基于無(wú)殼孵化黃喉擬水龜胚胎發(fā)育活體觀察

徐昊旸 洪孝友 魏成清 劉毅輝 李 偉 朱新平* 劉曉莉*

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510380;2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

近年來(lái)在鳥類中興起的無(wú)殼人工孵化技術(shù)在醫(yī)療和精細(xì)化工等領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用。無(wú)殼孵化是一項(xiàng)備受關(guān)注的人工孵化技術(shù), 是人工孵化領(lǐng)域的一次重大突破。無(wú)殼孵化對(duì)于推動(dòng)孵化科技及生命科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展具有里程碑式的意義[1]。雞胚因發(fā)育過(guò)程清楚, 長(zhǎng)久以來(lái)作為基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)研究領(lǐng)域重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ? 尤其在雞胚發(fā)育早期絨毛尿囊膜階段, 因其血管豐富, 是天然的免疫缺陷宿主, 也是病理學(xué)、藥理學(xué)和腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚2,3]。然而, 關(guān)于龜鱉等爬行動(dòng)物的無(wú)殼孵化研究卻鮮有報(bào)道。野外條件下龜鱉繁殖時(shí), 會(huì)在沙土上挖窩產(chǎn)卵, 產(chǎn)卵后用后肢扒土將卵埋上離開(kāi), 無(wú)護(hù)卵行為, 卵自然孵化。在人工養(yǎng)殖時(shí), 為了提高孵化率, 通常在龜鱉自然產(chǎn)卵后收集受精卵, 置于孵化箱, 埋于孵化介質(zhì)如沙土和蛭石中, 并維持適宜的孵化溫度和濕度進(jìn)行孵化。

胚胎發(fā)育是受精完成后, 受精卵細(xì)胞根據(jù)染色體上遺傳信息, 以一種嚴(yán)格的程序有條不紊地生長(zhǎng)發(fā)育直至形成個(gè)體的過(guò)程。胚胎發(fā)育是新生命的起點(diǎn), 也是發(fā)育生物學(xué)的核心問(wèn)題之一。龜類胚胎發(fā)育的研究起始于Rathke和Agassiz等[4]學(xué)者。隨后的研究者對(duì)多種龜類如擬鱷龜(Chelydra serpentina)、西部錦龜(Chrysemys picta bellii)和紅耳龜(Trachemys scripta)胚胎發(fā)育過(guò)程的描述大多都是將發(fā)育中的胚胎從受精卵中取出后固定觀察[5—7]。黃喉擬水龜(Mauremys mutica)是我國(guó)大宗淡水養(yǎng)殖龜類, 研究材料比較容易獲得。在前期研究中,趙偉華等[10]利用Bouin’s固定液對(duì)黃喉擬水龜胚體進(jìn)行了固定, 再通過(guò)石蠟包埋切片及HE染色進(jìn)行觀察后將黃喉擬水龜胚胎發(fā)育分為了22個(gè)時(shí)期, 該方法存在需取樣多個(gè)受精卵且每個(gè)發(fā)育階段受精卵觀察后即死亡的缺點(diǎn)。在本研究中, 我們以黃喉擬水龜為研究對(duì)象, 通過(guò)無(wú)殼孵化技術(shù)對(duì)其活體的胚胎發(fā)育進(jìn)行了全程連續(xù)的觀察與記錄, 以期為龜類胚胎發(fā)育機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃喉擬水龜受精卵均取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所龜類繁育場(chǎng)。孵化設(shè)備選用恒溫孵化箱(泰宏珠江牌250升孵化箱FHX—250)。另準(zhǔn)備180 mL容量的一次性塑料杯, 一次性橡皮筋(直徑6.5 cm), 30 m×30 cm聚乙烯材質(zhì)保鮮膜(PE),酒精棉球, 15 cm扁圓型鑷子、滅菌水等工具提前進(jìn)行紫外線照射30min滅菌。

