缺氧環(huán)境下外源性雌激素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制

高英華，孫雯雯，靳凱宇，翟曉茜，謝浩，張毅芳，安霞，張亞，田偉，劉蕾，柳雅玲

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，山東泰安271000；2 福建省立醫(yī)院南院病理科；3 山東醫(yī)藥技術(shù)學(xué)院生物工程系；4 山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科；5 山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；6 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦科；7 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率逐年升高并且發(fā)病人群呈年輕化趨勢。子宮內(nèi)膜癌通?？煞譃榇萍に匾蕾囆秃头谴萍に匾蕾囆蛢煞N。其中，雌激素依賴型約占所有子宮內(nèi)膜癌的85%［1］。雌激素與腫瘤細(xì)胞表面的雌激素受體（ER）結(jié)合可激活多種信號通路，在子宮內(nèi)膜癌形成及浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［2］。缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個顯著特征，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)侵襲和遷移能力［3］。缺氧微環(huán)境能夠上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）表達(dá)，而HIF-1α是HIF-1的活性亞基，其調(diào)控的靶基因可參與腫瘤細(xì)胞的浸潤、侵襲和遷移等生物學(xué)過程［4-6］。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是觸發(fā)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵事件［7］。而缺氧和雌激素均能通過多種信號通路激活EMT，如轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、Wnt/β-catenin信號通路。2019年9月—2022年3月，本研究探討了缺氧環(huán)境下外源性雌激素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞EMT的影響及其機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1.料與方法

1.1.料 ER陽性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa，購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。β-雌二醇，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。HIF-1α過表達(dá)載體（HA-HIF-1α-pcDNA3），購自北京中源合聚生物科技有限公司。所有引物由上海桑尼生物科技有限公司設(shè)計合成。siRNA-HIF-1α（5'-CAAAGUUCACCUGAGCCUAdTdT-3'）、siRNA-NC（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'），由上海希格瑪生物科技有限公司設(shè)計合成。Roche LightCycler?96 Real-time PCR系統(tǒng)，購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；Spectra Max Plus 384全波長酶標(biāo)儀，購自美國Molecular Devices公司；ChemiDoc XRS + 凝膠成像系統(tǒng)，購自美國Bio-Rad公司。超純RNA提取試劑盒、HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit、UltraSYBR Mixture，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000，購自上海希格瑪生物科技有限公司。HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、β-catenin、GAPDH一抗及山羊抗兔IgG H&L二抗，購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.2.胞培養(yǎng) 取凍存的Ishikawa細(xì)胞，置于37 ℃恒溫水浴鍋中迅速解凍復(fù)蘇，然后接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2～3天更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長融合90%以上時，胰蛋白酶消化，按1∶3傳代。取傳3代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.胞分組與干預(yù) 取Ishikawa細(xì)胞接種于6孔板，每孔2.5 × 105個，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取部分Ishikawa細(xì)胞，于0.5% O2、5% CO2、94.5% N2環(huán)境中缺氧預(yù)處理2 h，隨機(jī)分為siRNA-HIF-1α組與siRNA-NC組、HIF-1α過表達(dá)組與Control組，按Lipofectamine 2000說明，siRNA-HIF-1α組、siRNA-NC組、HIF-1α過表達(dá)組分別轉(zhuǎn)染siRNA-HIF-1α、siRNA-NC、HA-HIF-1α-pcDNA3，Control組不予轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h收集細(xì)胞。另取部分Ishikawa細(xì)胞，于0.5% O2、5% CO2、94.5% N2環(huán)境中缺氧預(yù)處理2 h后加入0.01 μmol/L β-雌二醇，隨機(jī)分為Estrogen組、Estrogen + siRNA-NC組、Estrogen + siRNA-HIF-1α組以及Estrogen組、Control組、Estrogen + HIF-1α過表達(dá)組，按Lipofectamine 2000說明，Estrogen + siRNA-NC組、Estrogen + siRNA-HIF-1α組、Estrogen + HIF-1α過表達(dá)組分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA-HIF-1α、HA-HIF-1α-pcDNA3，Estrogen組不予轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h收集細(xì)胞。

