m6A去甲基化酶FTO通過調(diào)控p53磷酸化抑制急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展

華春蘭,李海軍,喻靜

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450052)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤,發(fā)病率高,預(yù)后差。m6A甲基化是20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)的一種RNA分子上的甲基化修飾,存在于各種RNA中,但主要在mRNA中出現(xiàn)[1]。它主要是通過影響mRNA與讀取蛋白的結(jié)合,從而調(diào)控mRNA的可變剪接、翻譯效率和穩(wěn)定性等,進(jìn)而改變基因表達(dá)[2]。在細(xì)胞癌變的過程中,m6A甲基化這一表觀遺傳修飾能通過調(diào)控癌基因、抑癌基因的mRNA分子的表達(dá)水平來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。FTO是m6A的去甲基酶,其主要生理功能為調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝速率、能量平衡、體重及體脂聚集。有研究報(bào)道FTO基因非編碼區(qū)域的多個(gè)SNPS與乳腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[3-4]。FTO通過對下游靶基因RNA m6A進(jìn)行去甲基化修飾,調(diào)控下游靶基因的表達(dá),從而促進(jìn)AML、肺癌以及消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外,研究證明,在混合譜系白血病重排的AML細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染FTO基因后,AML細(xì)胞的生長及增殖能力增強(qiáng),凋亡減少,同時(shí)細(xì)胞中mRNA m6A水平下降;而轉(zhuǎn)染突變體FTO基因(去甲基化功能喪失)后,AML細(xì)胞則無上述改變,說明FTO在調(diào)控AML發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5-7],但FTO通過何種機(jī)制調(diào)控AML的發(fā)生發(fā)展并不清楚。因此,進(jìn)一步研究FTO調(diào)控AML發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,突破常規(guī),為AML的分子病理診斷和分子靶向治療探尋新方向,才可能改變治療現(xiàn)狀,為患者提供更有效的治療手段。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

293T細(xì)胞、K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。臨床材料取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018年1月至2019年1月的27例AML患者和15例健康對照者骨髓。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過,編號(hào)為ZZU-LAC20230331[09]。所有患者均簽署知情同意書。流式相關(guān)抗體CD45-Percp、p-p53-FITC(Alexa Fluor 488)購自e-Bioscience。凋亡相關(guān)試劑:Annexin Ⅴ-PE/7-AAD apoptosis Kit FITC、IntraSure kit均為美國BD公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Transgene公司。Fast Start Universal SYBR Green Master購自瑞士Roche公司。PBS、RPMI1640培養(yǎng)基、Gibico胎牛血清購自美國Gibico公司。普通PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品;LSRⅡ流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 PCR檢測白血病患者及健康對照者外周血中FTO表達(dá)情況

采用熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)法。利用Qiagen RNeasy Mini Kit試劑盒提取AML患者和健康對照者標(biāo)本總RNA,利用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒,用Oligo(dT)18,2×TS Reaction Mix,TransScript RT/RI Enzyme混合物以RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR分析。PCR反應(yīng)體系:10 μL SYBR Green,3 μL模板,10 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL,去離子水5 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃、10 min;95 ℃、15 s),60 ℃、60 s,45個(gè)循環(huán);每個(gè)標(biāo)本3復(fù)孔,按照上述條件進(jìn)行擴(kuò)增,使用2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。FTO引物序列:前向5’-ACTTGGCTCCCTTATCTGACC-3’,反向5’-TGTGCAGTGTGAGAAAGGCTT-3’。GAPDH引物序列:前向5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,反向5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

FTO-siRNA購自Invitrogen公司,共2個(gè)FTO-siRNA(簡稱為hFTO-siRNA1、hFTO-siRNA2)、1個(gè)hFTO-siNC。按照慢病毒包裝試劑盒說明書轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并收集富含慢病毒顆粒的上清液。將細(xì)胞(每孔5×105)接種至6孔板中,保證細(xì)胞在孔中均勻分布。將慢病毒轉(zhuǎn)染液和陰性對照分別加入相應(yīng)培養(yǎng)孔中,置37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。約6 h后去除轉(zhuǎn)染混合液,更換為新鮮培養(yǎng)基,之后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡檢測使用Anncxin V-PE/7-AAD試劑盒(BD公司)。每管樣品(50 μL)細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè),依次加入Annexin V-PE(5 μL)及7-AAD(5 μL),混勻后室溫避光孵育15 min。再加入400 μL的Binding buffer 重懸并過膜,1 h之內(nèi)上機(jī)檢測。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化