1.2 黃喉擬水龜受精卵無(wú)殼孵化操作方法

在黃喉擬水龜繁殖高峰期(5—7月), 選取當(dāng)天產(chǎn)的經(jīng)過(guò)光照觀察卵黃下沉具有可孵化性的黃喉擬水龜受精卵, 洗凈并用酒精擦拭消毒后置于超凈臺(tái)中。如圖1所示, 在一次性塑料杯中裝入一半體積的滅菌水(步驟一)。將具有防透水、隔菌功能的保鮮膜套入裝好滅菌水的一次性塑料杯中, 拉伸成形為凹狀、無(wú)褶皺的結(jié)構(gòu), 深度2—3 cm, 懸空, 用橡皮筋固定(步驟二)。隨后在超凈臺(tái)中用鑷子小心剝開(kāi)受精卵, 將內(nèi)容物打入凹狀結(jié)構(gòu)中。包裹內(nèi)容物的保鮮膜被杯口托起形成與真實(shí)卵殼相同的立體結(jié)構(gòu)和弧度(步驟三)。最后用保鮮膜將塑料杯口水平封住, 無(wú)褶皺, 并再次用橡皮筋固定, 固定處涂抹酒精消毒(步驟四)。放置于恒孵化箱中孵化, 控制孵化溫度為(32±0.5)℃, 設(shè)置孵化箱濕度為80%左右。每隔24h用手機(jī)(OPPO Reno Z自帶普通拍照模式)拍照記錄胚胎的發(fā)育情況。

圖1 無(wú)殼孵化操作示意圖Fig. 1 Schematic diagram of shellless incubation operation

2 結(jié)果

2.1 無(wú)殼孵化

已知傳統(tǒng)的辨別受精卵方法通常是以卵中部乳白色受精斑作為正常受精判別特征, 出現(xiàn)受精斑通常需要24—72h。若挑選帶受精斑的龜卵在剝離卵殼時(shí)都容易散黃, 極易失敗。而且時(shí)間越長(zhǎng), 卵清和卵黃越容易附著在卵殼上, 難以剝離。經(jīng)過(guò)多次反復(fù)試驗(yàn), 確定最佳去殼時(shí)間為當(dāng)天產(chǎn)出6h以內(nèi)的受精卵。在受精斑出現(xiàn)前, 如何判斷受精卵? 經(jīng)過(guò)對(duì)比觀察發(fā)現(xiàn), 剛產(chǎn)出不久的受精卵在光照下可以觀察到卵黃是下沉的, 而不受精的卵黃則懸浮于中央, 未下沉(圖2)。以此為依據(jù), 本次實(shí)驗(yàn)選取了10個(gè)受精卵, 剝離卵殼, 在(32±0.5)℃下, 孵化出稚龜7只, 成功率70%, 孵化期平均為54d。孵化積溫的變動(dòng)范圍為40704—43776℃·h, 平均孵化積溫為41472℃·h。

圖2 光照下受精龜卵卵黃下沉圖(A; ↑表示卵黃下沉位置)和光照下未受精龜卵卵黃圖(B; ↑表示卵黃懸浮位置)Fig. 2 The egg yolk sinking of fertilized turtle eggs under light (A; ↑ shows the position of egg yolk sinking) and the yolk of unfertilized turtle eggs under light (B; and ↑ shows the position of yolk suspension)

2.2 胚胎發(fā)育的分期及依據(jù)

在(32±0.5)℃恒溫孵化下, 參考前人的分類依據(jù), 根據(jù)胚胎發(fā)育的孵化時(shí)間, 胚胎大小、形態(tài)特征, 將黃喉擬水龜?shù)陌l(fā)育分為19個(gè)時(shí)期。1—7期以卵黃囊血管叢、心臟形態(tài)與跳動(dòng)作為分期依據(jù); 而8—19期主要以頭部、四肢、背甲、顏色和尿囊等作為分期依據(jù)。

2.3 胚胎發(fā)育過(guò)程與分期

第一期(孵化1—3d)龜胚中央部分, 肉眼可見(jiàn)外表清亮和半透明的明區(qū)。

第二期(孵化4d, 圖版Ⅰ-A)卵黃表面出現(xiàn)一些紅色小顆粒, 是血管叢的初始結(jié)構(gòu)。

第三期(孵化5d, 圖版Ⅰ-B)卵黃囊血管叢發(fā)生, 出現(xiàn)一個(gè)半徑0.8 cm左右的圓環(huán)血絲, 中間的胚體清晰可見(jiàn), 為脊索中胚層管。心臟原基發(fā)生,開(kāi)始出現(xiàn)輕微跳動(dòng)。