1.4.IF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA表達(dá)檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集上述各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA純度和濃度合格。按HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。采用Roche LightCycler?96 Real-time PCR系統(tǒng)，以cDNA為模板，按UltraSYBR Mixture說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：HIF-1α上游引物5'-AGTGTACCCTAACTAGCCG-3'、下游引物5'-CGAACCACGACTAAACAC-3'，E-cadherin上游引物5'-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3'、下游引物5'-TCCCAGGCGTAGAGGCTT-3'，N-cadherin上游引物5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'、下游引物5'-ATGCACATTCCTTCGATAAGACTG-3'，β-catenin上游引物5'-AGCTTCCAGACACGCTTCAT-3'、下游引物5'-CGGTACAACGCTGTTTCTA-3'，TGF-β1上游引物5'-GTGGAGGATGAGGATGAGGA-3'、下游引物5'-CTCGGCATTTCTCTCTCTGC-3'，GAPDH上游引物5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'、下游引物5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3'。PCR反應(yīng)體系共50 μL：2 × UltraSYBR Mixture（Low ROX） 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 21 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃30 s共40個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.5.IF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。收集上述各組細(xì)胞，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。將蛋白樣品與SDS及巰基乙醇混合后加熱，使蛋白充分變性。取變性蛋白20 μg，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別滴加HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h。ECL發(fā)光，避光保存并轉(zhuǎn)移至凝膠成像分析系統(tǒng)，在化學(xué)光敏模式下曝光、顯影。采用ChemiDoc XRS + 凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6.計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Student'st檢驗；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.果

2.1.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HIF-1α基因沉默或過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表達(dá)變化 見表1～4。

表1.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量變化（±s）

表1.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量變化（±s）

注：與siRNA-NC組比較，*P＜0.05。

組別siRNA-HIF-1α組siRNA-NC組HIF-1α 0.48 ± 0.02*8.50 ± 0.19 E-cadherin 4.56 ± 0.15*0.24 ± 0.02 N-cadherin 0.65 ± 0.03*9.27 ± 0.42 β-catenin 0.24 ± 0.01*2.39 ± 0.10 TGF-β1 0.28 ± 0.01*10.18 ± 0.32

表2.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達(dá)量變化（±s）

表2.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達(dá)量變化（±s）

注：與siRNA-NC組比較，*P＜0.05。

組別siRNA-HIF-1α組siRNA-NC組TGF-β1 0.25 ± 0.02*0.72 ± 0.01 HIF-1α 0.41 ± 0.01*0.91 ± 0.01 E-cadherin 0.52 ± 0.01*0.41 ± 0.01 N-cadherin 0.49 ± 0.04*1.58 ± 0.02 β-catenin 0.23 ± 0.01*0.39 ± 0.01

表3.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HIF-1α過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量變化（±s）

表3.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HIF-1α過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量變化（±s）

注：與Control組比較，*P＜0.05。

組別HIF-1αE-cadherin N-cadherin β-catenin TGF-β1 HIF-1α過表達(dá)組Control組12.22 ± 0.29*1.00 ± 0.01 0.40 ± 0.01*1.00 ± 0.02 14.73 ± 0.36*1.00 ± 0.01 6.52 ± 0.27*1.00 ± 0.03 6.64 ± 0.18*1.00 ± 0.02

表4.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HIF-1α過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1蛋白相對表達(dá)量變化（±s）

表4.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HIF-1α過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1蛋白相對表達(dá)量變化（±s）

注：與Control組比較，*P＜0.05。

組別HIF-1α過表達(dá)組Control組1.38 ± 0.03*0.86 ± 0.03 0.31 ± 0.01*0.36 ± 0.01 2.31 ± 0.03*1.81 ± 0.04 0.51 ± 0.01*0.41 ± 0.02 1.35 ± 0.03*0.82 ± 0.04 HIF-1αE-cadherinN-cadherinβ-cateninTGF-β1

2.2.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默或過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表達(dá)變化 見表5～8。

表5.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量變化（±s）

表5.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量變化（±s）

注：與Estrogen組比較，*P＜0.05；與Estrogen + siRNA-NC組比較，#P＜0.05。

組別Estrogen組Estrogen + siRNA-NC組Estrogen + siRNA-HIF-1α組HIF-1α 11.37 ± 0.45 24.32 ± 0.56*0.37 ± 0.02*#E-cadherin 0.52 ± 0.03 0.37 ± 0.02*8.28 ± 0.20*#N-cadherin 7.45 ± 0.38 10.74 ± 0.42*0.55 ± 0.04*#β-catenin 7.90 ± 0.15 8.18 ± 0.38*0.17 ± 0.01*#TGF-β1 13.85 ± 0.45 11.21 ± 0.58*0.28 ± 0.02*#

表6.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達(dá)量變化（±s）

表6.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達(dá)量變化（±s）

注：與Estrogen組比較，*P＜0.05；與Estrogen + siRNA-NC組比較，#P＜0.05。

組別Estrogen組Estrogen + siRNA-NC組Estrogen + siRNA-HIF-1α組HIF-1α 1.13 ± 0.06 1.19 ± 0.04*0.87 ± 0.04*#E-cadherin 0.27 ± 0.01 0.53 ± 0.02*0.63 ± 0.01*#N-cadherin 1.26 ± 0.06 1.47 ± 0.03*1.06 ± 0.05*#β-catenin 0.39 ± 0.01 0.48 ± 0.01*0.33 ± 0.01*#TGF-β1 0.98 ± 0.03 0.82 ± 0.03*0.43 ± 0.02*#

