不同丙型肝炎病毒基因分型檢測方法學的比較

馬雯 何瑞芬 吳濤 閆俊霞 安超 樸文花

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染導致的疾病。丙型肝炎患病率為1%，我國約有1 000 萬丙肝患者［1-2］。HCV 感染常導致肝臟的纖維化、硬化甚至肝細胞癌，嚴重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量［3］。近年來伴隨著直接抗病毒藥物的生產(chǎn)和使用，使得丙型肝炎的確診率和治愈率不斷提升，但在臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)，感染者HCV 基因型、亞型與其臨床癥狀的嚴重程度、抗病毒治療的敏感性、疾病的轉(zhuǎn)歸等具有高度的相關性［4-5］，因此HCV 基因型的確定是丙型肝炎精準治療的前提。本研究使用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）-熒光探針法、聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）-反向點雜交法及Sanger 測序法對已確診丙型肝炎的患者進行分型檢測，比較三種方法的優(yōu)缺點，綜合分析各檢測方法的性能，為實驗室提供參考，同時為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年1 月至2021 年12 月在寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院就診的丙型肝炎確診患者為研究對象，臨床診斷均符合《丙型肝炎防治指南（2019 年版）》中的相關要求［3］。通過詢問病史核對患者信息，排除重復就診者后共收集病例148人，平均年齡（52.43±8.04）歲，男性78 例，女性70例。所有患者HCV 抗體為陽性（Anti-HCV≥5.0 S/CO），HCV-RNA 為陽性（HCV RNA≥1.0×103IU/mL），無合并其他感染（HAV，HBV，HEV，HCMV，EB）、腫瘤、免疫性疾病等，臨床資料完整。本研究已通過醫(yī)學倫理學委員會審查，所有患者均簽署知情同意書。

1.1 樣本

采集患者空腹靜脈血3～5 mL，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑17.17 cm。吸取血清待用。

1.2 儀器與試劑

PCR-熒光探針法使用Applied Biosystems ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀，試劑由圣湘生物科技股份有限公司提供（注冊證編號：20193400697），可檢出5 種丙肝病毒亞型（1 型，2 型，3 型，6 型和1b型）。循環(huán)參數(shù)及熒光檢測通道選擇嚴格按照試劑盒說明書進行設定，內(nèi)標基因Ct 值≤36 時即可對其他基因進行分析，結果判斷依照試劑盒說明書進行。

PCR 反向點雜交法使用美國伯樂T100 PCR 儀，試劑由中山大學達安基因股份有限公司提供（注冊證編號：20153402110），可檢出5 種丙肝病毒亞型（1b型，2a型，3a型，3b型和6a型）。RT-PCR 循環(huán)參數(shù)嚴格按照試劑盒說明書進行設定，雜交過程、顯色、掃描及結果分析嚴格按照試劑盒說明書進行判讀。

Sanger 測序法外送廣州立菲達安診斷產(chǎn)品技術有限公司進行檢測分析。核酸提取使用中山大學達安基因股份有限公司Smart32 全自動核酸提取儀及其配套試劑（粵穗械備20170667）。PCR 擴增使用中山大學達安基因股份有限公司丙肝基因分型檢測試劑盒（PCR-測序法）（注冊證編號：20183401798）及配套質(zhì)控品、對照品。Sanger 測序使用Applied Biosystems 3730 基因分析儀，選擇HCV 基因組核心/包膜1（core-envelop region 1，CORE/E1）區(qū)對樣本進行測序分型。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料使用n（%）表示，使用χ2檢驗。檢測方法一致性的比較使用加權Kappa檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCR-熒光探針法檢測丙肝基因分型

PCR-熒光探針法檢出136 例，檢出率91.89%，共檢出4 種基因型，分別為1b、2+、3+和6+。見表1、圖1。

圖1 部分丙型肝炎患者PCR-熒光探針法基因分型檢測結果Figure 1 Results of genotyping by PCR-fluorescent probe method in some patients with hepatitis C

表1 丙型肝炎患者PCR-熒光探針法基因分型檢測結果［n（%）］Table 1 Results of genotyping of hepatitis C patients by PCR-fluorescent probe method［n（%）］

2.2 PCR-反向點雜交法檢測丙肝基因分型

PCR-反向點雜交法檢出135 例，檢出率為91.22%，共檢出5 種基因型，分別為1b、2a、3a、3b和6a。見表2、圖2。

圖2 部分丙型肝炎患者PCR-反向點雜交法基因分型檢測結果Figure 2 Results of genotyping by PCR-reverse dot blot method in some patients with hepatitis C

表2 丙型肝炎患者PCR-反向點雜交法基因分型檢測結果［n（%）］Table 2 Results of genotyping of hepatitis C patients by PCR-reverse dot blot method［n（%）］

2.3 Sanger 測序法檢測丙肝基因分型

Sanger 測序法檢出148 例，檢出率100%，共檢出7 種基因型，分別為1b、2a、3a、3b、6a、1g 和6xa。見表3、圖3。

圖3 部分丙型肝炎患者Sanger 測序法基因分型檢測結果Figure 3 Results of genotyping by Sanger sequencing in some patients with hepatitis C

表3 丙型肝炎患者Sanger 測序法檢測結果［n（%）］Table 3 Results of genotyping of hepatitis C patients by Sanger sequencing［n（%）］

