不同貯藏溫度下稻花雞肉的品質(zhì)及細菌組成多樣性變化

劉夢竹，向蓉，魏琦麟，康樺華，涂杜，田雅，吳俊儀，徐志宏*

（1.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室肇慶分中心,廣東肇慶 526238）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站,廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室,廣東廣州 510640）（3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

稻花雞又名雪花雞，屬靈山彩鳳雞種，因其耐寒性較差，適合在南方養(yǎng)殖，在廣東江門五邑、廣西等地養(yǎng)殖較多。稻花雞是用靈山香雞與野雞經(jīng)過30多年雜交馴化而成的品種，白色羽毛間夾雜著一些黑色的斑點，在雞群中的辨識度很高，公雞28日齡左右開始開啼，80～90日齡性成熟，150～170日齡體成熟，體質(zhì)量1.30～1.60 kg，母雞140～150日齡體成熟，體質(zhì)量1.00～1.20 kg，脂肪含量低，肌肉組織發(fā)達[1]，煮熟后皮脆，脂肪少，吃起來口感細膩，雞味濃郁，是廣東地區(qū)制作白切雞菜肴的重要原料，市場銷售量也日趨增大[2]。廣東等南方省份習慣用熱鮮雞肉制作食品，但在生鮮雞上市的政策下，有關(guān)不同貯藏溫度下品質(zhì)研究較少，貯藏期微生物的組成與變化未見研究報道。

雞肉在加工、運輸、貯藏及銷售等環(huán)節(jié)中保持良好品質(zhì)和防止其腐敗變質(zhì)的因素備受關(guān)注[3]，貯藏時間、貯藏溫度、包裝氣體組成是影響肉制品腐敗變質(zhì)主要因素[4-6]，直接導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的微生物即腐敗菌是影響肉制品腐敗變質(zhì)的根本因素[7,8]。食品中微生物通過相互競爭或協(xié)同作用等種群關(guān)系對食品腐敗變質(zhì)產(chǎn)生至關(guān)重要的影響[9]，雞肉中微生物多樣性變化是探索其腐敗變質(zhì)的重要方法和途徑[10,11]。基于16S rRNA的高通量測序[12-15]，變性梯度凝膠電泳（DGCE）[16]和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）[17]等技術(shù)在研究微生物多樣性中得到廣泛應(yīng)用，其中高通量測序具有測樣品量大，工作流程集約化、用時短、可檢測尚未培養(yǎng)的細菌、可檢測微生物群落特征、能對微生物進行功能分析等特點[18,19]，在研究食品腐敗微生物變化規(guī)律中得到廣泛應(yīng)用[20]。宋相宇等[21]采用高通量測序技術(shù)對不同包裝方式和貯藏溫度下白切雞優(yōu)勢腐敗微生物進行了研究，得出在不同貯藏方式下優(yōu)勢腐敗微生物有顯著差異性。叢筠格等[12]通過高通量測序分析出德州扒雞的優(yōu)勢腐敗菌，針對優(yōu)勢腐敗菌的抑制效果篩選保鮮劑。高通量測序技術(shù)檢測到的菌屬更具多樣性，可檢測出對環(huán)境要求苛刻且豐度低的微生物，能有效彌補傳統(tǒng)培養(yǎng)基對腐敗菌鑒定方法的不足之處，能為研究肉制品優(yōu)勢腐敗菌群變化以及研究雞肉貯藏保鮮技術(shù)提供技術(shù)支持。

因此，本文以新鮮稻花雞為研究對象，研究雞肉在三種不同貯藏溫度下的貨架期及品質(zhì)變化?；?6S rRNA高通量測序方法，研究雞肉在貯藏初期，腐敗期及腐敗后期微生物組成變化情況，探究影響雞肉腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢腐敗菌及腐敗過程中微生物變化規(guī)律，為研究稻花雞肉貯藏保鮮技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮稻花雞，購于恩平興宇生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司。生鮮托盤，購于桐城市陽光塑業(yè)有限公司。聚乙烯保鮮膜，佳能食品級保鮮膜25 m×20 cm。550 mL瓶裝飲用水，購于農(nóng)夫山泉股份有限公司。黑麥面包、橡皮糖、花生粘糖、鮮檸檬、紙杯子、塑料杯等，購于家樂福超市。平板計數(shù)瓊脂，購于廣東環(huán)凱生物科技有限公司。分析純氯化鈉，購于廣州化學(xué)試劑廠。分析純氧化鎂、硼酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、甲基紅指示劑等，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。DNA抽提試劑盒，購于FastDNA? Spin Kit for Soil美國MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ300-SH均質(zhì)機，上海標本模型廠；DHG-9042A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ALC-210.4電子分析天平，賽多利斯愛科勒公司；PB-10 pH計，廣州市深華生物技術(shù)有限公司；LRH生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；K8400自動凱氏定氮儀，瑞典福斯公司；Eppendorf N13462C移液器，德國Eppendorf公司；Eppendorf 5424高速臺式離心機，德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp?9700PCR儀，美國ABI公司；Illumina Miseq測序儀，美國Illumina公司；K型熱電偶、LK-1048U多路溫度巡檢儀，常州市藍光電子有限公司；GQZ60-02XG控溫型保鮮箱，天津捷勝東輝保鮮科技有限公司定制；HWS智能型恒溫箱，寧波江南儀器廠制造；5Q6892威瑪?shù)聹貪穸葯z測儀，廣州威德瑪環(huán)境儀器有限公司。

