荔枝果渣可溶性膳食纖維去結合酚前后結構和功能性質的比較

許涵婷，唐語謙，胡騰根，余元善*，楊繼國，陳曉維

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）（2.廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所，農業(yè)農村部功能食品重點實驗室，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）（3.華工利亞（佛山）生物科技有限責任公司，廣東佛山 528012）

荔枝是一種具有傳統(tǒng)食藥用價值的嶺南佳果，含有多種對人體有益的生物活性成分[1]，主要分布于我國南方地區(qū)，我國荔枝的種植面積和產量均位列世界第一[2]。荔枝采收季節(jié)集中，但采后易褐變和腐爛，據統(tǒng)計，荔枝每年有20%以上因腐爛變質造成損失[3]。隨著農產品加工技術不斷創(chuàng)新和發(fā)展，荔枝加工產品的種類越來越豐富，荔枝酒、荔枝果汁等荔枝飲品深受廣大消費者喜愛，但在荔枝加工過程中會產生大量的可食用的荔枝果渣，產率為40%～50%[4]。目前工業(yè)上荔枝榨汁后產生的荔枝果渣大多被丟棄，造成環(huán)境的污染和資源浪費[5]。荔枝果渣富含膳食纖維等活性成分，具有很高的營養(yǎng)價值，可作為理想的膳食纖維來源，值得高度開發(fā)利用[6,7]。

膳食纖維是具有10個或10個以上單體單位的碳水化合物聚合物，其不能被內源性酶水解[8]。膳食纖維根據溶解性分為可溶性膳食纖維（SDF）和不可溶性膳食纖維（Insoluble Dietary Fiber，IDF）兩部分[5]。SDF可以溶于溫水和熱水中，而IDF不溶于水，二者均不能被人體消化系統(tǒng)水解[9]。研究表明膳食纖維可通過調節(jié)腸道菌群結構，增加菌群多樣性，從而有利于機體代謝平衡[8]。例如Zhu等[10]的研究發(fā)現(xiàn)從甘薯渣中提取的SDF可以減少小鼠腸道中的氣球菌屬等可誘發(fā)炎癥性疾病的有害細菌的豐度，并促進具有抗炎作用的有益細菌如乳酸桿菌和糞桿菌的增殖。

多酚是一大類廣泛存在于自然界、具有大量酚羥基結構單元的植物次生代謝產物[11]。按照結構分為類黃酮和非類黃酮化合物兩大類[12]，按性質可分為游離酚和結合酚。游離酚能夠通過簡單溶劑進行提取，結合酚與植物基質共價結合，不能被提取到水或有機溶劑[13]。許多研究已經報道了與游離酚類相比，結合酚類更強的抗氧化能力[9]。當食物中的結合酚進入人體時先在胃和小腸中消化，由于其不能被人體內酶系統(tǒng)消化，后進入到結腸，結腸中的腸道菌群降解植物基質的同時將其釋放出來[13]。因此，目前越來越多的研究聚焦于膳食纖維中結合的多酚在調節(jié)人體腸道健康方面發(fā)揮的作用。

荔枝果渣富含膳食纖維和多酚類物質，但目前關于荔枝果渣中可溶性膳食纖維及其結合酚的報道較少，為了進一步探明結合酚對荔枝果渣可溶性膳食纖維的結構和功能性質的影響，本研究以荔枝果渣中SDF為研究對象，揭示了去除結合酚對SDF表面形貌、傅里葉紅外、單糖組成、流變特性、抗氧化及益生活性的影響，為荔枝果渣可溶性膳食纖維和結合酚在調控腸道菌群與防治疾病關系方面提供理論基礎，為提高荔枝副產物的高值化利用提供實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝果渣，購于廣州順昌源綠色食品有限公司，為荔枝（品種為懷枝）去皮去核榨汁后產生的果渣，儲存于-20 ℃?zhèn)溆?。Folin-Ciocalteu、中性蛋白酶（100 U/mg）、α-淀粉酶（4 000 U/g），購于上海源葉生物科技有限公司；釀酒酵母RV002，購于安琪酵母股份有限公司；單糖標準品，美國Sigma公司；氫氧化鈉、DPPH、ABTS、碳酸鈉、95%乙醇及其他試劑均為國產分析純。本研究中，嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌、鼠李糖桿菌均由實驗室保藏提供。

1.2 儀器與設備

PB-10標準型pH計，德國Sartorius公司；ALC-210.4電子分析天平，德國ACCULAB公司；JW-1042低速離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；SU8000超高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日立高新技術公司；VERTEX70紅外光譜儀器，德國Bruker公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；ST85B3-1真空冷凍干燥機，美國Milirock公司；XDW-6B低溫粉碎機，濟南達微機械有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；SW-CJ-2FD無菌操作臺，蘇凈集團蘇州安康空氣技術有限公司；UV1800紫外分光光度計，日本島津公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-5OS型立式蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 荔枝果渣SDF的制備