細(xì)胞內(nèi)磷酸化檢測使用BD公司檢測試劑盒,每管樣品(50 μL)細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè)。樣品管按照檢測項(xiàng)目分別加入相應(yīng)的抗體,冰上孵育30 min。每管加入100 μL試劑A,混勻并室溫避光放置5 min。每管加入1 mL固定裂紅液,室溫避光孵育10 min后2 000 r·min-1離心8 min并棄上清,留約50 μL液體。每管加入50 μL試劑B及p53s46抗體,室溫孵育1 h,每管用1 mL PBS洗1遍,2 000 r·min-1離心(Eppendorf 5810離心機(jī),半徑30.5 cm)8 min并棄上清,重懸至300 μL,上機(jī)檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FTO在AML中高表達(dá)

本研究對27例人AML骨髓標(biāo)本和15例正常骨髓標(biāo)本中FTO基因表達(dá)進(jìn)行RT-PCR檢測,結(jié)果顯示在人AML骨髓細(xì)胞中,FTO的表達(dá)水平高于健康對照者(圖1A)。利用生物信息學(xué)方法對TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析,結(jié)果顯示在白血病中FTO表達(dá)水平與健康對照者相比升高(圖1B);FTO高表達(dá)組總體生存率約為100個(gè)月,較FTO低表達(dá)組(總體生存率約為200個(gè)月)低(P<0.01)(圖1C);Pearson相關(guān)性分析顯示FTO與p53之間存在相關(guān)性(P<0.001)(圖1D)。

A為FTO在人AML中的表達(dá);B為TCGA數(shù)據(jù)庫中FTO的表達(dá)水平;C為FTO的表達(dá)與生存率;D為FTO與p53之間的相關(guān)性;*為P<0.05;**為P<0.01。

2.2 FTO表達(dá)降低后促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡

為了檢測FTO表達(dá)降低后HL60和K562細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況,首先用FTO的siRNA對FTO進(jìn)行敲降,使FTO表達(dá)降低,敲降效率見表1;接著使用流式的方法通過Annexin V和7-AAD標(biāo)記檢測HL60和K562細(xì)胞的凋亡情況,其中Annexin V陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞,Annexin V陰性細(xì)胞為活細(xì)胞,結(jié)果顯示FTO表達(dá)降低后白血病細(xì)胞的凋亡增加,見圖2、表2。

表1 FTO-siRNA的敲降效率

表2 不同處理組HL60和K562細(xì)胞發(fā)生凋亡比率

2.3 FTO表達(dá)降低后p53磷酸化水平升高

生物信息學(xué)分析顯示FTO與p53存在相關(guān)性,并且在細(xì)胞系中FTO表達(dá)降低后白血病細(xì)胞凋亡增多,為了探討白血病細(xì)胞凋亡是否與p53的磷酸化有關(guān),采用流式方法檢測p53的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)FTO表達(dá)降低后p53磷酸化水平升高,見圖3、表3。

表3 p53磷酸化平均熒光強(qiáng)度

A為FTO表達(dá)降低后HL60細(xì)胞中p53磷酸化水平;B為FTO表達(dá)降低后K562細(xì)胞中p53磷酸化水平。

3 討論

隨著免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)的應(yīng)用,有研究認(rèn)為白血病的發(fā)生可能是細(xì)胞遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)共同作用的結(jié)果。人類AML細(xì)胞具有獨(dú)特的基因表達(dá)譜,在AML細(xì)胞中的許多突變基因都編碼具有表觀遺傳調(diào)控或修飾功能的蛋白質(zhì)分子,如DNMT3A、TET2、IDH、EZH2、KMT2A和KDM5A等,提示表觀遺傳修飾的改變是AML發(fā)生的重要機(jī)制[8-9]。