第四期(孵化6d, 圖版Ⅰ-C)血管叢變大,半徑變?yōu)?.5 cm左右。胚體呈乳白色, 胚體頭部心跳端往外發(fā)散出兩條較粗一點(diǎn)的血絲, 形成一個(gè)閉合圓環(huán)。胚體四周往外發(fā)散出25—30根左右樹(shù)枝狀細(xì)線, 連接圓環(huán)。中間胚體變粗, 胚體內(nèi)有一根比血管叢血絲粗的紅色血管。胚體內(nèi)部血管與外部血管之間聯(lián)系密切。軀干一端出現(xiàn)心跳, 另一端出現(xiàn)類似后肢和尾巴的雛芽。心臟分化成心房和心室, 呈囊狀, 大小與頭相當(dāng)。心臟搏動(dòng), 每分鐘79下左右。

第五期(孵化7d, 圖版Ⅰ-D)血管叢繼續(xù)變大。軀體變成“L”形?？梢?jiàn)胚體頭部明顯變大, 同時(shí)出現(xiàn)眼原基。四肢雛形出現(xiàn), 尾尖變細(xì)。心跳次數(shù)略微加快, 每分鐘85下左右。卵黃囊血管分支變多, 血液流動(dòng)更加頻繁, 胚胎內(nèi)部血管與外部血管聯(lián)系密切。

第六期(孵化8d, 圖版Ⅰ-E)卵黃囊血管叢擴(kuò)大至半徑2 cm左右。血液循環(huán)加劇。軀體變大,背部膨脹出現(xiàn)彎曲, 肢芽微突, 尾芽增加。后腸出現(xiàn)。心臟突出于腹外, 心跳次數(shù)加快, 每分鐘約100下左右。

第七期(孵化9d, 圖版Ⅰ-F)卵黃囊血管叢擴(kuò)大明顯, 分支越來(lái)越多, 越來(lái)越細(xì)。尾部體節(jié)形成。眼有少量色素沉積。后腸突出形成尿囊原基。心跳次數(shù)加快, 每分鐘110下左右。

第八期(孵化10d, 圖版Ⅰ-G)胚胎上方出現(xiàn)一透明膜狀物質(zhì), 類似羊膜與尿囊, 但并沒(méi)有將胚胎包被起來(lái)。咽鰓裂出現(xiàn)。枕骨高于額突。枝芽略伸長(zhǎng)。

第九期(孵化11d, 圖版Ⅰ-H)羊膜變大, 逐漸開(kāi)始將胚胎包被起來(lái)。尿囊肉眼可見(jiàn), 位于尾端,凸于胚體上方。胚胎周邊血絲略微變粗變明顯。視網(wǎng)膜有色素沉積但不是完全的黑色, 呈淺灰色,瞳孔呈白色。枕骨稍稍突起。前肢突出, 朝向尾部的方向。

第十期(孵化12d, 圖版Ⅱ-A)尿囊變大, 內(nèi)有血絲, 似蠶豆?fàn)? 靠近胚胎。眼點(diǎn)色素增加。羊膜變大, 覆蓋胚胎。開(kāi)燈觀察時(shí)胚胎會(huì)自我抽動(dòng)一兩下, 對(duì)光源敏感。胚體和四肢增厚且伸長(zhǎng)。

第十一期(孵化13—15d, 圖版Ⅱ-B)胚體變大, 頭部變大明顯, 占軀體約1/3。四肢呈槳狀。胚胎周圍幾根血絲變粗。尾變細(xì)長(zhǎng), 彎曲后尖端能接觸到尾巴基部。頭尾朝同一方向彎曲, 呈“C”狀。尿囊增大, 呈氣囊狀, 血管密布。眼點(diǎn)色素增加。羊膜腔擴(kuò)大。胚體包被在羊膜內(nèi), 胚體卵黃囊血管叢擴(kuò)大, 直徑變?yōu)?.5 cm, 該區(qū)域毛細(xì)血管豐富, 血液循環(huán)加劇。胚體透明, 四肢增大。出現(xiàn)咽縫。心臟完全縮于體內(nèi), 心跳次數(shù)不易統(tǒng)計(jì)。