1.3 實驗方法

購買于恩平興宇生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司的稻花雞為當天凌晨屠宰的生鮮稻花雞，均已度過僵直期，預(yù)先消毒托盤覆蓋包裝，外包裝酒精消毒后迅速放入超凈臺中，用滅菌后的手術(shù)刀無菌分割取完整雞胸和雞腿肉，每個預(yù)先消毒的生鮮托盤放置一塊完整雞胸肉和一只雞腿，用保鮮膜覆蓋托盤包裝[22]。將包裝后的3份樣品用于冰點測定，22份雞肉樣品置于25 ℃常溫保存，30份雞肉樣品置于4 ℃冷藏保鮮，通過冰點測定實驗得知，稻花雞胸肉和雞腿肉的冰點分別為-0.7 ℃和-0.5 ℃，40份樣品冰溫貯藏在定制的控溫型保鮮箱中，經(jīng)溫濕度儀測定其溫度在0 ℃至-0.5 ℃之間波動，確保稻花雞肉保持冰溫貯藏。

1.3.1 樣品采集

1.3.1.1 25 ℃常溫保存

0、0.50、1、1.5、2、3 d取雞胸肉與雞腿肉1:1混合樣本測定pH值、水分含量、菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮，一個托盤里完整生鮮雞胸肉和雞腿作為一份生雞肉感官評定樣本，每份雞胸肉和雞腿肉加500 mL純凈水煮12 min待溫度降到45 ℃作為熟雞肉感官評定樣本。根據(jù)貨架期選0、0.50、2 d即貯藏初期、腐敗期、腐敗后期進行16S rRNA高通量測序，試驗周期3 d。

1.3.1.2 4 ℃冷藏保鮮

0、0.50、1、1.5、2、3、4、6、10 d取雞胸肉與雞腿肉1:1混合樣本進行pH值、水分含量、菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮實驗，一個托盤里完整生鮮雞胸肉和雞腿作為一份生雞肉感官評定樣本，每份雞胸肉和雞腿肉加500 mL純凈水煮12 min待溫度降到45 ℃作為熟雞肉感官評定樣本。根據(jù)貨架期選0、4、8 d即貯藏初期、腐敗期、腐敗后期進行16S rRNA高通量測序，試驗周期10 d。

1.3.1.3 0 ℃冰溫貯藏

0、0.50、1、1.5、2、3、4、6、10、12、14、16 d取雞胸肉與雞腿肉1:1混合樣本進行pH值、水分含量、菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮實驗，一個托盤里完整生鮮雞胸肉和雞腿作為一份生雞肉感官評定樣本，每份雞胸肉和雞腿肉加500 mL純凈水煮12 min待溫度降到45 ℃作為熟雞肉感官評定樣本。根據(jù)貨架期選0、8、16 d即貯藏初期、腐敗期、腐敗后期進行16S rRNA高通量測序，試驗周期16 d。

1.3.2 稻花雞肉冰點的測定

參照謝菲菲[23]的方法稍作修改，將雞胸肉和雞腿肉分別切成2 cm×2 cm×1 cm的肉塊，K型熱電偶探頭插入肉塊的深度約0.5 cm，托盤盛裝放到-5 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中降溫，開啟多路溫度巡檢儀測定并記錄溫度變化，讀數(shù)精準度為0.1 ℃，每1 s記錄一次數(shù)據(jù)，雞胸和雞腿肉分別測定三次取平均值。

1.3.3 pH值的測定

參考GB 5009.237-2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》。

1.3.4 水分含量的測定

參考GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中直接干燥法。

1.3.5 細菌總數(shù)測定

參考GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)》。

1.3.6 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）測定

參考GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的自動凱氏定氮儀法》。

1.3.7 感官評價

參考GB/T 16860-1997《感官分析方法質(zhì)地剖面檢驗》和GB/T 16291.1-2012《感官分析選拔、培訓(xùn)與管理評價員一般導(dǎo)則第1部分：優(yōu)選評價員》中內(nèi)部招募方式，招募30人組建候選評價小組，進行評定選拔和培訓(xùn)出10名優(yōu)選評價員參與本實驗感官評價。參考GB/T 22210-2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》和GB 2707-2016《食品安全國家標準鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》等方法進行感官評價試驗。采用九點評分法進行生雞肉和熟雞肉評分，生雞肉從色澤、氣味、彈性三方面進行評分，各權(quán)重系數(shù)分別為15%、20%、15%，熟雞肉從香味、滋味、咀嚼型三方面進行評分、各權(quán)重系數(shù)分別為15%、20%、15%。分別對雞胸和雞腿肉進行評分，最后將雞胸肉和雞腿肉感官評分之和作為每一份稻花雞樣本最終感官評分，感官評分表見表1和表2。

