酵素源乳酸菌的益生功能及抑菌特性評價

肖仔君，鐘瑞敏，陸偉東，康宇婷，林麗芳

（1.韶關學院英東食品學院，廣東韶關 512005）（2.韶關學院化學與土木工程學院，廣東韶關 512005）（3.韶關市紫背桃源生態(tài)科技有限公司，廣東韶關 512000）

蔬菜水果酵素是以蔬菜、水果或藥食同源草本類食材等為原料，經微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產品。植物酵素產品由于其富含由多酚、酶、多糖多種維生素、氨基酸以及礦物質和微生物次生代謝產物等營養(yǎng)成分[1-6]，因此具有抗氧化、抗菌消炎、調節(jié)腸道菌群、增強機體免疫能力等多種功能[7-10]。隨著人們對健康意識的增強，酵素類產品因其具有較高的食用、藥用及營養(yǎng)價值而備受青睞。韶關地處粵北山區(qū)，屬于亞熱帶季風氣候，水果資源豐富，不同的季節(jié)都有特色水果，但由于水果采后儲藏期短且易腐爛變質，因此對其進行深加工提高水果的附加值顯得極其重要。因此以時令水果為原料開發(fā)新型酵素產品，不僅可以最大限度保留水果固有營養(yǎng)物質，還可增加新的活性成分，是集營養(yǎng)、保健、食療等功能于一身的產品，具有廣泛的市場前景。

研究表明，植物酵素發(fā)酵過程中主要是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌在起作用，基質中的各種微生物首先將多糖分解，然后在酵母菌作用下轉化為乙醇，醋酸菌將乙醇轉化為乙酸，基質中的糖濃度逐漸降低，并伴有蛋白酶、SOD酶等酶類的釋放，因此酵母菌和醋酸菌在發(fā)酵過程中具有互利共生關系[11,12]。而乳酸菌在形成厭氧的條件下再進行發(fā)酵產生豐富的有機酸，改善酵素風味，為酵素提供更多功效起著重要的作用。

本研究從紫背桃源的酵素對乳酸菌進行分離純化，得到12株乳酸菌，以這12株菌作為試驗菌株，測定其自聚集性、耐酸性，以及對膽鹽、胃蛋白酶、胰蛋白酶與抗生素的耐受性進行測定，從而驗證出菌株的益生性，為其進一步分離得到后酵素的商業(yè)應用提供理論依據，對擴大乳酸菌應用范圍具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳酸菌：從紫背桃源酵素中分離，保存在實驗室中。

指示菌：大腸桿菌（Escherichia coliGDMCC 1.115），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusGDMCC 1.2442），購于廣東省微生物保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱生物有限公司。

1.1.3 試劑

抗菌藥物藥敏紙片、牛膽鹽等購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設備

SM800酶標儀，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，上海一恒科學儀器有限公司；MJX-250B-Z電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司；LC-LX-H185C臺式高速離心機，上海力辰邦西儀器科技有限公司；MIKRO220R 752紫外可見分光光度計，上海光學儀器一廠；S1000 Thermal Cycler PCR儀，北京六一生物科技有限公司；DYY-6D電泳儀，北京六一生物科技有限公司；牛津杯；pH計等。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的活化

將保存在冰箱中從紫背桃源酵素在MRS固體培養(yǎng)基進行劃線分離，37 ℃厭氧培養(yǎng)1～2 d。反復活化三次，直至性狀穩(wěn)定，放置4 ℃冰箱備用。

1.2.2 乳酸菌自聚集性的測定

根據參照文獻[8]的方法微調整，將活化后的乳酸菌接種于滅菌MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h后取5 mL于離心管中，以6 000 r/min離心10 min收集菌體，加入5 mL滅菌后的PBS緩沖液，再以6 000 r/min離心2 min，重復2次洗滌乳酸菌，加入5 mL滅菌后的PBS緩沖液搖勻后于600 nm處測光密度值OD0值。以滅菌后的PBS緩沖液作為對照。

取4 mL菌懸液振蕩10 s后靜置。每隔1 h取0.1 mL上清液于3.9 mL滅菌后的PBS緩沖液中，振蕩10 s后于600 nm處測吸光值OD值。依據下列公式進行計算每小時各自菌株的自聚集性結果，取平均值進行比較。

