YAP、p-STAT3、LMP2A在鼻咽癌中的表達及臨床意義

王赟 王芹 徐亮

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）在我國是最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生于鼻咽部黏膜上皮，臨床癥狀多于中晚期較為明顯，如涕中帶血、聽力下降、頸部淋巴結(jié)腫大等，而誘發(fā)NPC 患者死亡的原因則多由于遠處轉(zhuǎn)移或再次復(fù)發(fā)［1］。臨床上多使用放射的手段治療NPC，于早期NPC 患者而言，單純使用放射治療是可治愈的，但于中晚期患者來說，治療后仍需面臨著腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的風(fēng)險［2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Yes 相關(guān)蛋白（Yes Associated Protein，YAP）是一種原癌基因，在多種腫瘤中呈異常表達［3］。磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（phosphorylated signal tranducers and activators of transcription，p-STAT3）高表達于多種惡性腫瘤中，其可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。外源性表達潛伏膜蛋白2A（Latent membrane protein 2A，LMP2A）可促進NPC 腫瘤干細(xì)胞的自我增殖，且其在控制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡、分化等方面發(fā)揮著重要的作用，是EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）潛伏感染和維持上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原因，而EBV 和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化均在NPC 的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［5］。對此，本次研究旨在探討YAP、p-STAT3、LMP2A 在鼻咽癌中的表達及臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床治療提供新思路，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020 年12 月至2021 年12 月于臨沂市人民醫(yī)院接受治療的202 例NPC 患者的活檢術(shù)石蠟標(biāo)本作為觀察組，同時收集本院98 例鼻咽黏膜慢性炎組織標(biāo)本作為對照組。觀察組男性165 例，女性37 例；平均年齡（51.47±4.28）歲，TNM 分期：Ⅰ期68 例，Ⅱ期52 例，Ⅲ期45 例，Ⅳ期37 例；對照組男性77 例，女性21 例；平均年齡（50.87±4.31）歲。兩組患者的一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過，受試者或家屬已簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整者；②觀察組符合《西班牙醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)會鼻咽癌臨床指南（2017）介紹》中NPC 相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)者［6］；③無其他惡性腫瘤者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他感染性疾病者；②合并血液系統(tǒng)疾病者；③合并服用精神類藥物病者。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

石蠟包埋，切成薄片（厚度為5 μm）放于載玻片上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，12 h），結(jié)束后使用二甲苯進行脫蠟（2 次，10 min/次）。使用PBS 液進行漂洗（3 次，3 min/次），使用蘇木素染色2 min，使用顯微鏡對YAP、p-STAT3、LMP2A 三種蛋白的表達情況進行觀察和計數(shù)。已知陰性對照使用陰性組織切片、陽性對照使用陽性組織切片、空白對照為PBS 液代替一抗。

1.2.2 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白表達判定標(biāo)準(zhǔn)

YAP 陽性表達定位于胞核和胞質(zhì)，p-STAT3陽性表達定位于胞質(zhì)，LMP2A 陽性表達定位于胞質(zhì)和胞膜。免疫組織化學(xué)染色法評判標(biāo)準(zhǔn)［7］：①按染色強度可分為：無著色、淡黃、棕黃以及棕褐，分值記為0～3 分；②按陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比可分為：5%以下、6%～25%、26%～50%、51%～75%、75%以上，分值記為0～4 分；③實驗結(jié)果為①②所得分值相乘后的積：0 分為陰性表達（-），1～4 分為弱陽性表達（+），5～8 分為中度陽性表達（++），9～12 分為強陽性表達（+++），其中以（-）及（+）作為低表達，以（++）及（+++）作為高表達。

1.2.3 隨訪方法

自患者治療結(jié)束后使用電話形式進行為期一年的隨訪，截止時間為2022 年12 月或至患者死亡。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白的高表達率。②分析YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白與觀察組病理參數(shù)關(guān)系：主要包括性別、年齡、TNM 分期、病理分型、組織分化、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和家族史等。③分析不同預(yù)后情況的一般資料及YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白表達：根據(jù)隨訪情況分為預(yù)后良好組（無轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)）和預(yù)后不良組（病情發(fā)展、死亡）［8］，收集臨床資料，主要包括性別、年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、YAP、p-STAT3 和LMP2A。

1.3.4 采用Logistic 回歸模型分析影響NPC 患者預(yù)后相關(guān)因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白表達比較

觀察組YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白高表達率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白在不同組織中的表達（免疫組化染色，×400）Figure 1 Expression of YAP，p-STAT3 and LMP2A proteins in different tissues（immunohistochemical staining，×400）

表1 兩組YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白表達比較［n（%）］Table 1 Comparison of YAP，p-STAT3，LMP2A protein expression between the two groups［n（%）］