第十二期(孵化16d, 圖版Ⅱ-C)卵黃囊血管叢血絲變粗變長(zhǎng)。光照觀察時(shí)會(huì)四肢抽動(dòng), 對(duì)光源敏感。背部側(cè)面出現(xiàn)模糊的褶皺, 同時(shí)背甲雛形開(kāi)始出現(xiàn)。尿囊增大, 呈袋狀。指板增大呈乒乓球拍狀。枕骨突起與頭部前段齊平, 咽縫消失。泄殖突出現(xiàn)突起。

第十三期(孵化17—18d, 圖版Ⅱ-D)喙開(kāi)始形成, 指板變得更加圓, 并有褶皺出現(xiàn)。胚體變得厚實(shí), 胚體頭部增大明顯, 占軀體比例大于1/3。背甲雛形線條逐漸明顯。背甲側(cè)面出現(xiàn)褶痕。四肢開(kāi)始出現(xiàn)爪子的分化, 即指脊。心跳速率不變。胚體顏色呈半透明。背甲變寬加厚。背甲雛形線條更加明顯, 背甲側(cè)面褶皺更加明顯。泄殖突突起異常明顯。

第十四期(孵化19—20d, 圖版Ⅱ-E)指與掌分化明顯, 指變長(zhǎng), 尾部出現(xiàn)部分色素沉淀。

第十五期(孵化21—24d, 圖版Ⅱ-F)背部色素變多, 手指突出指板的距離大于它的厚度。背甲中線有一突出的龍骨突。背甲、脊柱、胸甲的鱗甲都清晰可見(jiàn), 背部出現(xiàn)模糊方塊。吻端破殼齒明顯, 呈雪白色。

第十六期(孵化25—27d, 圖版Ⅱ-G)尾部著色加深, 出現(xiàn)黑色。鱗甲邊緣有色素沉著。第2—4手指長(zhǎng)度是厚度的兩倍。蹼與手指之間有輕微界限。背部開(kāi)始出現(xiàn)模糊的方塊, 顯微鏡下可見(jiàn)手掌出現(xiàn)橫向褶痕。

第十七期(孵化28—30d, 圖版Ⅱ-H)四肢爪變細(xì), 指甲變長(zhǎng), 指與蹼之間有凹槽, 指與第十六期明顯不同, 前端指骨變細(xì)。頭部、背部和尾部色素顏色加深, 尾巴出現(xiàn)鱗的輪廓并輕微著色。背部有清晰的方塊形紋路。肱盾、胸盾和股盾開(kāi)始開(kāi)始出現(xiàn)色素沉著, 呈淡灰色。

第十八期(孵化31—33d, 圖版Ⅲ-A)胚體大小約占卵黃的1/2。爪子前段有模糊的白色趾骨,頭部、四肢、肱盾、胸盾、股盾和甲橋色素沉著加深, 呈灰黑色。眼瞼能閉合。

第十九期(孵化33d—出殼, 圖版Ⅲ-B、C、D)胚胎整體形態(tài)與出殼后無(wú)異, 顏色紋路清晰。胚胎大小與卵黃相同, 卵黃被吸收后逐漸變小。四肢和尾巴表面鱗片紋路清晰, 整個(gè)尾巴都有顏色。頭部、腹中盾、胸盾、肱盾、甲橋、四肢和尾巴色素大量堆積呈黑色。尿囊中可見(jiàn)淡黃色廢液。

2.4 無(wú)殼孵出稚龜觀察

當(dāng)觀察到卵黃即將吸收干凈, 稚龜開(kāi)始往保鮮膜中排出代謝廢物時(shí), 就可以去掉保鮮膜, 將稚龜轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)盒中。從無(wú)殼孵化開(kāi)始至稚龜卵黃吸收干凈、臍帶脫落后共歷時(shí)53—55d。3d后投餌,吃食正常, 狀態(tài)與正常自然孵化出殼的稚龜無(wú)異(圖版Ⅲ-D)。

3 討論

3.1 龜鱉無(wú)殼孵化技術(shù)特點(diǎn)

