼料, 其他各組采用正常飼料飽食投喂。

1.3 受精卵收集及孵化

小黃魚的卵屬于浮性卵類型且為夜間產(chǎn)卵, 定期用80目的篩絹網(wǎng)在實驗桶中收集魚卵, 收集后的魚卵靜置15min后虹吸去除死卵, 將上浮卵置于孵化槽中孵化。統(tǒng)計產(chǎn)卵量(Egg production, EP)、上浮卵重(Buoyancy egg weight, BEW)、受精率(Fertilization rate, FR)及孵化率(Hatching rate, HR)。

受精率(FR, %)=受精卵總數(shù)/總產(chǎn)卵量×100

孵化率(HR, %)=出膜仔魚數(shù)/受精卵總數(shù)×100

1.4 組織樣品采集

在各組產(chǎn)卵前(實驗處理前)、中(開始產(chǎn)卵后的第7天)、后(停止產(chǎn)卵后的第7天)進行取樣, 每次取6尾, 用濃度為100 mg/L的MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽)對實驗魚進行快速麻醉, 測量其全長、體長和體重等數(shù)據(jù)后尾靜脈采血, 離心后收集上層血清置于-20℃保存?zhèn)溆? 解剖取出完整的卵巢, 觀察性腺發(fā)育情況, 判斷卵巢分期, 稱量性腺重(Gonadal weight, GW), 計算生殖腺指數(shù)(Gonad somatic index, GSI)。每尾魚取左側卵巢0.1—0.5 g,解剖鏡下計數(shù), 計算出卵巢中的總懷卵量, 即絕對繁殖力(Absolute fecundity, AF); 取右側卵巢中部置于Bouin’s液中固定, 用于后續(xù)組織學切片。

生殖腺指數(shù)(GSI)=性腺重/體重×100

絕對繁殖力(AF)=每克卵數(shù)量×卵巢重量

1.5 血清激素測定

選用ELISA試劑盒檢測血清中促黃體激素生成素(Luteinizing hormone, LH; 博深, BS-E17501O2)、卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone, FSH;博深, BS-E17362O2)和促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH; 博深, BS-E17365O2)水平。通過酶標儀(BioTek Synergy; 美國伯騰)在450 nm 處測定其吸光值 (Optical Density, OD), 根據(jù)標準曲線計算每個樣品的LH、FSH和GnRH激素水平, 每個樣品重復測定3次。

1.6 組織學切片及卵母細胞發(fā)育分期

Bouin’s固定液中卵巢經(jīng)乙醇梯度脫水和二甲苯透明, 用石蠟包埋固定樣品, 在切片機(RM 2245型; 德國萊卡)上連續(xù)切片(厚度5—6 μm), 經(jīng)蘇木精-伊紅染色, 中性樹脂封片, 用光學顯微鏡(AXIOCam 506型; 德國蔡司)拍照觀察。卵母細胞發(fā)育分期的劃分, 參照文獻報道關于魚類卵母細胞發(fā)育分期的標準[33—35], 根據(jù)測量的卵母細胞直徑大小和核仁數(shù)目, 并結合卵黃物質(zhì)的積累, 將其劃分為3個時相: 第Ⅱ時相卵母細胞(初級生長期), 其直徑為44—210 μm, 核仁數(shù)量3—8個; 第Ⅲ時相卵母細胞(皮質(zhì)液泡階段), 細胞核占卵母細胞大部分, 其直徑為211—400 μm, 核仁數(shù)量明顯增多; 第Ⅳ時相卵母細胞(卵黃蛋白原合成期), 大部分細胞核消融, 并出現(xiàn)大量油滴和卵黃顆粒, 其直徑為401—697 μm, 核仁數(shù)量明顯減少。利用ZEN Blue lite2測量卵母細胞直徑, 并記錄不同發(fā)育時相卵母細胞的數(shù)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗數(shù)據(jù)由Excel 2019軟件統(tǒng)計, 表示為平均值±標準誤(mean±SE), 用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析, 采用T-test檢驗進行顯著性檢驗,差異顯著性水平為P＜0.05, 利用GraphPad Prism 9.0軟件進行制作圖表。

2 結果

2.1 人工催產(chǎn)繁殖效果分析

實驗期間注射生理鹽水組的小黃魚不會產(chǎn)卵,外源激素處理組均可誘導小黃魚產(chǎn)卵。LHRH-A2注射組和GnRH注射組的效應時間為48h, 且LHRHA2組在注射后第2天達到產(chǎn)卵高峰, 其后開始下降;GnRH注射組的產(chǎn)卵量在注射后第3天達到高峰; 而GnRH口服組的效應時間為120h, 產(chǎn)卵期間的前3天產(chǎn)卵量較高, 之后呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(圖1)。

圖1 LHRH-A2注射組、GnRH注射組和GnRH口服組每天的產(chǎn)卵量Fig. 1 Daily egg production of injection of LHRH-A2, injection of GnRH and oral administration of GnRH