2.2 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白與觀察組病理參數(shù)關(guān)系

不同TNM 分期、組織分化以及有無遠處轉(zhuǎn)移NPC 患者之間YAP 表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同TNM 分期和有無淋巴結(jié)、遠處轉(zhuǎn)移NPC 患者之間p-STAT3 表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同TNM 分期、組織分化以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者之間LMP2A 表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白與觀察組病理參數(shù)關(guān)系［n（%）］Table 2 Relationship between YAP，p-STAT3，LMP2A protein and pathological parameters of observation group［n（%）］

2.3 兩組不同預(yù)后情況YAP、p-STAT3、LMP2A表達

經(jīng)隨訪后發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好組181 例，預(yù)后不良組21 例；兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同預(yù)后患者TNM 分期、淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移情況、YAP、p-STAT3、LMP2A 高表達率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 YAP、p-STAT3、LMP2A 蛋白與NPC 患者預(yù)后關(guān)系［n（%）］Table 3 Relationship between YAP，p-STAT3，LMP2A protein and prognosis of NPC patients［n（%）］

2.4 影響NPC 患者預(yù)后相關(guān)因素分析

經(jīng)Logistic回歸分析可知，TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、YAP、p-STAT3 及LMP2A 高表達是影響NPC 患者預(yù)后不良的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

表4 影響NPC 患者預(yù)后多因素分析Table 4 Multivariate analysis of influencing the prognosis of NPC patients

3 討論

NPC 發(fā)病率在我國華南地區(qū)耳鼻咽喉惡性腫瘤中高居首位，在臨床上大部分患者發(fā)現(xiàn)自身患病時病情多已處于中晚期，有30%～40%的晚期患者有高復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，而NPC 侵襲轉(zhuǎn)移是制約其放射、化學(xué)治療療效的主要原因［9］。

有研究顯示［10］，LMP2A 對于維持腫瘤干細(xì)胞特性和調(diào)控細(xì)胞生理活動起著至關(guān)重要的作用。王瑩等研究顯示［11］，LMP2A 在NPC 組織中表達高于對照組，且LMP2A 低表達患者的平均生存時間長于高表達組。本次實驗中，LMP2A 蛋白在NPC組織中的高表達率高于對照組，且Ⅲ+Ⅳ期、中低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NPC 患者LMP2A 蛋白高表達率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期、高分化及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示LMP2A 蛋白可能參與NPC 的病情進展。分析機制為：LMP2A 可以參與Wnt/ β-cate-nin、PI3K/Akt、MAPK、ERK 和Hedge-hogn 等多條信號通路的調(diào)控，且對于細(xì)胞一系列生理活動以及維持腫瘤干細(xì)胞特性具有調(diào)控作用。

有研究表明［12］，腫瘤的發(fā)生與YAP 過量表達關(guān)系密切，YAP 在調(diào)控細(xì)胞的凋亡和發(fā)育生長過程中起著重要的作用。有關(guān)文獻報道［13］，YAP 的過量表達會促進腫瘤細(xì)胞的增殖與生長，且速度與其表達呈正相關(guān)。本實驗中，YAP 蛋白在NPC組織中的高表達率高于對照組，且YAP 蛋白與NPC 患者不同TNM 分期、組織分化以及有無淋巴結(jié)、遠處轉(zhuǎn)移等因素之間存在顯著聯(lián)系，與上述研究結(jié)果相似，提示YAP 蛋白與NPC 疾病的進展有著密切聯(lián)系。

p-STAT3 是STAT3 的磷酸化，且p-STAT3 是信號傳導(dǎo)通路持續(xù)激活的形式，異常激活的STAT3 信號通路在腫瘤的發(fā)展、發(fā)生和細(xì)胞增殖的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系［14］。車祺等［15］研究發(fā)現(xiàn)，p-STAT3 通路的激活是子宮內(nèi)膜腫瘤發(fā)展的重要因素，進一步數(shù)據(jù)分析顯示：子宮內(nèi)膜癌p-STAT3陽性表達率顯著高于健康對照組，提示p-STAT3可能通過STAT3 信號通路參與促進腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。本次研究中，p-STAT3 在NPC 組織中的高表達率高于對照組，且p-STAT3 蛋白與NPC 患者不同TNM 分期、組織分化以及有無淋巴結(jié)、遠處轉(zhuǎn)移等因素之間存在顯著聯(lián)系，與上述研究結(jié)果相似，說明p-STAT3 在NPC 的進展惡化中發(fā)揮著重要作用。

進一步研究顯示：預(yù)后不良組的YAP、p-STAT3 以及LMP2A 高表達率明顯高于預(yù)后良好組，三者與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移均是影響NPC 患者預(yù)后不良的獨立危險因素，提示三者對NPC 患者的預(yù)后有重要的參考價值，可作為臨床評估患者預(yù)后的有效指標(biāo)。在NPC 患者的治療中，應(yīng)對伴有高危因素NPC 患者進行針對性干預(yù)，以有效緩解患者的病情進展，改善其預(yù)后。

綜上所述，NPC 患者中YAP、p-STAT3、LMP2A 呈上升表達，且三者高表達與NPC 病情的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后之間存在密切聯(lián)系，對預(yù)測患者預(yù)后不良具有重要意義。