磁固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定飲料中罌粟堿

田潔，曹淑瑞，蘇泓滔，巫端浩，劉正宏

（1.西南政法大學鑒定中心，重慶 401120）（2.西南政法大學鑒定中心，刑事偵查學院，重慶 401120）

罌粟殼俗稱大煙，是罌粟的干燥成熟果殼。雖然具有藥用價值，例如斂肺、澀腸和止痛等，但久服產(chǎn)生依賴性和成癮性[1]。罌粟堿是罌粟殼的主要生物堿之一，其分子結(jié)構(gòu)見圖1。長期食用會產(chǎn)生精神失常，出現(xiàn)幻覺，甚至因呼吸停止而引起死亡[2]。飲料作為大眾消費品，在國內(nèi)占有很大市場，不法商販為謀取利益在飲料中添加過量的罌粟堿，長期低劑量飲用會有成癮性和依賴性，大劑量服用甚至危及生命[2]。

圖1 罌粟堿的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of papaverine

在國內(nèi)，檢測罌粟堿的方法有氣相色譜法[3,4]、高效液相色譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜法[6-8]等。對罌粟堿樣品進行分析檢測前均需要對樣品提取、凈化、濃縮等操作。磁性固相萃?。∕SPE）屬于固相萃取法中的一種新型方法。其原理是將磁性吸附劑添加到樣品溶液中，目標組分經(jīng)分子擴散快速地從溶液中被吸附到吸附劑中，然后利用外部磁場，目標組分同吸附劑一同被遷移，最終選取合適洗脫溶劑洗脫目標組分，實現(xiàn)分離[3]。與傳統(tǒng)的固相萃取法相比，MSPE既具有磁性強，可重復利用，萃取操作簡單等特點，而且可以避免繁瑣的離心等操作[9,10]。此外，氣相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏度高、回收率好的優(yōu)點。二者聯(lián)用對樣品進行分析，可使分析過程更加簡單快速，準確。

吸附劑材料是磁性固相萃取技術(shù)的重要組成部分之一。目前磁性納米材料有殼聚糖[11]、離子液體[12]、聚多巴胺[13]、氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）[14]等。其中，GO具有大比表面積和豐富的官能團，可以使目標物固定在結(jié)合位點上[15,16]，通過π-π相互作用和氫鍵作用吸附芳香族有機分子。Fe3O4基納米材料由于其優(yōu)異的磁性能而備受關(guān)注，其除了具有磁性的優(yōu)良特性外，還具有隧道效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)以及表面效應(yīng)等特點[17]。Fe3O4與GO的復合使得GO的結(jié)合位點充分暴露且具有磁性，有利于目標分子的選擇性吸附和分離。在復合材料的合成過程當中，修飾特定的官能團，與目標物通過非共價鍵作用實現(xiàn)高效吸附，再通過選擇合適的洗脫溶劑從而實現(xiàn)高效分離。本研究旨在合成一種磁性強、吸附性能好的磁性氧化石墨烯材料（Fe3O4@GO），通過單因素法和響應(yīng)面法優(yōu)化實驗中的吸附和解吸條件，再結(jié)合GC-MS法檢測；從而建立飲料中罌粟堿的快速高效的MSPE-GCMS檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

氧化石墨烯（GO），山東利特納米技術(shù)有限公司；罌粟堿標準品，純度99.8%，CFW Laboratories Inc；HCl、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、NaOH，成都市科隆化學品有限公司；甲醇、乙醇、乙腈，霍尼韋爾（中國）有限公司。

主要儀器：ISQ 7000氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；S-024氮吹儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；Quanta Q400掃描電子顯微鏡、FEI TECNAI G2 F20透射電子顯微鏡，美國FEI公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津有限公司；HR800拉曼光譜儀，法國JobinYvon公司；MPMS（SQUID）XL-7振動樣品磁強計，美國量子設(shè)計公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Fe3O4@GO的制備

采用化學共沉淀法制備材料。具體制備過程如下：溶液A：稱取0.15 g的GO粉末于100 mL的超純水中，超聲處理1 h得到均勻分散的GO分散液。溶液B：在氮氣流下，將1.8 g的FeCl3·6H2O和0.8 g的FeCl2·4H2O分散在裝有50 mL超純水的三頸燒瓶中。再將溶液A快速加入到裝有溶液B的三頸燒瓶中，在80 ℃下用磁力攪拌器劇烈攪拌1 h后，加入10 mL 8 mol/L的氨水，劇烈攪拌30 min后等待自然冷卻。所得黑色產(chǎn)物用外部磁體進行收集并用乙醇和超純水多次洗滌以除去未反應(yīng)的化學物質(zhì)，然后在60 ℃的烘箱中干燥樣品。所得產(chǎn)物為磁性氧化石墨烯（Fe3O4@GO）。