式中：

R——自聚集性，%；

OD0——乳酸菌樣品實驗測得的光密度值；

OD——菌懸液樣品實驗測得的光密度值。

1.2.3 乳酸菌酸耐受性研究

將活化后的乳酸菌接種于pH值2.5的MRS培養(yǎng)基中，放入37 ℃培養(yǎng)箱下孵育6 h，分別取孵育0、3、6 h孵育液稀釋至合適梯度，進行活菌計數，計算其存活率。

1.2.4 乳酸菌的耐膽鹽的研究

將活化后的乳酸菌接種于含有濃度為3 g/L牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育6 h。分別取孵育0、3、6 h的孵育液進行活菌計數。

1.2.5 乳酸菌的胃蛋白酶耐受性的研究

將活化后的乳酸菌接種于滅菌MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h。以10 mL滅菌后的pH值2.5的生理鹽水為基礎加入胃蛋白酶得到5 mg/mL的模擬胃液，加入活化后的乳酸菌菌液0.5 mL，搖勻37 ℃孵育6 h。取0、3、6 h孵育液測其活菌數，并計算其存活率。

1.2.6 乳酸菌的胰蛋白酶耐受性的研究

將活化后的乳酸菌接種于滅菌MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h。以10 mL滅菌后的生理鹽水為基礎加入胰蛋白酶得到10 mg/mL，調至pH值8.0的模擬腸液，加入活化后的乳酸菌菌液0.5 mL，搖勻37 ℃孵育6 h。3 h、6 h后取樣后進行活菌計數，并計算其存活率。

1.2.7 乳酸菌的耐抗生素的研究

將活化后的乳酸菌接種于滅菌MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h。將0.1 mL待試乳酸菌菌株（1×108CFU/mL）均勻涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后將待試菌株徐布在MRS瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，將浸染抗生素的藥敏紙片貼于平板上，于37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并測量抑菌圈直徑（mm）大小。采用一菌一藥一判斷值的原則，根據說明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株的藥敏性[8,13]。

1.2.8 乳酸菌對指示菌抑菌活性的測定

將已活化的Escherichia coliGDMCC 1.115和Staphylococcus aureusGDMCC 1.2442菌懸液加入到已滅菌并冷卻至40～50 ℃的平板計數培養(yǎng)基中（使指示菌的濃度保持106CFU/mL），搖勻后迅速倒平板。待平板凝固后，在平板上均勻放置3個牛津杯，并在牛津杯中分別加入各株試驗菌發(fā)酵液，加到牛津杯剛滿為宜。37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑大小。

1.3 數據分析

所有實驗重復3次，數據分析采用Graphpad進行統(tǒng)計和顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌自聚集性的測定

益生菌是否黏附到上皮細胞，與細胞表面的自聚集能力有關，自聚集能力確保益生菌在腸道中達到高細胞。酵素中的乳酸菌在通過人體消化道時，不僅要接受胃液的消化，還有胰液和膽汁的沖擊，具有良好自聚集性的乳酸菌則不易被沖散，且容易聚攏，最終到達小腸時能有大部分乳酸菌存活并易黏附在腸道上進行增殖。

自聚集性標準[10]如下：自聚集性＞85%為高度聚集，自聚集性介于70%～80%為中度聚集，自聚集性＜70%為低聚集。如圖1所示，試驗中所有菌株的自聚集性均高于85%，均為高自聚集菌株。其中，xzj007菌的自聚集性最強，為93.22%；XZJ010菌的自聚集性最弱，為90.26%，這說明已篩選出來的菌株均具有較高的聚集性，有順利通過上段消化道的可能性。這與李佳宇[8]的研究的乳酸菌自聚集性稍有不同，其試驗菌株AS9、AS8、LX5的具有較好的自聚集性，分別為：88.55%、87.43%、85.55%。這說明受試乳桿菌具有潛在的對黏液和上皮細胞的黏附能力，這與文獻對乳酸菌的聚集性研究結果相似[14,15]。

圖1 乳酸菌自聚集性分析Fig.1 The self aggregation of the lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌耐酸性的研究