在產(chǎn)卵量和上浮卵重方面, LHRH-A2注射組分別為(254.5±25.5)和(126.19±17.38) g; GnRH注射組最高, 分別為(354.5±23.5)和(152.68±18.72) g, 但與LHRH-A2注射組無明顯差異(P＞0.05); GnRH口服組最低, 為(140.2±6.04)和(49.61±3.66) g, 顯著低于外源激素注射組(P＜0.05)。但在受精率和孵化率方面, 各處理組間無明顯差異(表1)。

表1 各處理組的產(chǎn)卵情況比較Tab. 1 Comparison of effect time, egg production, floating egg weight, fertilization rate, and hatching rate

2.2 小黃魚產(chǎn)卵過程的性腺發(fā)育分析

實驗初始小黃魚性腺發(fā)育良好, 雄魚精巢呈乳白色、細線狀, 輕擠壓精巢有精液流出, 卵巢呈淡黃色的長囊狀, 血管豐富, 兩側對稱(圖2)。

圖2 實驗初期小黃魚的性腺發(fā)育情況Fig. 2 Gonadal development of small yellow croaker at the start of experiment

對小黃魚產(chǎn)卵過程的性腺發(fā)育情況分析, 對照組的生殖腺指數(shù)(GSI)和絕對繁殖力(AF)在試驗過程中無明顯變化。各激素處理組的GSI在產(chǎn)卵中和產(chǎn)卵后均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢, 顯著低于同期的對照組(P＜0.05)。而各激素處理組的AF在產(chǎn)卵中和產(chǎn)卵后均呈上升趨勢, 顯著高于同期對照組(P＜0.05),且GnRH注射組高于LHRH-A2注射組(圖3)。

圖3 小黃魚生殖腺指數(shù)和絕對繁殖力Fig. 3 The gonadosomatic index of small yellow croaker and absolute fecundity in pre-spawning, spawning and post-spawning

進一步采用組織切片分析各組的卵巢組織結構, 在產(chǎn)卵前期各處理組卵巢均處于Ⅲ期, 可見大量第Ⅲ時相卵母細胞(圖4A、4D、4G和4J)。產(chǎn)卵中期, 各激素處理組的卵巢均處于Ⅴ期(圖4E、4H和4K), 但A2注射組的油滴和卵黃顆粒數(shù)量明顯多于GnRH口服組(圖4K), 且大量卵母細胞的細胞核已溶解, 放射帶變厚。產(chǎn)卵后期, 外源激素處理組的卵巢發(fā)育相似, 可見大量空濾泡結構(圖4F、4I和4L), 而對照組卵巢在產(chǎn)卵前、中、后無明顯變化(圖4A、4B和4C)。

圖4 不同催產(chǎn)激素處理組在產(chǎn)卵過程中卵巢發(fā)育的組織學比較Fig. 4 Histological comparison of ovarian development during the pre-spawning, spawning, and post-spawning periods in small yellow croaker treated with different oxytocic hormones

對小黃魚產(chǎn)卵過程的卵母細胞時相占比進行分析, 在產(chǎn)卵前期各組初始的Ⅱ時相、Ⅲ時相和Ⅳ時相比例分別為40%—42%、29%—31%和27%—31%(圖5)。在實驗過程中, 對照組雖未產(chǎn)卵, 但卵母細胞各時相比例也有所變化, 表現(xiàn)為Ⅱ時相卵母細胞比例先下降后升高, Ⅳ時相卵母細胞先升高后下降的趨勢。各激素處理組的卵母細胞時相占比則發(fā)生劇烈變化, 在產(chǎn)卵中期, LHRH-A2注射組和GnRH注射組以Ⅲ和Ⅳ時相卵母細胞為主, 總比例分別為74%和62%; 而GnRH口服組的Ⅱ時相卵母細胞占50%, Ⅲ和Ⅳ時相總比例為50%。在產(chǎn)卵后期, 各激素處理的卵母細胞以Ⅱ時相為主, 占比為68%—69%, 而此時對照組的Ⅱ時相比例僅為36%。

圖5 小黃魚產(chǎn)卵前、中、后期卵母細胞分期占比統(tǒng)計Fig. 5 Staging percentage of pre-spawning, spawning and post-spawning oocytes in small yellow croaker

2.3 小黃魚產(chǎn)卵過程血清中LH、FSH和GnRH激素水平的分析

對小黃魚產(chǎn)卵過程中血清HPG軸相關的類固醇激素進行分析, 結果顯示, 與對照組相比, 各激素處理血清的LH、FSH和GnRH水平迅速升高, 均顯著高于同期對照組(P＜0.05), 產(chǎn)卵后期仍可維持在較高水平(圖6)。其中, GnRH注射組的FSH、GnRH水平顯著高于LHRH-A2注射組(P＜0.05), LH無顯著差異(P＞0.05)。GnRH口服組的LH、FSH和GnRH水平顯著高于其余激素處理組(P＜0.05)。

圖6 小黃魚產(chǎn)卵前、中、后的血清激素水平Fig. 6 Serum hormone levels of pre-spawning, spawning and post-spawning in small yellow croaker