表7.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入雌激素同時HIF-1α過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量變化（±s）

表7.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入雌激素同時HIF-1α過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量變化（±s）

注：與Estrogen組比較，*P＜0.05；與Control組比較，#P＜0.05。

組別Estrogen組Control組Estrogen + HIF-1α過表達(dá)組HIF-1α 11.37 ± 0.45 1.00 ± 0.02*28.61 ± 0.71*#E-cadherin 0.52 ± 0.03 1.00 ± 0.01*0.12 ± 0.01*#N-cadherin 7.45 ± 0.38 1.00 ± 0.03*14.83 ± 0.38*#β-catenin 7.90 ± 0.15 1.00 ± 0.01*15.36 ± 0.41*#TGF-β1 13.85 ± 0.45 1.00 ± 0.01*18.43 ± 0.36*#

表8.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入雌激素同時HIF-1α過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達(dá)量變化（±s）

表8.氧環(huán)境下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞加入雌激素同時HIF-1α過表達(dá)后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達(dá)量變化（±s）

注：與Estrogen組比較，*P＜0.05；與Control組比較，#P＜0.05。

組別Estrogen組Control組Estrogen + HIF-1α過表達(dá)組HIF-1α 1.13 ± 0.06 0.81 ± 0.03*1.38 ± 0.03*#E-cadherin 0.27 ± 0.01 0.45 ± 0.02*0.21 ± 0.01*#N-cadherin 1.26 ± 0.06 1.12 ± 0.02*1.85 ± 0.03*#β-catenin 0.39 ± 0.01 0.24 ± 0.01*0.51 ± 0.01*#TGF-β1 0.98 ± 0.03 0.71 ± 0.01*1.14 ± 0.08*#

3.論

子宮內(nèi)膜癌是起源于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，好發(fā)于圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女，近年來其發(fā)病率逐年升高并且發(fā)病人群呈年輕化趨勢。但目前子宮內(nèi)膜癌的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。

缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個顯著特征，在不同類型惡性腫瘤中均能檢測到HIF-1α表達(dá)顯著升高。在缺氧環(huán)境下，HIF-1α過表達(dá)能夠引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移［8-9］。在雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌中，雌激素與其受體結(jié)合，從而發(fā)揮一系列生物學(xué)作用，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡以及促進(jìn)腫瘤血管生成等。有研究報道，雌激素誘導(dǎo)的EMT可能在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用［10］。但缺氧環(huán)境下雌激素在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞EMT中的作用尚不明確。本研究結(jié)果顯示，siRNA-HIF-1α組HIF-1α mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于siRNA-NC組；HIF-1α過表達(dá)組HIF-1α mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于Control組。結(jié)果表明，HIF-1α能夠參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。而HIF-1α過表達(dá)可激活惡性腫瘤的許多重要特征，如腫瘤血管生成以及腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

EMT是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是觸發(fā)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵事件［7］。E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失、N-cadherin表達(dá)上調(diào)是EMT的典型特征。EMT可導(dǎo)致上皮性腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)［11-12］。缺氧和雌激素均能通過多種信號通路激活EMT，如TGF-β1、Wnt/β-catenin信號通路。因此，TGF-β1、β-catenin等信號通路中的關(guān)鍵因子異常表達(dá)亦可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［13］。本研究結(jié)果顯示，siRNA-HIF-1α組N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于siRNA-NC組，E-cadherin mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于siRNA-NC組；HIF-1α過表達(dá)組N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于Control組，E-cadherin mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于Control組。結(jié)果提示，在缺氧環(huán)境下HIF-1α能夠負(fù)向調(diào)節(jié)E-cadherin表達(dá)，正向調(diào)節(jié)N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表達(dá)。

本研究結(jié)果還顯示，Estrogen + siRNA-HIF-1α組HIF-1αmRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于Estrogen +siRNA-NC組和Estrogen組；Estrogen + HIF-1α過表達(dá)組HIF-1α mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于Estrogen +siRNA-NC組和Estrogen組，表明雌激素能夠參與缺氧過程并上調(diào)HIF-1α表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Estrogen + siRNA-HIF-1α組N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于Estrogen +siRNA-NC組和Estrogen組，E-cadherin mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于Estrogen + siRNA-NC組和Estrogen組；Estrogen + HIF-1α過表達(dá)組N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于Estrogen組和Control組，E-cadherin mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于Estrogen組和Control組。結(jié)果提示，在缺氧環(huán)境下雌激素下調(diào)E-cadherin表達(dá)以及上調(diào)N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表達(dá)可能是通過HIF-1α來實現(xiàn)的。

綜上所述，缺氧環(huán)境下雌激素可能通過激活HIF-1α來促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞EMT。但在缺氧環(huán)境下雌激素參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞EMT的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。