在無(wú)殼孵化小雞實(shí)驗(yàn)中, 需要在入孵前加入一定量的乳酸鈣來(lái)代替卵殼中的鈣, 還需要加入青霉素鉀和硫酸鏈霉素達(dá)到抑菌目的。另外, 需要改造孵化容器, 增加通風(fēng)口, 并且在孵化18d后注入氧氣,代替19d雞胚啟用肺呼吸所需的氧氣[1]。對(duì)比無(wú)殼孵化小雞, 黃喉擬水龜受精卵無(wú)殼孵化方法明顯更簡(jiǎn)便。

由于目前龜鱉類胚胎發(fā)育的觀察方法多半是直接將處于發(fā)育的受精卵剖開(kāi)取出發(fā)育的胚胎, 安樂(lè)死后進(jìn)行固定保存觀察, 該方法存在以下缺點(diǎn):操作耗費(fèi)受精卵過(guò)多, 固定、切片和染色觀察等操作復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)。取出發(fā)育中的胚胎觀察后, 胚胎即停止發(fā)育然后死亡, 不能觀察同一個(gè)胚胎發(fā)育的全過(guò)程。例如Mahmoud等[6]在研究西部錦龜胚胎發(fā)育實(shí)驗(yàn)中共消耗了675個(gè)龜卵。因此, 使用無(wú)殼孵化技術(shù)進(jìn)行胚胎發(fā)育觀察, 可以在不傷害胚胎的情況下連續(xù)觀察一個(gè)完整個(gè)體胚胎發(fā)育的全過(guò)程, 這為未來(lái)無(wú)殼孵化的龜胚作為基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)等研究領(lǐng)域的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛蛳录夹g(shù)基礎(chǔ)。

3.2 龜鱉胚胎發(fā)育分期依據(jù)

關(guān)于龜類胚胎發(fā)育的研究, 國(guó)內(nèi)外都有報(bào)道。不同的學(xué)者根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)龜鱉胚胎發(fā)育進(jìn)行了分期。Yntema[5]以孵化時(shí)間劃分鱷龜胚胎發(fā)育的過(guò)程, 0—3期為無(wú)體節(jié)時(shí)期, 4—10期為體節(jié)時(shí)期,11—26為肢體時(shí)期。Mahmoud等[6]描述了西部錦龜胚胎發(fā)育分期主要基于形態(tài)學(xué)變化及胚胎的年齡和大小。Tokita等[8]依據(jù)感覺(jué)器官的發(fā)育、咽弓的形成、成對(duì)體節(jié)的數(shù)量和附肢的生長(zhǎng)劃分中華鱉(Pelodiscus sinensis)的胚胎發(fā)育進(jìn)展。由于發(fā)育的早期階段在所有龜類類群中都是類似的, Greenbaum[7]將紅耳巴西龜?shù)牡?1和第26發(fā)育階段之間選擇前肢形態(tài)和爪形態(tài)作為胚胎分期的標(biāo)準(zhǔn)。譚立軍等[9]研究了烏龜(Mauremys reevesii)的胚胎階段。根據(jù)外部形態(tài)特征和孵化溫度等因素的變化,分別描述了各階段的主要形態(tài)特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu), 并就烏龜發(fā)育分期的標(biāo)準(zhǔn): 原腸胚的形成、羊膜尾褶和后羊膜管、早期胚胎的自身運(yùn)動(dòng)等問(wèn)題進(jìn)行了討論。趙偉華等[10]將黃喉擬水龜胚胎發(fā)育分為了22期。其中 1—7 期以卵黃囊血管區(qū)、體節(jié)數(shù)目和心臟形態(tài)變化為主要分期依據(jù), 8—22期主要以四肢、背甲和腹甲變化為分期依據(jù)。楊志兵等[11]根據(jù)中華條頸龜(Mauremys sinensis)胚胎的日齡、大小和形態(tài)特征的變化將整個(gè)的胚胎發(fā)育分成了23期, 其中 9—23 期主要以四肢、背甲、腹甲、頭部和尾部等的變化為分期依據(jù)。王利華等[12]以中華鱉胚胎的日齡、形態(tài)特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化為主要依據(jù), 從中華鱉卵產(chǎn)出到稚鱉的孵出, 將整個(gè)胚胎的發(fā)育過(guò)程分為26期。第2—13期依據(jù)卵黃囊血管區(qū)、眼睛和心臟等形態(tài)變化進(jìn)行分期,14—26期是以四肢、背甲及腹甲的變化特征為主要分期依據(jù)。