3 討論

催產(chǎn)激素的研發(fā)和應用對于魚類繁殖至關重要。小黃魚需要依靠激素催產(chǎn)才能完成排卵, 但其應激性較強, 注射和埋植均會不可避免地造成損傷,篩選新型催產(chǎn)激素并探索口服給藥對于提高人工繁育技術水平具有重要意義。本研究初步評估了GnRH對小黃魚的催產(chǎn)效果, 通過設置LHRH-A2注射、GnRH注射和口服等不同處理, 分析其在小黃魚產(chǎn)卵中的催產(chǎn)作用, 結果表明GnRH注射與LHRH-A2注射相比在效應時間、受精率和孵化率基本相當, 但產(chǎn)卵量和上浮卵量顯著高于LHRHA2注射組。口服GnRH也能夠誘導小黃魚產(chǎn)卵, 與注射組相比, 受精率和孵化率無差異, 但效應時間長、產(chǎn)卵量顯著低。因此, 上述結果表明GnRH是小黃魚人工催產(chǎn)激素的潛在選擇。GnRH注射能顯著提高小黃魚人工繁殖效果, 與條紋狼鱸(Morone saxatilis)[3]、白卜鮪(Euthynnus affinis)[36]和金頭鯛(Sparus aurata)[37]等魚類中的GnRH催產(chǎn)效果相一致。然而, 口服GnRH組的產(chǎn)卵量低于注射組, 這可能由于口服激素需要經(jīng)過吸收、代謝等過程, 導致效應時間較注射組長, 且此過程會導致藥物損耗,到達靶器官時其有效劑量減少, 故而可能導致產(chǎn)卵量減少。

安全有效的催產(chǎn)激素和科學的催產(chǎn)方案越來越受到關注[38]。良好的產(chǎn)卵效果往往既能獲得優(yōu)質(zhì)受精卵又可以提高親本產(chǎn)后存活率[37,39,40], Donaldson和Hunter等[41]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖魚類會因卵母細胞不能達到成熟排卵階段(Final Ooctye maturation, FOM)而引起雌魚死亡。卵巢中卵母細胞發(fā)育成熟及排卵情況與人工繁殖效果緊密相關, 通過解剖學和組織學分析可以明確卵巢中卵母細胞的成熟情況, 很好地評估外源激素處理對繁殖性能的影響。本研究通過解剖學和組織學分析表明經(jīng)外源催產(chǎn)激素處理后, 各處理組的卵巢均可以發(fā)育至Ⅳ期并排卵,產(chǎn)卵中期的卵母細胞以Ⅳ時相為主, 而對照組卵巢則停留在Ⅲ期且卵子不會排出, 進一步證明小黃魚在室內(nèi)培育條件下需要依靠外源激素促熟排卵。

HPG軸在性腺發(fā)育成熟中起著關鍵性的作用,相關激素如GnRH、FSH、LH等類固醇激素都在魚類繁殖中扮演著重要的角色, GnRH由下丘腦分泌, 可通過垂體門脈系統(tǒng)來調(diào)控FSH和LH的合成和分泌。FSH與LH協(xié)同作用促進卵泡分泌甾體激素,從而觸發(fā)排卵[42,43]。在產(chǎn)卵障礙的哺乳動物中, 均發(fā)現(xiàn)LH和FSH激素水平顯著低于正常個體[44,45]。在本研究中, 經(jīng)過激素處理后魚體血清中GnRH、FSH和LH的激素水平顯著上升, 表明GnRH和LHRHA2均能夠有效促進FSH和LH的合成與釋放[46—48],從而誘導小黃魚產(chǎn)卵。口服GnRH組的相關激素水平也能夠迅速升高, 但產(chǎn)卵量顯著低于注射組, 表明口服GnRH可以通過腸道吸收、循環(huán)轉運至垂體發(fā)揮生理功能, 但其口服的藥代動力學還需要深入研究。

口服給藥能夠減少人工操作, 可以有效降低人工成本, 在魚類繁殖實踐中應用潛力巨大。尤其在一些應激性強的魚類中, 口服激素的研發(fā)應用非常重要。研究學者已經(jīng)進行了相關的試驗嘗試, 如藍鰭金槍魚通過投喂抗原級GnRH, 其催產(chǎn)效果與激素埋植的效果相當, 可以在繁殖期進行多次安全有效的催產(chǎn)[36]; 云紋犬牙石首魚(Cynoscion nebulosus)和點帶石斑魚(Epinephelus coioides)等通過口服GnRH類似物, 能成功誘導產(chǎn)卵并使其血液中激素水平升高并誘導其排卵[16,49]。本研究首次在石首魚類中嘗試采用口服GnRH的方式催產(chǎn), 雖然催產(chǎn)效果不及人工注射的效果, 但通過進一步優(yōu)化包埋方式、給藥劑量等方法有望提升口服的催產(chǎn)效果, 建立安全高效的催產(chǎn)繁殖操作流程。相關技術不僅有利于提高小黃魚的人工繁殖技術水平, 也可以在大黃魚等海水魚類中應用, 為其繁育水平的提升提供技術支撐。

致謝:

感謝浙江省海洋水產(chǎn)研究所的王躍斌、張鼎元、安從軍等在試驗期間對小黃魚養(yǎng)殖管理方面給予的幫助。