益生菌耐受胃環(huán)境中的低pH值和胃蛋白酶是其進入腸道發(fā)揮功能的關鍵步驟，胃表面的細胞主要分泌三種重要物質：粘液、鹽酸和胃蛋白酶。因此，乳酸菌的耐酸性，是鑒定乳酸菌益生性的重要指標之一。受試的菌株在pH值2.5的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，結果如圖2所示，隨著酸處理時間的延長，試驗菌株對酸的耐受性均降低。菌株XZJ15在酸處理2 h與酸處理1 h相比，其OD600值下降速度較緩，仍保持較高的活率，隨著處理時間的延長，OD600值仍接近1.0；而菌株XZJ07隨著酸處理時間的延長，其OD600值下降明顯，處理4 h后，其OD600值低于0.5，說明其對酸的耐受性較其他受試菌株差；所有的受試菌株經過酸處理后，仍存在一定的活性，但酸耐受性不同，說明這些菌株對酸的耐受較好，這源于這些菌株從酵素產品中分離出來的，它們對酸的耐受能力較強。這與現有從泡菜以及奶疙瘩分離出來的乳酸菌耐酸性研究基本一致[10]，這些都與受試的菌株從酸性產品中分離出相關。不同的益生菌對腸胃環(huán)境耐受能力不同，其中普遍乳酸桿菌屬具有廣泛的耐受性[16]，這一觀點支持了本研究結果。

圖2 乳酸菌耐酸性分析Fig.2 Acid resistance analysis of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌耐膽鹽的研究

乳酸菌能在人體中定植，其對膽鹽的耐受性直接有較大的影響。乳酸菌對膽鹽的耐受性，是鑒定乳酸菌益生性的重要指標之一。由圖3可知，在膽鹽濃度為0.3%的模擬人體膽汁環(huán)境中，酵素中篩選出了12株耐受性良好菌株的存活率呈下降趨勢，但在測試過程中所有乳酸菌菌株均可存活。發(fā)現菌株XZJ05、XZJ06、XZJ09、XZJ10、XZJ12、XZJ14、XZJ18 7株菌對膽鹽耐受性較強，在0.3%膽鹽培養(yǎng)3 h后，活菌數仍達到106CFU/mL，尤其是在的菌株XZJ6、XZJ18在高濃度膽鹽環(huán)境中培養(yǎng)6 h后，活菌數達到106CFU/mL，明顯高于菌株XZJ007對膽鹽的耐受性，表現出在含0.3%膽鹽培養(yǎng)環(huán)境中具有良好的生長特性，說明這6株菌具有較好的膽鹽耐受性，能夠在較高的膽鹽濃度下存活下來。而菌株XZJ15在含0.3%膽鹽環(huán)境中，在處理3 h后，其活菌數仍達到106CFU/mL，但隨著處理時間延長，其對膽鹽的耐受性急劇下降，處理5 h后，其活菌數又下降了2個數量級，說明菌株XZJ15在含0.3%膽鹽環(huán)境中處理時間超過5 h后其耐受性較差，這可能是由于高濃度膽鹽容易改變細胞膜通透性并離解膜內蛋白質，從而使得細胞內的物質流出，導致細胞死亡。

圖3 乳酸菌耐膽鹽分析Fig.3 Analysis of bile salt tolerance of lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌的胃蛋白酶耐受性測定

乳酸菌對人體的益生性除了要耐受膽鹽，還需耐受胃蛋白酶，才能順利通過胃到達小腸，因此，乳酸菌對胃蛋白酶的耐受性，是鑒定乳酸菌益生性的重要指標之一。人工胃液pH值通常在3.0左右，因此選擇在pH值2.5且胃蛋白酶質量濃度為5 mg/mL的模擬胃液中進行乳酸菌的耐受性實驗。由圖4可知，乳酸菌存活率呈下降趨勢，但在測試過程中所有乳酸菌菌株均可存活。其中，在人工模擬的胃液孵育4 h后，12株菌株均可生長，但耐受性不同，菌株XZJ07存活率為19%，說明其耐受人工胃液的能力較差；其余11株存活率存活率均大于40%，說明乳酸菌抗人工胃液的能力因菌株的不同而有顯著的差異。菌株XZJ15、XZJ18存活率最高，人工胃液處理4 h后，其存活率高達50%以上?？紤]食物在胃液中停留時間大致為1～2 h，孵育2 h后的12株乳酸菌其存活率均大于75%，由此看見，受試的12株菌對人工胃液有一定的耐受力。