3.3 無(wú)殼孵化與鈣、水分、空氣吸收的關(guān)系

爬行動(dòng)物的卵殼在其繁殖中起著保護(hù)和防止水分散失等重要作用。烏龜卵殼主要由鈣質(zhì)層與殼膜組成。烏龜卵殼的鈣質(zhì)層是由許多霰石結(jié)晶體結(jié)構(gòu)的殼單位組成, 氣孔就開(kāi)口于彼此相鄰的殼單位之間[13]。氣孔的存在方便了胚胎與外界進(jìn)行氣體交換。在鳥類卵殼中, 卵殼膜是阻止微生物感染胚胎的最后一道防線[14]。

在無(wú)殼孵化時(shí), 無(wú)菌操作和無(wú)菌保鮮膜的覆蓋阻止微生物感染胚胎, 起到擔(dān)任卵殼膜的作用。鈣是脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中需求量最高的礦物元素之一, 對(duì)胚胎的健康發(fā)育至關(guān)重要[15]。許多專家認(rèn)為, 龜鱉胚胎發(fā)育過(guò)程中需要大量的鈣, 卵內(nèi)鈣含量常常不能滿足胚胎發(fā)育的全部需要, 卵殼是胚胎發(fā)育的鈣等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要來(lái)源[16]。由文輝等[17]研究證明, 烏龜胚胎發(fā)育所需的54.1%的總鈣和12.3%的總鎂是由卵殼提供的。梁陽(yáng)陽(yáng)等[18]研究發(fā)現(xiàn), 在恒溫30℃孵化條件下, 烏龜胚胎發(fā)育的第40天, 卵殼開(kāi)始成為胚胎發(fā)育的主要鈣源。但是, 在本次無(wú)殼孵化試驗(yàn)中并未添加額外物質(zhì), 黃喉擬水龜胚胎正常發(fā)育并最終成功發(fā)育成正常且成活的稚龜個(gè)體。該稚龜與自然孵化的稚龜外觀上無(wú)差異。該研究證明, 卵殼的鈣源對(duì)胚胎發(fā)育成稚龜不是必需的。

在龜鱉孵化時(shí), 介質(zhì)的濕度對(duì)胚胎發(fā)育具有重要影響。孵化濕度會(huì)影響平背龜(Natator depressus)胚胎的孵化成功率[19]。朱新平等[20]研究證實(shí), 適當(dāng)?shù)臐穸葘?duì)孵化管理非常重要。龜卵吸收外界水分對(duì)補(bǔ)充卵清中的水分與保證胚胎有效地利用卵黃中貯存的能量具有重要意義[21]。郭撿紅等[22]研究發(fā)現(xiàn)孵化濕度對(duì)黃喉擬水龜胚胎發(fā)育的影響很小,但是孵化溫度與濕度的相互作用對(duì)黃喉擬水龜受精卵的質(zhì)量增加、孵化成功率和畸形率均有一定影響。在本研究中, 黃喉擬水龜去殼受精卵被保鮮膜封住, 卵內(nèi)水分與外界沒(méi)有交流, 卵本身水分支撐了胚胎發(fā)育全過(guò)程。這說(shuō)明在受精卵有殼狀態(tài)下, 外界的濕度主要是起到維持卵內(nèi)水分不喪失的作用。這與Booth和Yu[23]報(bào)道一致, 即龜卵在孵化過(guò)程中水分的增加或減少取決于卵內(nèi)容物和卵周圍基質(zhì)之間的水蒸氣壓差。如果卵內(nèi)部的水汽壓小于周圍基質(zhì)的水汽壓, 那么卵就會(huì)有獲得水分的傾向, 但如果卵內(nèi)部的水汽壓大于基質(zhì)的水汽壓,那么卵就會(huì)有失水的傾向。