表1 雞胸肉感官評分Table 1 Sensory score of chicken breast

表2 雞腿肉感官評分Table 2 Sensory score of chicken thigh meat

1.3.8 微生物多樣性分析

（1）總DNA提取和檢測：FastDNA? Spin Kit for Soil DNA提取試劑盒。

（2）PCR擴增：16S rDNA V3-V4區(qū)擴增上游引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG。

下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR反應(yīng)體系為：4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.50 mmol/L dNTPs、0.80 μL Forward Primer（5 μmol/L）、0.40 μL FastPfu Polymerase、0.20 μL BSA、10 ng Template DNA，補ddH2O至20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；循環(huán)27×95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；72 ℃延伸10 min，10 ℃保持。

（3）PCR產(chǎn)物鑒定、純化及定量：樣本3個PCR重復(fù)，將重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物用Quantus? Fluorometer進行檢測定量。

（4）構(gòu)建PE文庫及Illumina測序：使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit進行建庫，利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

（5）數(shù)據(jù)分析：依托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的美吉生信云平臺進行數(shù)據(jù)分析（www.majorbio.com）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

通過Microsoft Office Excel 2010軟件、SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用Prism軟件作圖。微生物多樣性分析依托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的美吉生信云平臺進行數(shù)據(jù)分析（www.majorbio.com）。

2 結(jié)果與討論

2.1 稻花雞肉冰點的測定結(jié)果

如圖1所示，稻花雞胸肉和雞腿肉的降溫曲線均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的變化趨勢，當雞肉的溫度降到冰點時沒有即刻凍結(jié)，而是輕微升溫后再下降，直至終溫。雞肉降溫至過冷點時需要跨越一個能量柵欄，形成晶核，釋放潛熱，導(dǎo)致雞肉溫度回升至冰點，開始形成冰晶體。稻花雞胸肉的冰點溫度為-0.7 ℃，過冷點溫度為-1.5 ℃，稻花雞腿肉冰點溫度為-0.5 ℃，過冷點溫度為-1.1 ℃。雞胸肉與雞腿肉的冰點和過冷點均不相同，這是因為雞胸肉與雞腿肉的水分含量，脂肪，蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分存在差異，因此不同部位其冰點和過冷點也有所差異[23-26]。

圖1 稻花雞肉降溫曲線Fig.1 Temperature drop curve of Daohua chicken

2.2 不同貯藏溫度下稻花雞肉pH值變化

pH值可以直接影響雞肉的顏色、嫩度、蒸煮時間的損失和營養(yǎng)物質(zhì)的保存[27]，pH值過高對肌肉轉(zhuǎn)為可食用肉的過程不利，其值過低則會引起異常肉的形成[28]。因此pH值是判斷雞肉品質(zhì)的重要指標。稻花雞在不同貯藏溫度下pH值變化如圖2所示。

圖2 稻花雞在貯藏過程中pH值的變化Fig.2 pH value changes of Daohua chicken during storage

從圖2可知，三種溫度下，pH值的變化趨勢均是先下降后上升，與劉茵茵等[29]的研究結(jié)果一致。整個貯藏期間，25 ℃常溫保存條件下雞肉的pH值與4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏均有顯著性差異（P＜0.05），4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏條件下雞肉的pH值沒有顯著性差異（P＞0.05）；新鮮稻花雞肉的pH值為5.85，25 ℃常溫保存條件下第0.50天的pH值為5.79，此后呈顯著上升趨勢，在貯藏后期急劇上升；4 ℃冷藏保鮮條件下的雞肉第1天的pH值為5.70，此后開始緩慢上升，第4天的pH值為6.06，且4 d～10 d的pH值大幅上升；而0 ℃冰溫貯藏條件下的雞肉，貯藏前期pH值緩慢下降，在第2天呈現(xiàn)上升明顯趨勢，第8天的pH值為5.93，第8天后的pH值呈大幅上升趨勢?；铍u屠宰后，細胞在酶的催化作用下仍然進行新陳代謝，產(chǎn)生并積累乳酸導(dǎo)致貯藏前期pH值下降，隨著貯藏時間的增加，微生物大量生長發(fā)育繁殖，一方面分解乳酸，另一方面生化反應(yīng)，利用雞肉中的蛋白質(zhì)和含氮物質(zhì)產(chǎn)生氨類等堿性化合物，使pH值呈現(xiàn)上升趨勢[30]。綜上分析可知，低溫可以延緩pH值的變化程度，0 ℃冰溫貯藏條件下的雞肉pH值比4 ℃冷藏保鮮和25 ℃常溫保存的雞肉pH值更穩(wěn)定[27]。

2.3 不同貯藏溫度下稻花雞肉水分含量變化

雞肉在貯藏過程中的穩(wěn)定性與水分含量密切相關(guān)，微生物的生長發(fā)育繁殖及大多數(shù)的生物化學(xué)反應(yīng)都需要水分的參與。稻花雞在不同貯藏溫度下水分含量值變化如圖3所示。