參考Li等[14]的方法略作調整。將荔枝果渣與蒸餾水（1:20，m/V）混合，加入0.02%（m/m）活化的釀酒酵母28 ℃下發(fā)酵24 h。隨后，加入0.2%（m/m，2 000 U/g）α-淀粉酶在pH值6.0、60 ℃、150 r/min下水解1 h。此后，再加入1.0%（m/m，100 U/mg）中性蛋白酶并在pH值7.0、50 ℃下孵育1.5 h。將處理過的混合物以6 000 r/min離心10 min。上清液真空濃縮并以4倍體積的φ=95%乙醇在25 ℃下放置12 h。5 000 r/min離心10 min后，收集沉淀物用85%的乙醇反復洗滌后溶解在蒸餾水中，通過真空旋轉蒸發(fā)除去乙醇，然后冷凍干燥，得到荔枝果渣可溶性膳食纖維（SDF）。

1.3.2 脫酚可溶性纖維的制備

參考徐灼輝等[15]的方法略作調整。干燥的SDF稱重，按1:20（m/V）的比例加入4 mol/L的NaOH溶液，孵育90 min。將樣品以8 000 r/min離心10 min，保留上清液用于測量結合酚含量，沉淀加水裝入300 U的透析袋中透析至電導率和蒸餾水無差別后，凍干即得去結合酚荔枝果渣可溶性膳食纖維記為SDF-DF。

1.3.3 結合酚含量測定

參照Kwaw等[16]的方法，通過福林-酚試劑比色法測定結合酚的含量，含量以沒食子酸毫克當量表示。

1.3.4 單糖組成

參考張啟月等[17]的方法測定。準確稱取0.01 g待測樣品于螺紋頂空瓶，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸，100 ℃水解5 h后轉至旋轉瓶中。旋轉蒸發(fā)至干燥后，再加入1 mL甲醇旋轉蒸發(fā)至干燥，重復兩次，然后加入蒸餾水定容至1 mL，離心待用。采用外標法定量分析單糖含量，稱取一定量的標準品，用水稀釋至不同濃度衍生化處理后配置成混標制作標曲。

PMP衍生處理：取100 μL樣品液/標準單糖溶液于離心管中，加入200 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液，混勻后加入300 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，混勻后于70 ℃水浴1 h，冷卻10 min后拿出，再加入300 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，隨后加入1 mL氯仿渦旋振蕩萃取，8 500 r/min離心10 min，保留上清液，重復萃取三次。上清液用0.22 μm濾膜過濾后，待上機。

檢測條件：色譜柱為Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.05 mol/L pH值6.85磷酸鹽緩沖溶液:乙腈=82:18（V/V），流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL；柱溫為30 ℃；波長為250 nm。

1.3.5 靜態(tài)流變特性

樣品表觀粘度通過配備錐面幾何系統(tǒng)（直徑40 mm，間隙1 mm）的AR1500EX流變儀測定。在穩(wěn)定剪切試驗中，分析了在0.1～100 s-1剪切速率范圍和25 ℃下測量不同含量（2%、4%和8%，m/V）樣品溶液的表觀粘度。

1.3.6 掃描電子顯微鏡

用導電膠帶將樣品固定后對樣品進行噴金處理，于掃描電子顯微鏡1 000×觀察樣品表觀結構，并拍照采集圖像。

1.3.7 傅里葉變換紅外（Fourier Transform Infrared，F(xiàn)T-IR）光譜

通過Bruker Vertex 70，在370～4 000 cm-1下掃描樣品，分辨率為4 cm-1，累積32次，測定FT-IR光譜曲線。

1.3.8 抗氧化活性測定

1.3.8.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力參照Yan等[18]的方法并作適當修改。用無水乙醇制備130 μmol/L的DPPH溶液，用去離子水配置濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL樣品溶液。調零：1 mL樣品稀釋液+5 mL乙醇；空白：1 mL水+5 mL DPPH；樣品：1 mL稀釋后的樣品+5 mL DPPH，測定517 nm吸光值。清除率按公式（1）計算。

式中：

C1——DPPH自由基清除率，%；

A樣品1——1 mL稀釋后的樣品+5 mL DPPH溶液吸光度；

A空白1——1 mL水+5 mL DPPH溶液吸光度。

1.3.8.2 ABTS+自由基清除率能力測定

ABTS陽離子自由基清除能力參照李斌等[19]的方法并作適當修改。用去離子水制備7.4 mmol/L的ABTS溶液，與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，避光靜置過夜。用無水乙醇稀釋上述溶液直至在734 nm波長處吸光度為0.70±0.02。用去離子水配置質量濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL樣品溶液，取0.1 mL樣品溶液與3.6 mL的ABTS稀釋液混合，避光條件下反應20 min，于734 nm波長處測定吸光度。