合成磁性四氧化三鐵的反應(yīng)如下（式1）：

1.2.2 磁性固相萃取過程

量取2 mL的含罌粟堿待測液于10 mL的離心管中，用適量濃度的鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7，加入15 mg的Fe3O4@GO納米材料，水平振蕩儀振蕩30 min，通過外部磁場收集溶液中的磁性材料，棄除上清液，向離心管中加入2 mL解吸溶液，振蕩解吸6 min，用永久磁鐵吸引富集，移取所有上清液進行氮吹操作；近干后用2 mL正己烷溶液進行復溶，最后樣品溶液用0.22 μm濾膜過濾后再上機檢測。

1.2.3 GC-MS檢測條件

色譜柱：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；

升溫程序：起始溫度70 ℃保持1 min，然后升溫至280 ℃（升溫速率20 ℃/min）保持5 min，再升溫至300 ℃（30 ℃/min）保持2 min。

儀器條件：溫度的設(shè)定為進樣口260 ℃，傳輸線250 ℃，離子源300 ℃；進樣量2.0 μL；不分流進樣；掃描方式：SIM。

1.2.4 Fe3O4@GO的表征

使用掃描電子顯微鏡、透射型電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、振動樣品磁強計及拉曼光譜儀對磁性吸附劑Fe3O4@GO的形貌、官能團及磁化性質(zhì)進行表征。

1.2.5 吸附條件的優(yōu)化

以罌粟堿回收率為指標，考察單因素對測定罌粟堿的回收率的影響，考察的因素水平如表1所示。

表1 單因素實驗設(shè)計Table 1 Single factor experimental design

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素優(yōu)化實驗的結(jié)果，以pH值（A）、萃取劑劑量（B）、解吸時間（C）為變量，以罌粟堿的回收率為考察指標，設(shè)置三因素三水平的設(shè)計實驗，見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗表Table 2 Response surface optimization experiment

1.2.7 樣品回收率的分析

在過濾后的待測樣品溶液中，加入1 mL已知濃度的罌粟堿溶液，混合均勻后再經(jīng)過萃取凈化?；厥章实挠嬎惴椒ǎㄊ?）：

式中：

R——加標回收率，%；

C0——加標濃度，μg/mL；

V0——加標體積，mL；

C——加標后測定濃度，μg/mL；

C'——加標前濃度，μg/mL；

V——加標后總?cè)芤后w積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@GO的表征分析

2.1.1 掃描電鏡分析

從圖2a可觀察到GO呈片狀二維結(jié)構(gòu)，表面伴有許多褶皺。這些褶皺能夠使磁性納米粒子（Fe3O4）更容易負載在其結(jié)構(gòu)中。由圖2c可觀察到GO表面結(jié)合了很多粒徑較小的納米粒子，結(jié)合圖2b可知是這些粒子正是Fe3O4，可以表明Fe3O4已經(jīng)成功負載于氧化石墨烯上，磁性氧化石墨烯納米材料（Fe3O4@GO）被成功合成。

圖2 掃描電鏡圖（a）GO，（b）Fe3O4，（c）Fe3O4@GOFig.2 SEM (a) GO; (b) Fe3O4; (c) Fe3O4@GO

2.1.2 透射電鏡分析

由圖3a可清楚地觀察到Fe3O4@GO中氧化石墨烯的片層結(jié)構(gòu)和褶皺，圖中顏色較深的粒子為Fe3O4納米粒子，透射電鏡分析再次證明了Fe3O4納米粒子已經(jīng)成功負載在氧化石墨烯中，其粒徑約為10～20 nm。

圖3 （a）透射電鏡圖、（b）紅外光譜圖、（c）拉曼光譜圖、（d）磁滯回線Fig.3 (a) TEM; (b) FT-IR; (c) Raman; (d) VSM

2.1.3 紅外光譜分析

紅外光譜作為材料常見的表征方法之一，從紅外圖譜中可以獲取有關(guān)化學鍵合和官能團的相關(guān)信息。由圖3b可知，GO和H2O中羥基的伸縮振動顯示在3 290 cm-1寬峰處[18]，1 631、1 397、1 087 cm-1分別是芳香基C=O、C=C、C-O-C的伸縮振動峰[19]，說明GO結(jié)構(gòu)中含有-OH、C=O、C=C和C-O-C等官能團。在588 cm-1處為Fe-O的伸縮振動峰[20]，說明Fe3O4@GO已成功合成。