圖3 稻花雞在貯藏期間水分含量的變化Fig.3 Changes of water content in Daohua chicken during storage

由圖3可知，在貯藏期間，稻花雞肉在25 ℃常溫保存、4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏三種條件下雞肉的水分含量均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢。新鮮稻花雞肉水分含量值為74.95%，25 ℃常溫保存條件下第0.50天值為73.68%，此后水分含量就急劇上升；4 ℃冷藏保鮮條件下的雞肉第1天值為73.46%，此后開始緩慢上升，第4～10天的水分含量大幅上升，第4天達到76.09%；而0 ℃冰溫貯藏條件下的雞肉，水分含量變化趨勢較比其他兩種貯藏條件都緩和，第2天值為73.76%，此后呈緩慢上升趨勢，第8天值為75.62%，此后呈現(xiàn)大幅上升趨勢。三種條件下水分含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，并且在貯藏中后期水分含量均處于較高水平。這主要是因為在貯藏前期，肌肉度過僵直期，保水能力逐漸恢復(fù)，同時酶反應(yīng)和微生物繁殖需要消耗一部分水分，因此貯藏前期水分含量呈下降趨勢，與孫路等[31]然研究結(jié)果一致。隨著貯藏時間延長，肌肉組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，結(jié)合水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?，且保水能力差。水分含量值主要測定自由水含量，因此貯藏后期三種條件下的稻花雞肉水分含量值均大幅度上升[27]。

2.4 不同貯藏溫度下稻花雞肉菌落總數(shù)變化

如圖4所示，25 ℃常溫保存的雞肉在前期呈現(xiàn)先急速上升再緩慢上升后趨于平緩的趨勢，第0.50天菌落總數(shù)值為5.00×106CFU/g；4 ℃冷藏保鮮的雞肉菌落總數(shù)在腐敗前期急速上升，腐敗期菌落總數(shù)變化趨于平緩，后期又出現(xiàn)上升趨勢，第4天菌落總數(shù)值為6.60×106CFU/g。0 ℃冰溫貯藏的雞肉菌落總數(shù)先緩慢上升然后趨于平緩，后期又出現(xiàn)了緩慢上升的趨勢，第8天菌落總數(shù)值為8.90×105CFU/g，第10天為9.60×106CFU/g。王玨[28]研究的黃羽肉雞在冷藏條件下第5天的菌落總數(shù)值為2.50×106CFU/g，王新新[32]研究的冰溫貯藏黃羽肉雞第11天菌落總數(shù)值為1.9×106CFU/g，雞品種不一樣，營養(yǎng)物質(zhì)含量有差別，貨架期則不同。分析25 ℃微生物腐敗后期緩慢上升后趨于平緩的趨勢，可能是因為腐敗后期微生物可利用的營養(yǎng)物質(zhì)含量低，且微生物代謝積累的胺類、硫化氫等物質(zhì)抑制了其繁殖，腐敗后期微生物競爭，優(yōu)勢腐敗菌抑制其他微生物生長繁殖。4 ℃貯藏前期菌落總數(shù)出現(xiàn)波動，可能是因為嗜溫微生物不耐低溫，嗜冷微生物大量繁殖，微生物生長優(yōu)勢菌群替換導(dǎo)致的現(xiàn)象。0 ℃冰溫貯藏下，微生物生長緩慢，是因為低溫抑制了微生物的生長發(fā)育和繁殖。GB 16869-2005《鮮、凍禽產(chǎn)品》規(guī)定：菌落總數(shù)≤1.00×106CFU/g為合格標準，因此，25 ℃常溫保存雞肉在第0.50天超過菌落總數(shù)標準規(guī)定，4 ℃冷藏保鮮雞肉在第4天超過，0 ℃冰溫貯藏雞肉在第10天超過菌落總數(shù)標準規(guī)定，第8天未超過，冰溫貯藏能有效的延長雞肉的貨架期。

圖4 不同貯藏溫度下雞肉菌落總數(shù)變化Fig.4 Changes in total number of chicken colonies at different storage temperatures

2.5 不同貯藏溫度下稻花雞肉揮發(fā)性鹽基氮變化

TVB-N值可以用來判斷雞肉的腐敗程度，雞肉在微生物和內(nèi)源酶的作用下，分解利用蛋白質(zhì)等物質(zhì)產(chǎn)生揮發(fā)性氨類和三甲胺等腐敗性物質(zhì)[33]。由圖5可看出，25 ℃常溫保存的雞肉揮發(fā)性鹽基氮值持續(xù)上升，在腐敗后期呈現(xiàn)急速上升趨勢。4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏的雞肉在前期揮發(fā)性鹽基氮值變化平緩，且兩者差值不大，第4天后4 ℃冷藏保鮮的雞肉揮發(fā)性鹽基氮值明顯高于0 ℃冰溫貯藏的雞肉?？赡苁乔捌跍囟鹊停⑸锷L發(fā)育繁殖緩慢，產(chǎn)生的胺類等物質(zhì)含量差別不大，第4天后，冷藏保鮮雞肉進入腐敗期，大量分解蛋白質(zhì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性鹽基氮值增值。根據(jù)GB 2707-2016《食品安全國家標準鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》標準規(guī)定TVB-N≤15 mg/100 g。25 ℃常溫保存的雞肉在第0.50天值為15.26 mg/100 g超過規(guī)定限制，4 ℃冷藏保鮮的雞肉在第4天值為13.64 mg/100 g，第6天值為23.99 mg/100 g超過規(guī)定限制，0 ℃冰溫貯藏的雞肉在第8天值為15.25 mg/100 g剛超過規(guī)定限制。張莉等[22]研究的寧都黃雞常溫保存第1天值為15.49 mg/100 g，王新新[32]研究的冷藏黃羽肉雞第5天值為14.57 mg/100 g，冰溫貯藏第11天值為15.21 mg/100 g，雞品種不一樣，營養(yǎng)物質(zhì)含量有差別，貨架期則不同。