式中：

C2——ABTS+自由基清除率，%；

A樣品2——0.1 mL稀釋后的樣品+3.6 mL ABTS溶液吸光度；

A空白2——0.1 mL水+3.6 mL ABTS溶液吸光度。

1.3.9 SDF和SDF-DF的體外益生發(fā)酵

參考Li等[14]的方法。首先，制備無碳源MRS基礎培養(yǎng)基。然后，將1%（m/V）樣品添加到無碳源MRS基礎培養(yǎng)基中，而無碳源MRS基礎培養(yǎng)基作為空白對照。所有MRS培養(yǎng)基均在121 ℃高壓滅菌20 min并冷卻至50 ℃，然后接種2%（V/V）的細菌懸浮液并在37 ℃下恒溫培養(yǎng)。取0、12、24 h菌液，通過測量發(fā)酵液的pH值和在600 nm處光密度（OD）來監(jiān)測菌株的生長情況。

1.3.10 數據分析

每組實驗三個平行，數據計算采用Microsoft Excel 2021，實驗結果表示為平均值±標準差。采用SPSS 26.0軟件進行數據顯著性分析，并采用Duncan多范圍檢驗方法，以P＜0.05表示差異顯著，用Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 結合酚含量

本實驗結果表明荔枝果渣可溶性膳食纖維中結合酚含量為4.53 mg GAE/g，龔小潔[20]通過堿水解測得懷枝果渣中結合酚的含量為5.41 mg GAE/g，徐灼輝[15]通過堿水解測得荔枝干果肉可溶性膳食纖維中結合酚的含量為0.29～3.66 mg GAE/g。

2.2 SDF和SDF-DF的微觀結構

圖1為SDF和SDF-DF的掃描電鏡下的微觀結構。SDF和SDF-DF都呈碎片狀，但SDF-DF呈卷曲薄片，結構更松散和碎裂，這可能是由于堿水解時氫氧化鈉的強氧化作用導致[21]，在強堿性環(huán)境下SDF中許多以結合形式存在的活性物質被釋放，且SDF被堿水解出現(xiàn)部分碎裂[15]。結果表明結合酚的存在有利于維系SDF表面形貌的穩(wěn)定[15]。

圖1 SDF和SDF-DF的掃描電子顯微鏡圖Fig.1 The scanning electron microscopy of SDF and SDF after removal of bound polyphenols

2.3 SDF和SDF-DF的FT-IR光譜分析

SDF和SDF-DF的FT-IR光譜如圖2所示?？梢钥闯觯琒DF和SDF-DF的大多數特征鍵是相似的。3 431 cm-1附近的寬振動峰是O-H基團的伸縮振動峰，1 200～1 400 cm-1范圍內為C-H角振動引起的吸收峰，這代表了碳水化合物骨架的典型結構[14]，2 937 cm-1處為C-H糖亞甲基的伸縮振動[22]，代表半纖維素的典型結構。1 748 cm-1是羧基生成的C=O的伸縮振動，1 620 cm-1附近的吸收峰是C=O的伸縮振動吸收，表明SDF和SDF-DF中存在多糖糖醛酸[23]。1 749.44、1 419.61、1 242.16 cm-1一般為低甲基果膠引起的吸收峰[17]。綜上所述，這些結果表明SDF和SDF-DF的主要成分為果膠和半纖維素，在堿水解去除結合酚的過程中未出現(xiàn)主要的官能團轉化，這與徐灼輝[15]和Liu等[24]的結果一致。

圖2 SDF和SDF-DF的紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of SDF and SDF-DF after removal of bound polyphenols

2.4 SDF和SDF-DF的單糖組成

表1分析了SDF和SDF-DF的單糖的組成和含量。研究發(fā)現(xiàn)，SDF和SDF-DF的單糖組成相同，但部分單糖含量有差異。SDF和SDF-DF中主要檢測到了8種單糖，其中阿拉伯糖的含量最高。SDF-DF中半乳糖醛酸（56.68 mg/g）和阿拉伯糖（216.93 mg/g）含量顯著高于SDF（P＜0.05）。半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖是果膠的典型成分[25]，果膠是一種重要的水溶性膳食纖維，主鏈由半乳糖醛酸經α-1,4-糖苷鍵鏈接形成，側鏈是由半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖等中性多糖組成[26]。堿水解去結合酚的過程中可能促使了一部分可溶性半纖維素的降解，使去酚后的SDF保留了更多的果膠結構。