2.1.4 拉曼光譜分析

由圖3c可見，F(xiàn)e3O4@GO的拉曼光譜圖中在波長為1 327 cm-1和1 593 cm-1位置出現(xiàn)兩個峰。在1 327 cm-1處出現(xiàn)的為D吸收峰，1 593 cm-1的峰為G吸收峰。D峰為一種非對稱性的聲學振動峰，是由sp3雜化的碳原子呼吸振動產(chǎn)生的，用來表示物質(zhì)內(nèi)部的結(jié)構(gòu)缺陷情況[21]；G峰的對稱性高，是因為碳原子的sp2雜化，其表示結(jié)構(gòu)的對稱性[22]。D峰的出現(xiàn)表明Fe3O4@GO具有一定的缺陷結(jié)構(gòu)。

2.1.5 振動樣品磁強計

圖3d為Fe3O4@GO的磁滯回線。磁滯回線通過并以原點為中心，呈光滑的S形，零矯頑力，無剩磁現(xiàn)象。其飽和磁化強度為72.5 emu/g，強的磁化強度說明制備的材料具有強磁性，能夠滿足磁性分離的要求。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

為了能夠高效率的實現(xiàn)吸附劑對樣品溶液的解吸和萃取，本實驗對吸附劑用量、溶液pH值、萃取時間、解吸時間四個條件進行了優(yōu)化。

2.2.1 吸附劑用量的優(yōu)化

吸附劑用量的影響是吸附過程中需要考慮的主要因素。在不改變其他條件的情況下，設(shè)計Fe3O4@GO用量分別為5、10、15、20、25 mg，按照1.3.2方法進行實驗。如圖4a所示，結(jié)果表明，罌粟堿的回收率會隨著吸附劑用量的增加而增大，最終當用量增加到15 mg，回收率基本穩(wěn)定。這是因為Fe3O4@GO納米吸附材料提供了更多的活性吸附位點，萃取回收率隨著Fe3O4@GO納米吸附劑的增加而增加。而當進一步增加Fe3O4@GO吸附劑的用量，由于活性位點的飽和，罌粟堿的回收率沒有顯著提高。因此，確定吸附劑用量為15 mg。

2.2.2 溶液pH值的優(yōu)化

由于溶液的pH值對分析物的存在形式（質(zhì)子化或去質(zhì)子化）和吸附劑表面的電荷密度有很大影響，因此溶液的pH值在吸附過程中對萃取效率起著關(guān)鍵作用[23]。通過NaOH溶液和HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值來考察pH值對萃取結(jié)果的影響。通過查閱文獻可知，最佳pH值在呈中性左右[24,25]，因此實驗只考察pH值在4～8的范圍內(nèi)對罌粟堿回收率的影響，如圖4b所示，pH值為7時吸附性能最佳，當pH值從4增加到7時，回收率增大；當pH值進一步增加時，回收率又逐漸降低。

2.2.3 萃取時間的優(yōu)化

要達到良好的萃取效果需要足夠的時間。其余實驗條件不變，選擇振蕩時間分別為從5、10、20、30、40、50、60 min。按1.3.2實驗方法，實驗結(jié)果如圖4c所示，萃取時間在30 min時回收率最大，說明此時吸附劑與目標組分之間吸附達到動態(tài)平衡。隨后延長吸附時間，回收率反而略有下降。這是因為Fe3O4@GO吸附位點已被完全占據(jù)，在30 min時獲得飽和吸附量，之后有少量分析物因為吸附不牢固從而從吸附劑表面脫離重新進入樣品溶液。因此，為使罌粟堿在吸附劑上吸附完全，選擇30 min為最佳吸附時間。

2.2.4 解吸時間的優(yōu)化

解吸時間也是影響萃取效率的重要因素。根據(jù)查閱相關(guān)文獻[26,27]，含有一定的氨的解吸劑有利于提高罌粟堿的回收率，所以甲醇:氨水=99:1被選為解吸劑。為了促進罌粟堿的轉(zhuǎn)移和均勻分布，采用振蕩技術(shù)從Fe3O4@GO吸附劑中分離罌粟堿。其余實驗條件不變，在2～20 min范圍內(nèi)檢測振蕩時間對回收率的影響。結(jié)果圖4d表明，在5 min時解吸效率最佳，隨后隨著時間的增加，效率開始降低，因此選擇5 min為最佳解吸時間。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