圖5 不同貯藏溫度下?lián)]發(fā)性鹽基氮值變化Fig.5 Changes of volatile base nitrogen values at different storage temperatures

2.6 不同貯藏溫度下稻花雞肉感官評價的變化

感官評價是國家規(guī)定檢驗肉制品新鮮程度的重要指標之一，也是辨別雞肉質(zhì)量最簡便快捷的方式之一，能在一定程度上反應(yīng)雞肉的品質(zhì)。由圖6可知，不同時間和貯藏溫度條件對稻花雞品質(zhì)均有不同程度的影響。在整個貯藏過程中，25 ℃常溫保存、4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏三種條件下雞肉的感官評定分值均呈現(xiàn)下降趨勢。貯藏前期，4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏兩種條件下的稻雞肉感官評價值無顯著差異性（P＞0.05），但均與25 ℃常溫保存雞肉的感官評價值呈現(xiàn)顯著差異性（P＜0.05）；在貯藏末期，雞肉已腐敗變質(zhì)，三種條件下稻花雞肉感官評定值無顯著差異性（P＞0.05）。25 ℃常溫保存的雞肉品質(zhì)劣變得最快，在整個貯藏過程中呈現(xiàn)急劇下降趨勢，第0.50天的感官評分值為12.10，而到第1天評分下降到5.75分，此時的雞胸和雞腿肉均已經(jīng)嚴重腐敗，腥臭味嚴重；4 ℃冷藏保鮮的雞肉，在貯藏前期分值緩慢下降，第4～8天急劇下降到嚴重腐敗無法食用，貯藏第4天分值為8.40分，第6天的分值下降到6.30分，雞肉質(zhì)地松散彈性差；0 ℃冰溫貯藏條件下的雞肉，在第2天、第3天和第4天感官評定分值無顯著性差異，至第8天感官評定分值下降到9.90分，而第10 d直接下降到6.40分。綜上所述，以感官評價結(jié)果表示，25 ℃常溫保存的雞肉第0.50天以后、4 ℃冷藏保鮮的雞肉第4天以后，0 ℃冰溫貯藏的雞肉第8天以后不能食用。

圖6 稻花雞在貯藏期間感官評價的變化Fig.6 Sensory evaluation of Daohua chicken during storage

2.7 不同貯藏溫度下稻花雞肉細菌組成及多樣性的變化

2.7.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

不同樣本序列信息見表3。根據(jù)雞肉貯藏期間菌落總數(shù)、TVB-N測量值和腐敗變質(zhì)情況，選擇不同貯藏條件下的初期、腐敗期、腐敗末期，即雞胸與雞腿1:1混合后的初始期、25 ℃常溫保存第0.50天腐敗期和第2天腐敗末期、4 ℃冷藏保鮮第4 d腐敗期和第8天腐敗末期以及0 ℃冰溫貯藏第8天腐敗期和第16天腐敗末期，進行細菌組成及多樣性分析和比較。經(jīng)數(shù)據(jù)前處理，按照97%相似度和70%分類置信度，在silva138/16s_bacteria物種分類數(shù)據(jù)庫里完成7個樣本的多樣性數(shù)據(jù)分析，共獲得優(yōu)化序列433,739條，平均長度為428 bp，對非重復(fù)物種注釋結(jié)果統(tǒng)計得到22門，36綱，90目，148科，291屬，OUT總數(shù)為579個。門水平前四的物種包括：變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門。屬水平前四的物種包括：不動桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌科未分類屬、泛菌屬。

表3 樣本序列信息統(tǒng)計表Table 3 Statistical table of sample sequence information

2.7.2 稀釋曲線分析

通過稀釋曲線驗證測序數(shù)據(jù)的合理性，樣品稀釋曲線如圖7所示，隨著測序量的增加，7個樣本的稀釋曲線均趨于平坦，表明實驗7個樣本測序量均可以反應(yīng)絕大部分的物種信息。表明樣本取樣數(shù)量合理，測序深度可以覆蓋樣本中所有微生物。