2.4 PCR-熒光探針法與Sanger 測序法的比較

PCR-熒光探針法未檢出的12 例樣本中，Sanger 測序法均已檢出，其中包括1 例6xa 型，1 例1g 型。兩種方法的檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=7.565，P＞0.05），見表4。兩種方法比較一致性較高（κ=0.871，P＜0.001）。見表5。

表4 PCR-熒光探針法與Sanger 測序法檢出率的比較［n（%）］Table 4 Comparison of the detection rate between PCR-fluorescence probe and Sanger sequencing［n（%）］

表5 PCR-熒光探針法與Sanger 測序法一致性分析Table 5 Consistency analysis between PCR-fluorescence probe method and Sanger sequencing

2.5 PCR-反向點雜交法與Sanger 測序法的比較

PCR-反向點雜交法未能測出的13 例樣本，Sanger 測序法均已檢出，其中包括1 例1g 型。PCR-反向點雜交法檢出1 例3b 型，Sanger 測序法檢出為6xa 型。兩種方法的檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=8.696，P＞0.05），見表6。PCR-反向點雜交法與Sanger 測序法一致性高（κ=0.609，P＜0.05）。見表7。

表6 PCR-反向點雜交法與Sanger 測序法的比較［n（%）］Table 6 Comparison of the detection rate between PCR-reverse dot blot method and Sanger sequencing［n（%）］

表7 PCR-反向點雜交法與Sanger 測序法一致性分析Table 7 Consistency analysis between PCR-reverse dot blot method and Sanger sequencing

3 討論

丙型肝炎具有極強的隱匿性，發(fā)展為肝硬化、肝細胞癌的可能性極大［2，6］。為盡快實現(xiàn)消除病毒性肝炎的目標，要求提高HCV 患者的確診率和治療率，在治療過程中針對使用基因型特異性藥物治療的HCV 感染者進行HCV 基因分型檢測［7］。

由于HCV 基因組的變異性及檢測方法的局限性，約10%的丙肝基因分型檢測會出現(xiàn)漏檢、誤檢以及混淆的現(xiàn)象［8］。目前可用于HCV 分型檢測的方法包括測序法、型特異性引物擴增法、限制性片段長度多態(tài)性法、型特異性探針雜交法、基因芯片法等［9］。Sanger 測序法作為檢測HCV 基因分型的推薦方法［3］，是HCV 基因分型的“金標準”。本研究通過巢式PCR 擴增有代表性的基因片段CORE/E1 區(qū)，使用測序儀對核苷酸序列測定后，與GenBank 中已上傳的基因型進行序列比對，使用相關軟件進行HCV 基因系統(tǒng)進化樹分析，檢出多種常見丙肝基因型和基因亞型，并發(fā)現(xiàn)新的基因型和基因亞型。在納入本研究的148 例丙肝抗體陽性患者樣本中，Sanger 測序法檢出率為100%，且檢出了1g 型和6xa 型2 種未在本地區(qū)中報道過的基因亞型［10］。盡管測序法可精準地檢出HCV 各基因亞型及突變，但其檢測周期長，流程復雜，對實驗室設備、操作人員要求較高，難以在臨床中廣泛推廣。

我國醫(yī)療機構多采用PCR-熒光探針法、PCR-反向點雜交法對大規(guī)模樣本進行丙肝基因分型的測定［11-12］，與Sanger 測序法相比，PCR-熒光探針法操作簡單、快速，本研究中PCR-熒光探針法檢出率為91.89%，與Sanger 測序法比較檢出率無統(tǒng)計學差異，且一致性較高。使用PCR-反向點雜交法檢出率為91.22%，與Sanger 測序法比較檢出率無統(tǒng)計學差異，且一致性較高。相比PCR-熒光探針法，PCR-反向點雜交法增加了雜交和顯色的步驟，檢測周期略長，但可檢出1b 型、2a 型、3a 型、3b 型、6a型5 種常見的亞型以及1b/2a 型、1b/3b 型、1b/6a 型3 種混合型陽性樣本，能較全面地檢測出常見的HCV 基因亞型，能夠滿足現(xiàn)階段臨床常規(guī)診療需要。相對其他兩種方法，Sanger 測序法對于非常規(guī)基因亞型的檢測更有優(yōu)勢，但本研究樣本均來自于同一地區(qū)，數(shù)量有限，且本地區(qū)人口流動性相對較小，因此無法廣泛地涵蓋多種HCV 基因亞型，可能對結果造成一定的影響。針對不同檢測方法檢出率和一致性的比較和分析，需進一步增加樣本數(shù)量以期獲得更為全面和準確的結論。

針對不同基因亞型的患者制定差異化、個性化的治療方案，可有效地降低HCV 相關肝硬化以及肝細胞癌的發(fā)生率和死亡率。PCR-熒光探針法、PCR-反向點雜交法與測序法相比一致性高，且對實驗室設備、技術人員水平要求低，操作簡單，檢測周期短，適合基層醫(yī)療機構推廣使用。當其他方法無法檢出或檢測結果不明確時，建議結合臨床需要，使用Sanger 測序法對其他丙肝基因分型方法進行補充，以期滿足臨床診療需求。