綜合分析單因素實驗結(jié)果，以pH值（A）、吸附劑劑量（B）和解吸時間（C）3個因素為自變量，以罌粟堿的回收率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化。響應(yīng)面實驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 The experimental design and results of response surface optimization

2.3.1 方差分析

根據(jù)表3結(jié)果，進行方差分析，結(jié)果見表4。對實驗數(shù)據(jù)進行擬合，建立回歸模型，其線性方程（式3）：

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

該模型的P值小于0.01，表明差異極顯著，此次建模成功，可以被利用。失擬項P值為0.198 9，表明差異不顯著，進一步說明所得建立的回歸模型方程與實際實驗過程中擬合中的非正常誤差所占比例較小，可以用該回歸方程取代實驗中的真實點對實驗結(jié)果進行建模分析。

2.3.2 各因素交互作用分析

圖5是根據(jù)回歸分析結(jié)果作出的有關(guān)溶液pH值、磁性納米材料用量、解吸時間3因素對罌粟堿回收率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖，展現(xiàn)了各因素交互作用對回收率的影響。由圖5a～b、e～f可看出，pH值與吸附劑劑量、吸附劑劑量與解吸時間的響應(yīng)面圖不呈凸形曲面且分別對曲線最高點影響均較小，等高線圖交互作用都不顯著。而圖5c～d曲面較為陡峭且等高線圖呈現(xiàn)出橢圓形的形態(tài)，表明解吸時間和pH值對回收率的交互作用較為明顯，方差分析佐證交互關(guān)系顯著。通過統(tǒng)計軟件Design-Expert對所模擬的模型進行優(yōu)化和求解，得到檢測液體中罌粟堿的最佳實驗條件是：溶液pH值為7，磁性納米材料用量為15 mg，解吸時間為6 min。

圖5 溶液pH值與吸附劑劑量（a、b）、溶液pH值與解吸時間（c、d）、吸附劑劑量與解吸時間（e、f）交互作用對罌粟堿回收率的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 The response surface plot and contour map of the interaction between solution pH and adsorbent dosage (a, b),solution pH and desorption time (c, d), adsorbent dosage and desorption time (e, f) on the recovery rate of papaverine

2.4 標準工作曲線、相對標準偏差及檢出限

在最優(yōu)條件下：溶液pH值為7，磁性納米材料用量為15 mg，萃取時間30 min，解吸時間6 min，評估所建立的方法。實驗結(jié)果總結(jié)在表5。在0.10～2.00 μg/mL范圍內(nèi)，罌粟堿的峰面積與濃度有著良好的線性關(guān)系，R2為0.999 3。以3倍信噪比計算檢測限，檢測限為0.038 μg/mL；質(zhì)量水平1.0 μg/mL進行6次重復實驗，獲得的方法回收率在97%～103%范圍內(nèi)，RSD為1.96%，表明該方法準確度和重復性良好。

表5 線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、相對標準偏差和檢測限Table 5 Regression equation, correlation cofficient, linear range and detection limits

2.5 實際樣品分析

在實際樣品分析中，按照建立的檢測方法對所購買的三種飲料（冰紅茶、脈動、紅牛）進行分析檢測。每個樣品平均做3次，均未檢測出罌粟堿。為了驗證方法的準確度，在這三種飲料中分別加入濃度為0.1、1.0、2.0 μg/mL的罌粟堿標液進行分析。檢測結(jié)果總結(jié)于表6，其加標回收率在98.4%～105.0%范圍內(nèi)，相對標準偏差為0.6%～3.5%，表明此方法具有良好的準確度，可以用于檢測飲料中罌粟堿的含量，能夠滿足實際檢測需求。

表6 實際樣品測定結(jié)果表Table 6 The actual sample measurement results (n=3)

3 結(jié)論

采用簡單的化學共沉淀法制備了磁性氧化石墨烯復合納米材料，材料具有良好的磁性，可以實現(xiàn)快速分離，是一種良好的吸附劑。本研究將Fe3O4@GO作為吸附劑，萃取飲料中的罌粟堿，再結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜進行測定，最終實驗方案為：樣品溶液pH值7、吸附劑用量為15 mg、萃取時間30 min、甲醇:氨水=99:1（V/V）、解吸劑體積2 mL、解吸時間6 min。結(jié)果表明，建立的方法具有良好的重復性和準確度。該方法不僅操作簡單，快速準確，而且靈敏度較高，回收率滿足檢測的要求。有望應(yīng)用于實際，為質(zhì)檢部門對食品監(jiān)管、打擊食品中非法添加物和禁毒工作提供一定的技術(shù)參考。