圖7 稀釋曲線圖Fig.7 Dilution curve

2.7.3α多樣性分析

采用運算分類單元（OUT）、豐富度指數(shù)chao I值、shannon多樣性指數(shù)值和物種覆蓋度進行表示。如表4所示，在不同貯藏溫度下的OUT數(shù)，試驗前期的數(shù)值均高于試驗后期數(shù)值。樣本在分裝前已充分混勻，充分的保證各樣本初始狀態(tài)相同，分裝后在不同貯藏條件下，隨著時間的延長，不同貯藏溫度下的優(yōu)勢腐敗微生物不斷生長，樣本中的OUT數(shù)值隨之下降。25 ℃常溫保存腐敗后期比前期減少了近18.64%，比初始狀態(tài)減少了近81.07%；4 ℃冷藏保鮮腐敗后期比前期減少了近50.89%，比初始狀態(tài)減少了近89.15%；0 ℃冰溫貯藏腐敗后期與前期相比變化不是十分顯著，僅減少了近9.30%，但比初始狀態(tài)減少了近92.31%，說明樣本貯藏前期微生物多樣性比后期更豐富。物種覆蓋度越高則該樣本序列未被測出概率越低，在不同貯藏溫度條件下樣本的物種覆蓋度均為1.00，表明雞肉樣本中包含的所有序列均被成功測序，此次測序結(jié)果可以反映樣本中菌群結(jié)構(gòu)的真實情況。

表4 樣本細菌α多樣性分析Table 4 Analysis of bacterial α diversity in samples

Chao I指數(shù)值越高則表明群落物種豐富度越高，shannon多樣性指數(shù)值與群落多樣性呈正相關(guān)，數(shù)值越大其群落多樣性越高，25 ℃常溫保存的雞肉第2天細菌豐富度指數(shù)chao I較第0.50天降低了30.46%，shannon多樣性指數(shù)值降低了42.05%，表明該貯藏溫度下，細菌豐富度和多樣性均隨著貯藏時間的延長而降低；4 ℃冷藏保鮮的雞肉第8天較第4天的豐富度指數(shù)chaoI降低了近54.76%，shannon多樣性指數(shù)值降低了3.32%，表明該貯藏溫度下細菌豐富度隨著貯藏時間的延長出現(xiàn)明顯的降低，而shannon多樣性降低幅度較弱；0 ℃冰溫貯藏的雞肉第16天細菌豐富度指數(shù)chao I較第8天增加了10.85%，shannon多樣性指數(shù)值降低了10.68%，表明該貯藏溫度條件下細菌豐富度隨著貯藏時間的延長稍有上升，而多樣性呈現(xiàn)下降趨勢。

2.7.4 細菌群落組成結(jié)構(gòu)特征

以分類學(xué)門水平、屬水平對不同貯藏條件下細菌組成及多樣性進行具體分析。雞肉樣本細菌群落結(jié)構(gòu)門水平變化如圖8所示。在所有樣本中相對豐富度最大的為變形菌門（Proteobacteria），在不同溫度貯藏條件下其占比均隨著時間延長而增加。在初始樣本中相對豐富度為82.42%；25 ℃常溫保存的第0.5天腐敗初期變形菌門占85.64%，第2天腐敗后期為95.87%；4 ℃冷藏保鮮第4天變形菌門占98.57%，第8天占99.14%；而0 ℃冰溫貯藏的第8天和第16天絕大部分細菌為變形菌門，占比分別為99.76%和99.83%。在初始樣本中相對豐富度占比其次大的是厚壁菌門（Firmicutes）為12.66%，擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）分別占比為2.11%和1.84%。25 ℃常溫保存的第12 h樣本中相對豐富度占比其次大的是擬桿菌門為8.33%，而在25 ℃常溫保存的第48 h其占比僅為0.03%，隨著貯藏時間的延長其相對豐富度占比顯著下降。25 ℃常溫保存的第12 h、第48 h樣本中厚壁菌門占比分別為5.86%和3.69%，隨著貯藏時間的延長其相對豐富度占比呈下降趨勢，25 ℃常溫保存的第12 h、第48 h樣本中放線菌門占比分別為0.088%和0.41%，隨著貯藏時間的延長其相對豐富度占比呈上升趨勢。4 ℃冷藏保鮮第4天樣本中相對豐富度占比其次大的是厚壁菌門為0.92%，第8天占比為0.80%，隨著貯藏時間的延長其相對豐富度占比略微下降，而擬桿菌門和放線菌門在冷藏貯藏保鮮過程中含量較低。0 ℃冰溫貯藏過程中最主要的優(yōu)勢菌群為變形菌門，而厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門等相對豐富度占比極低。

圖8 基于門水平分類的樣品菌群分布圖Fig.8 Flora dis tribution of samples based on phylum level classification