表1 SDF和SDF-DF中單糖含量（mg/g）Table 1 Monosaccharide content in SDF and SDF-DF

2.5 SDF和SDF-DF靜態(tài)流變分析

如圖3所示，SDF和SDF-DF表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低，隨著樣品濃度的降低而降低，呈現(xiàn)出剪切稀化現(xiàn)象，這表明二者都為具有假塑性特性的非牛頓流體[14]；SDF和SDF-DF的表觀粘度也隨著濃度的增加相應增加，與Feng等[25]的實驗結果一致。在相同濃度和相同剪切速率下，SDF的表觀黏度遠大于SDF-DF，是由于SDF和SDF-DF在高剪切速率下分子骨架發(fā)生重排，SDF-DF的微觀結構更松散不能形成更細的網絡從而導致黏度降低[14]，SDF的功能性質很大程度上取決于黏度[17,27]。

圖3 不同質量濃度SDF和SDF-DF水溶液的黏度曲線Fig.3 The viscosity curves of S SDF and SDF-DF aqueous solution with different mass concentrations

2.6 SDF和SDF-DF抗氧化能力

本實驗通過測定ABTS陽離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力來比較堿水解去除結合酚前后SDF的體外抗氧化活性。由圖4和圖5可以發(fā)現(xiàn)，隨著樣品濃度的增加，SDF和SDF-DF對DPPH自由基清除能力及對ABTS陽離子自由基清除能力逐漸增加。而SDF對ABTS陽離子自由基清除活性隨濃度的變化沒有顯著變化（P＞0.05），維持在85.01%～90.59%，顯著高于SDF-DF的清除活性（6.03%～48.53%）（P＜0.05）；同時，SDF的DPPH自由基清除活性在56.13%～85.95%，而SDF-DF的清除活性在27.11%～70.88%之間。上述結果表明，SDF較SDF-DF有更高的抗氧化活性，這是由于結合酚被釋放引起的，有研究表明結合酚的去除會影響胡蘿卜膳食纖維的抗氧化活性[24]。

圖4 SDF和SDF-DF的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activities of SDF and SDF-DF

圖5 SDF和SDF-DF的ABTS自由基清除能力Fig.5 ABTS radical scavenging activities of SDF and SDF-DF

2.7 SDF和SDF-DF體外益生活性

由圖6和圖7可知，益生菌在SDF培養(yǎng)基中的生長速度在0～12 h較快，在12～24 h生長速度趨于平緩；相比于SDF，益生菌在以SDF-DF為碳源的培養(yǎng)基中生長速度較緩慢，在無碳源培養(yǎng)基中幾乎不生長（P＞0.05）。在SDF培養(yǎng)基中，益生菌的增長量遠高于以SDF-DF為碳源的培養(yǎng)基（P＜0.05），這可能是由于益生菌發(fā)酵SDF時釋放出了結合多酚從而更好的促進益生菌的生長；比較培養(yǎng)基中pH值的變化可以發(fā)現(xiàn)，SDF培養(yǎng)基中pH值的降低程度顯著高于SDF-DF培養(yǎng)基，這是由于SDF培養(yǎng)基促進益生菌的生長效果更好，益生菌的產酸量高于SDF-DF培養(yǎng)基（P＜0.05）。

圖6 三種益生菌在不同碳源培養(yǎng)基中OD600的變化Fig.6 Change of OD600 of three probiotics in different carbon source medium

圖7 三種益生菌在不同碳源培養(yǎng)基中pH值的變化Fig.7 Change of pH of three probiotics in different carbon source medium

綜上，通過體外益生實驗發(fā)現(xiàn)，3種益生菌在無碳源培養(yǎng)基中無明顯增長，在以SDF培養(yǎng)基中生長的最好，并且3種益生菌在SDF和SDF-DF培養(yǎng)基中的生長情況以及pH值的變化具有顯著差異。盡管不同的菌種對逆環(huán)境的耐受能力不同可能會導致其對菌種的生長增殖產生影響[28]，SDF對3種益生菌的促生長效果都顯著優(yōu)于SDF-DF。結果表明結合酚的去除極大的影響了其益生活性，這證實結合酚對可溶性膳食纖維的益生活性具有重要影響，這與Liu等[24]的結論一致。

3 結論

本文通過堿水解去除SDF中的結合酚，并研究了去除結合酚前后SDF結構和功能性質的變化。堿水解去除結合酚后，SDF的整體結構更加松散和碎裂，但沒有出現(xiàn)官能團的轉化。SDF和SDF-DF的單糖組成相同，但SDF-DF更加疏松的結構使其表觀黏度低于SDF。SDF去結合酚后，DPPH自由基清除能力和ABTS陽離子自由基清除能力明顯下降，并且3種益生菌在SDF-DF培養(yǎng)基中的生長情況都不如SDF培養(yǎng)基，表明結合酚在SDF的抗氧化活性和益生活性中起著重要作用。綜上所述，結合酚與荔枝果渣可溶性膳食纖維的營養(yǎng)價值息息相關，本研究將為評價荔枝果渣可溶性膳食纖維作為腸道益生元提供理論依據。