RNA m6A甲基化于20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn),是一種最常見的甲基化修飾,其由一系列甲基轉(zhuǎn)移酶(METTL3/14、WTAP、RBM15/15B、KIAA1429,即m6A編碼器)、去甲基酶(FTO和ALKBH5,即m6A消碼器)和識(shí)別碼(YTHDF1/2/3、YTHDC1、 HNRNPA2B1、 HNRNPC、eIF3、FMR1、LRPPRC,即m6A讀碼器)協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)可逆過程[10-11]。FTO是m6A的去甲基酶,屬于AlkB家族高度同源蛋白,表達(dá)于細(xì)胞核[12]。2007年Frayling等[13]在研究與肥胖發(fā)生相關(guān)基因時(shí)首次命名,然后迅速成為各科研領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Pitman等[14]發(fā)現(xiàn)敲除FTO基因后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞中ATP水平顯著增高,而磷酸化的AMP蛋白激酶和蛋白激酶B表達(dá)下降,這提示FTO基因敲除可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)能量平衡的破壞。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn),雌激素可通過PI3K-Akt和絲裂素活化蛋白激酶信號(hào)通路對FTO基因進(jìn)行調(diào)控,敲除FTO基因可明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株的增殖活性。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)FTO蛋白可通過降低其靶基因ASB2、RARA等mRNA中m6A水平,促進(jìn)這些基因表達(dá),從而促進(jìn)AML的發(fā)生,同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)FTO可抑制全反式維甲酸誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞向粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的分化。Su等[17]發(fā)現(xiàn)用羥戊二酸抑制FTO的去甲基化酶活性,可促進(jìn)MYC和CEBPA轉(zhuǎn)錄本中m6A水平,抑制AML的發(fā)生發(fā)展。這些研究使FTO基因成為一種新興的腫瘤治療靶點(diǎn)。本研究顯示在人AML細(xì)胞中,FTO的表達(dá)水平高于正常細(xì)胞。另外,通過基因生物信息學(xué)的方法比較白血病患者與健康者樣本中FTO的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)白血病患者中FTO表達(dá)水平升高;分析白血病患者總體生存率發(fā)現(xiàn),FTO高表達(dá)組患者的總體生存率約為100個(gè)月,FTO低表達(dá)組患者的總體生存率約為200個(gè)月,FTO高表達(dá)組患者的總體生存率低于FTO低表達(dá)組。在細(xì)胞系HL60和K562中,利用FTO-siRNA將FTO進(jìn)行敲降使其表達(dá)降低后,發(fā)現(xiàn)HL60和K562細(xì)胞的凋亡增加,表明FTO表達(dá)降低后可促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡。以上結(jié)果表明FTO在白血病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。

p53是定位于細(xì)胞核的一種抑癌因子,在抑制腫瘤的發(fā)生進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等方面起著重要的作用,其編碼基因定位于人染色體17p13上,全長20 kb,共編碼393個(gè)氨基酸[18]。p53蛋白從氨基端到羧基端包括2個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、1個(gè)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域、1個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、1個(gè)四聚體寡聚化結(jié)構(gòu)域和1個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域[19]。當(dāng)細(xì)胞接受DNA損傷、活性氧及缺氧等信號(hào)刺激時(shí),p53蛋白會(huì)發(fā)生乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化等修飾,活化并激活下游信號(hào)通路,通過阻滯細(xì)胞周期、修復(fù)DNA損傷、激活細(xì)胞凋亡及自噬等多種機(jī)制抑制腫瘤形成[20]。有研究證實(shí)MDM2可以通過抑制p53與p300的結(jié)合,降低p53的乙?；竭M(jìn)而降低p53的轉(zhuǎn)錄活性,形成p53-MDM2負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路,以此來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡[21-22]。另外有研究顯示,p53還在心血管疾病中起著重要的作用,p53失活后可以加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[23]。本研究首先利用生物信息學(xué)分析的方法,通過Pearson相關(guān)系數(shù)和P值發(fā)現(xiàn)FTO與p53之間存在相關(guān)性,并且FTO表達(dá)降低后白血病細(xì)胞的凋亡增加,為了驗(yàn)證FTO敲降后p53的變化,采用流式方法檢測了p53的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞系HL60和K562中,FTO表達(dá)降低后p53磷酸化平均熒光強(qiáng)度增加,表明FTO表達(dá)降低后p53磷酸化水平升高。

4 結(jié)論

在AML中FTO表達(dá)升高,FTO表達(dá)降低可使p53磷酸化水平升高,FTO可以通過調(diào)控p53磷酸化,抑制AML的發(fā)生發(fā)展,這可以為AML的診療尋找新的靶點(diǎn)并提供理論依據(jù)。