從屬水平上分析，雞肉細菌群落結(jié)構(gòu)變化如圖9所示，在不同貯藏溫度下雞肉細菌群落結(jié)構(gòu)與初始樣本比較，豐富度變化較大的物種有：假單胞菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌科未分類菌屬、沙雷氏菌屬、乳桿菌屬、泛菌屬、馬賽菌屬、歐文氏菌屬、巨型球菌屬、變形菌屬未分類屬等。初始樣本檢測出11種菌屬；25 ℃常溫保存第0.5天和第2天的樣本分別檢測出12種、8種菌屬；4 ℃冷藏保鮮第4天和第8天的樣品分別檢測出9種、8種菌屬；0 ℃冰溫貯藏第8天和第16天的樣本分別檢測出7種、6種菌屬。通過分析得出，隨著貯藏時間延長和貯藏溫度降低，雞肉細菌群落豐富度總體上呈下降趨勢，與溫冬玲等[34]、茹志瑩等[35]的研究結(jié)果一致。宋相宇等[21]采用16S rDNA測序的Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對不同包裝和貯藏溫度下白切雞優(yōu)勢腐敗微生物進行了研究，得出在不同貯藏方式下優(yōu)勢腐敗微生物有顯著差異性。黃柳娟等[36]基于高通量測序技術(shù)對冷鮮雞表面及內(nèi)部進行菌群多樣性分析，結(jié)果表明雞肉不同取樣部位細菌菌群組成存在差異且優(yōu)勢腐敗菌屬存在明顯差異。

初始樣本中以不動桿菌屬細菌為主，相對豐富度約56.29%，其次假單胞菌屬細菌的豐富度約為11%，泛菌屬細菌的豐富度約5.96%，沙雷氏菌屬細菌的豐富度約2.27%，乳酸桿菌屬細菌的豐富度約1.85%，歐文氏菌屬細菌的豐富度約1.48%，巨型球菌屬細菌的豐富度約1.05%，多源菌屬細菌的豐富度約0.74%，腸桿菌科未分類菌屬細菌的豐富度約0.63%，馬賽菌屬細菌的豐富度約0.47%，乳酸球菌屬細菌的豐富度約0.20%，其他未知菌菌屬豐富度約18%。

由圖9可知，25 ℃常溫保存、4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏細菌菌群種類和豐富度大小存在較大的差異性。25 ℃常溫保存雞肉在貯藏期間主要以不動桿菌屬細菌、沙雷氏菌屬細菌、多源菌屬細菌、泛菌屬細菌、腸桿菌科未分類屬細菌、變形桿菌屬細菌、類香味菌屬細菌、巨型球菌屬細菌、乳酸球菌屬及其他未知菌菌屬為主；不動桿菌屬細菌在貯藏過程中占比最大，第0.5天和第2天的樣品中分別占比33.39%、88.02%，與初始狀態(tài)相比，呈現(xiàn)先降低后顯著性增加趨勢；沙雷氏菌屬細菌在貯藏第0.5天和第2天的樣品中分別占比18.57%、2.15%，在腐敗前期呈增加趨勢，腐敗后期顯著降低；多源菌屬細菌在貯藏第0.5天和第2天的樣品中分別占比9.52%、0.39%，隨著貯藏時間的延長呈先增加后降低趨勢；泛菌屬細菌在貯藏第0.5天和第2天的樣品中分別占比5.12%、2.05%，在貯藏過程中呈降低趨勢。常溫保存雞肉過程中，大部分菌屬相對豐富度都呈現(xiàn)出增加后降低的趨勢。雞肉中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，溫度適宜條件下，能提供微生物生長發(fā)育繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，大量增值的同時代謝產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，導(dǎo)致雞肉在短時間內(nèi)加速腐敗變質(zhì)。腐敗后期，微生物能利用的營養(yǎng)物質(zhì)含量低、優(yōu)勢腐敗菌抑制其他菌群生長等原因，導(dǎo)致豐富度下降。因此，在雞肉加工、運輸、貯藏、銷售過程中要全程控溫，保證冷鏈系統(tǒng)完整，即使短時間溫度失控也會對其產(chǎn)生無法挽回的損失。

4 ℃冷藏保鮮雞肉在貯藏期間，假單胞菌屬細菌、不動桿菌屬細菌、沙雷氏菌屬細菌、腸桿菌科未分類屬細菌、馬賽菌屬細菌、變性菌屬未分類屬及其他未知菌菌屬所占比例較大；其中假單胞菌屬細菌占比最大，第4天和第8天樣品分別為37.22%、51.57%，在整個貯藏過程中隨時間延長呈顯著增加趨勢，為4 ℃冷藏保鮮貯藏過程中的最主要優(yōu)勢菌群；不動桿菌屬細菌在貯藏第4天和第8天的樣品中分別占比36.90%、8.95%，隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)明顯降低趨勢；沙雷氏菌屬細菌在第4天和第8天的樣品中分別占比13.23%、17.15%，與與初始狀態(tài)相比，呈顯著增加趨勢；腸桿菌科未分類屬細菌在貯藏第4天和第8天的樣品中分別占比6.82%、13.03%，貯藏過程中隨時間呈明顯增加趨勢。