圖4 乳酸菌對胃蛋白酶耐受性分析Fig.4 Analysis of pepsin tolerance of lactic acid bacteria

2.5 乳酸菌的胰蛋白酶耐受性測定

胰液中會分泌胰蛋白酶進入腸液，腸液呈微堿性，對乳酸菌有脅迫作用。所以除了胃酸和膽鹽外，乳酸菌對胰蛋白酶的耐受性，也是鑒定乳酸菌益生性的重要指標之一。如圖5所示，在胰蛋白酶質量濃度為10 mg/mL的模擬腸液中，受試12株菌株在人工腸液中均可生長，且呈現不同的差異性。在孵育3 h后，12株受試菌株仍保留80%的存活率，隨著孵育處理時間延長，乳酸菌存活率呈下降趨勢，仍保持有50%的存活率（XZJ07耐受胰蛋白酶能力差，處理6 h后，其存活率只有20%），但在測試過程中所有乳酸菌菌株均可存活。這與張悅等[17]研究乳酸菌在人工腸液中報道的基本一致。

圖5 乳酸菌對胰蛋白酶耐受性分析Fig.5 Analysis of trypsin tolerance of lactic acid bacteria

2.6 乳酸菌的耐抗生素測定

藥敏試驗是目前國際上作為益生菌耐藥性評價方法，也是判定是鑒定乳酸菌益生性的重要指標之一[18]。許多研究表明，乳酸菌對各種抗生素的敏感性因物種而異，且不同物種之間的敏感性相差可達數倍。根據抗菌藥物敏感試驗標準，本研究對受試菌株的抗生素敏感性進行了分析，由表1可知，受試12株菌株對土霉素、紅霉素、四環(huán)素具有較高的耐藥性，其抑菌圈的直徑為0 mm，對氨芐西林的耐藥性敏感，這可能是由于在這些酵素各組分在種植過程中，乳酸菌被抗生素治療的人和動物所攜帶的抗藥性菌株所污染所致。

表1 12株乳酸菌菌株對不同抗生素的抑菌圈直徑（mm）和敏感度Table 1 The sensitivity and diameter of inhibition zone of 12 strains LAB to different antibiotics

2.7 乳酸菌對指示菌抑菌活性的測定

乳酸菌發(fā)酵過程中能產生有機酸、抗菌肽等物質，對腸道有害菌有拮抗作用，抑制它們的增殖。因此，研究受試菌株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌指示菌的抑制作用。圖6結果表明受試12株菌株均對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制效果，除了XZJ07對大腸桿菌的抑菌效果稍弱一點外，其他菌株抑菌直徑大于15.00 mm，而受試12株菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到20.00 mm，這與文獻報道的研究結果一致[8]。

圖6 乳酸菌對指示菌的抑制作用Fig.6 The inhibitory effect of lactic acid bacteria on indicator bacteria

3 結論

將從紫背桃源酵素中分離的12株乳酸菌對其自聚集性、酸耐受性試驗以及在模擬的人工胃液人工腸液對胃蛋白酶、胰蛋白酶的耐受性試驗中，所選用的12株乳酸菌均為高聚集的菌株。在乳酸菌的耐酸性測定中，除了XZJ07對酸的耐受性較差，其他11株均具有較強的耐受性。除了XZJ07以外，其他11株菌株在pH值為2.5的模擬胃液中培養(yǎng)2 h存活率仍達75%以上；在0.3%膽鹽中培養(yǎng)3 h后，受試菌株的活菌數仍可達106CFU/mL；受試菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有一定的抑制作用，除了XZJ07對大腸桿菌抑菌圈直徑12 mm外，其他11株菌株的抑菌圈直徑均超過15.00 mm，且受試菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，其抑菌圈直徑約20.00 mm；受試菌株對氨芐青霉素敏感，對四環(huán)素、紅霉素、土霉素較為耐受。綜上所述，分離得到的乳酸菌在體外試驗中表現出潛在益生性為其在益生性發(fā)酵劑及其在相關領域的應用提供了理論依據。