氧氣和溫度的相互作用不僅影響中華鱉(Pelodiscus sinensis)胚胎的耐熱性和發(fā)育速率, 還影響孵化稚龜?shù)慕】迪嚓P(guān)性狀[24]。Lynn和Brand[25]研究發(fā)現(xiàn)隨著孵化天數(shù)的增加, 東方泥龜(Kinosternon subrurum subrurum)、擬鱷龜、三趾箱龜(Terrapene carolina triunguis)和東部錦龜(Chrysemys picta picta)四種龜?shù)呐咛ズ难趿恐饾u增加。在孵化后期, 在卵內(nèi)發(fā)育接近成熟的胚胎耗氧量和孵化出的稚龜無(wú)異。Gerardo等[26]研究結(jié)果證實(shí)了早期發(fā)育階段的錦龜(Chrysemys picta)胚胎對(duì)缺氧有彈性。Kam[27]研究發(fā)現(xiàn)將佛羅里達(dá)紅腹龜(Pseudemys nelsoni)受精卵30℃孵化19d后浸泡在水中24h, 仍有部分受精卵能繼續(xù)孵化。詹球等[28]研究也發(fā)現(xiàn), 烏龜具有極強(qiáng)的抗缺氧生存能力和特殊的抗低氧應(yīng)激機(jī)制。由于去殼受精卵被保鮮膜封住, 卵內(nèi)與外界空氣沒(méi)有交流, 僅依靠膜內(nèi)空間所含氧氣胚胎也能正常發(fā)育, 說(shuō)明胚胎對(duì)外界氧氣的要求極低。本研究進(jìn)一步證明龜鱉具有極強(qiáng)的自我生存能力。

3.4 龜鱉類無(wú)殼孵化應(yīng)用展望

隨著黃喉擬水龜龜胚無(wú)殼孵化的成功, 無(wú)殼孵化龜鱉胚胎有望成為一種新的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｒ勒蘸?jiǎn)單便捷的操作方法可以批量制造出龜鱉胚胎模型來(lái)應(yīng)用于基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)研究領(lǐng)域。無(wú)殼孵化使龜鱉胚胎發(fā)育可視化, 未來(lái), 龜鱉胚胎模型作為一種發(fā)育遺傳研究模型, 與顯微觀察更好地結(jié)合,能夠?yàn)辇旝M類胚胎具體發(fā)育性狀給出分期定義, 制定科學(xué)的分期標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí), 從育苗層面為龜鱉類新品種選育作出一定的貢獻(xiàn)。已知多種龜類屬于溫度依賴型性別決定(Temperature-dependent sex determination, TSD), 但其背后的分子機(jī)制尚未研究透徹。近些年有研究者們通過(guò)慢病毒RNA干擾及過(guò)表達(dá)技術(shù)進(jìn)行與龜鱉類性別分化相關(guān)基因的功能驗(yàn)證研究[29—31]。未來(lái), 龜鱉胚胎模型作為一種可以進(jìn)行多種分子生物學(xué)操作實(shí)驗(yàn)的載體模型, 能夠幫助找準(zhǔn)慢病毒的最佳注射時(shí)機(jī), 準(zhǔn)確避開(kāi)胚胎和血管, 以保證慢病毒液吸收效益并提高胚胎成活概率。同時(shí)能更直觀鑒定病毒組織感染程度, 從而推動(dòng)龜鱉類性別決定機(jī)制方面的研究進(jìn)展。在無(wú)殼孵化操作下, 黃喉擬水龜龜胚耐低氧能力極強(qiáng), 這種生理特性也許與龜鱉類保持長(zhǎng)壽的能力相關(guān)。詹球等[28]通過(guò)巴西龜缺氧潛水條件下血?dú)庵笜?biāo)檢測(cè)研究推測(cè), 巴西龜紅細(xì)胞的攜氧能力可約為人的兩倍, 暗示巴西龜紅細(xì)胞和血氧的親和力更強(qiáng)。已知在(32±0.5)℃孵化溫度下, 黃喉擬水龜龜胚在7d就能形成密集的血管叢。其易獲取和生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn), 有利于推動(dòng)研究血管形成和血管生物學(xué)方面的研究。未來(lái), 龜鱉胚胎模型作為一種生理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ? 有望為研究抗衰老醫(yī)學(xué)相關(guān)的生理生化機(jī)制提供參考。

圖版I Plate I

圖版Ⅱ Plate Ⅱ

圖版Ⅲ Plate Ⅲ