0 ℃冰溫貯藏雞肉則以假單胞菌屬細菌、不動桿菌屬細菌、馬賽菌屬細菌、沙雷氏菌屬細菌、腸桿菌科未分類屬細菌、變形菌屬未分類屬細菌為主；在整個貯藏過程中假單胞菌屬占比極大，在第8天和第16天樣品中分別為60.98%、90.51%，隨貯藏時間延長而顯著增加，尤其在腐敗后期，絕大部分微生物為假單胞菌屬，是冰溫貯藏過程中最主要的優(yōu)勢菌群；不動桿菌屬細菌不動桿菌屬細菌在貯藏第8天和第16天的樣品中分別占比27.38%、2.32%，呈顯著降低趨勢，其最適生長溫度為35 ℃，因此由圖5所示，不動桿菌屬隨溫度的降低其豐富度呈降低趨勢；馬賽菌屬細菌在貯藏第8天和第16天的樣品中分別占比4.68%、2.98%，與初始狀態(tài)相比，冰溫貯藏過程中呈先上升后下降趨勢；沙雷氏菌屬細菌在貯藏第8天和第16天的樣品中分別占比4.00%、2.48%，同樣呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。

假單胞菌屬細菌在初始樣本中豐富度占比為11%，在25 ℃常溫保存雞肉樣本中呈顯著下降趨勢，第0.5天和第2天的樣品中分別占比4.18%、1.90%；而在4 ℃冷藏保鮮貯藏第4天和第8天的樣品中占比分別為37.22%、51.57%；0 ℃冰溫貯藏第8天和第16天樣品中占比分別為60.98%、90.51%，假單胞菌屬細菌在低溫貯藏條件下，隨著貯藏時間的延長呈顯著上升趨勢，并且溫度越低其增加趨勢越明顯，是雞肉低溫貯藏條件下主要的優(yōu)勢腐敗菌，與大多數(shù)肉制品優(yōu)勢腐敗菌研究結(jié)果一致[37,38]。假單胞菌屬細菌在低溫環(huán)境下具有很強的生長發(fā)育能力，能夠分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨類等腐敗產(chǎn)物，是低溫貯藏肉制品的主要優(yōu)勢腐敗菌[39,40]。所以在25 ℃常溫保存雞肉檢出量很少且呈下降趨勢，而在4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏過程中豐富度占比極高且呈上升趨勢。因此在低溫貯藏條件下延緩雞肉腐敗變質(zhì)，延長其貨架期，可以通過控制假單胞菌屬細菌的生長入手。

腐敗菌是影響肉制品腐敗變質(zhì)的根本因素，雞肉中微生物通過相互競爭、協(xié)同作用等種群關(guān)系對雞肉品質(zhì)及貨架期產(chǎn)生至關(guān)重要的影響[4]。研究稻花雞肉在不同貯藏溫度及貯藏過程中細菌多樣性的變化是研究稻花雞肉腐敗變質(zhì)和保鮮的重要方法和途徑，25 ℃常溫保存優(yōu)勢腐敗菌由不動桿菌屬細菌、沙雷氏菌屬細菌、多源菌屬細菌、泛菌屬細菌、腸桿菌科未分類屬細菌組成，4 ℃冷藏保鮮與0 ℃冰溫貯藏優(yōu)勢腐敗菌均是假單胞菌屬細菌、不動桿菌屬細菌、沙雷氏菌屬細菌、腸桿菌科未分類屬細菌、馬賽菌屬細菌為主。稻花雞肉貯藏過程中細菌多樣性的研究能夠為通過優(yōu)勢腐敗菌構(gòu)建貨架期預(yù)測模型以及針對優(yōu)勢腐敗菌篩選保鮮劑等方法提供相應(yīng)的理論參考，進而促進稻花雞肉在加工、運輸、貯藏、銷售過程中保持良好品質(zhì)及延長稻花雞肉的貨架期等。

3 結(jié)論

研究了在25 ℃常溫保存、4 ℃冷藏保鮮、0 ℃冰溫貯藏條件下稻花雞肉pH值、水分含量、菌落總數(shù)、TVB-N及感官評價，綜合品質(zhì)指標，貨架期分別為12 h、4 d、8 d。貯藏初期、腐敗期、腐敗后期基于16S rDNA高通量測序技術(shù)分析結(jié)果表明：不同貯藏溫度條件下，微生物群落豐富度與演替規(guī)律存在較大差異性。共鑒定到22門，36綱，90目，148科，291屬，OUT總數(shù)為579個。在門水平上，各樣本均以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門為優(yōu)勢菌門。在屬水平上，假單胞菌為4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏雞肉的共同優(yōu)勢腐敗菌，隨著貯藏時間增加顯著上升，而在25 ℃常溫保存下顯著下降。25 ℃常溫保存優(yōu)勢腐敗菌由不動桿菌屬細菌、沙雷氏菌屬細菌、多源菌屬細菌、泛菌屬細菌、腸桿菌科未分類屬細菌組成。4 ℃冷藏保鮮與0 ℃冰溫貯藏優(yōu)勢腐敗菌均是假單胞菌屬細菌、不動桿菌屬細菌、沙雷氏菌屬細菌、腸桿菌科未分類屬細菌、馬賽菌屬細菌為主，但豐富度占比存在較大差異。有關(guān)細菌的進一步分類和作用還需進一步研究。