GC-MS法測(cè)定溴地斯的明原料藥中基因毒性雜質(zhì)溴甲烷

唐新茹　丁倩倩　金紅蘭　黃曉光　王雪　孫雪　楊慧

摘 要：采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定溴地斯的明原料藥中溴甲烷的殘留量，應(yīng)用HP-1ms（30 m×0.25 mm×1.0 μm）毛細(xì)管柱分離樣品，設(shè)置起始柱溫為40 ℃、載氣為氦氣、柱流量為1.0 mL/min，質(zhì)譜檢測(cè)方式為選擇性離子檢測(cè)（SIM），目標(biāo)離子的m/z為94。結(jié)果表明，在此色譜條件下，溴甲烷與溴乙烷及相鄰雜質(zhì)峰之間能較好分離，且空白溶劑、溴地斯的明不干擾檢測(cè)；溴甲烷的線性關(guān)系在10.00～100.00 ng/mL區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)良好（r=0.999）；平均回收率為98.53%（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.26%，n=9）；檢測(cè)限和定量限分別是1.50、3.00 ng/mL。由此可得結(jié)論，該測(cè)定方法專屬性較好、靈敏度高，能用于溴地斯的明中溴甲烷的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：溴地斯的明；溴甲烷；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；基因毒性雜質(zhì)

溴地斯的明（Distigmine Bromide）的分子式為C₂₂H₃₂Br₂N₄O₄，相對(duì)分子質(zhì)量為576.32。溴地斯的明片中溴地斯的明的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于95.00%且不超過(guò)標(biāo)示量的105.00%[1]。溴地斯的明是一種人工合成的可逆性膽堿酯酶抑制劑，屬于氨基甲酸酯類(lèi)，由Schmid于1950年首次合成。其化學(xué)結(jié)構(gòu)由兩個(gè)吡啶斯的明分子組成，由環(huán)氧亞甲基結(jié)構(gòu)連接。在一些亞洲和歐洲國(guó)家，包括日本和德國(guó)，其主要臨床適應(yīng)癥是重癥肌無(wú)力[2-3]。然而，其在日本也被用于治療青光眼和膀胱活動(dòng)不足，特別是用于治療下尿路功能障礙以及手術(shù)、脊髓損傷和糖尿病引起的神經(jīng)源性膀胱活動(dòng)不足，還可以有效治療藥物和前列腺增大所致的尿液排泄功能障礙[4]。

溴甲烷（Bromomethane）又名甲基溴，是一種有機(jī)化合物，味甜，無(wú)色，可用在土壤中熏蒸殺蟲(chóng)[5-6]。其主要損傷人體的呼吸道，中毒患者的臨床表現(xiàn)為頭痛惡心、四肢無(wú)力、頭暈及走路不穩(wěn)、言語(yǔ)不清及酒醉感，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)高熱、意識(shí)模糊、癲癇甚至多種器官損傷[7]。溴甲烷的沸點(diǎn)是4.0 ℃，氣體的穿透力很強(qiáng)，因?yàn)椴灰兹家妆?，所以可用作滅火劑、冷凍劑及甲基化劑等[5]；基因毒性雜質(zhì)能直接破壞DNA并引起突變、重組，能間接引起染色體斷裂最終致癌變及致突變性的物質(zhì)[8-9]；安全閾值很低，低濃度即可導(dǎo)致癌變。隨著法律法規(guī)的逐漸完善，對(duì)基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)要求越來(lái)越嚴(yán)格，充分合理的基因毒性雜質(zhì)研究決定了產(chǎn)品是否可以上市，這對(duì)企業(yè)的監(jiān)管要求也更高[10]。因此，建立一種能對(duì)溴地斯的明中的溴甲烷殘留量進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的方法是必要的。根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（International Conference on Harmonization，ICH）[11]M7指南確定溴甲烷的限度，因?yàn)槲床樵兊戒寮淄榈腡D50數(shù)值，所以采用日安全劑量1.5 μg進(jìn)行計(jì)算。溴地斯的明的最大日劑量為20 mg，遺傳毒性雜質(zhì)溴甲烷的限度約為75×10^-6。鑒于對(duì)溴甲烷的嚴(yán)格控制要求，確定溴甲烷的限度為1×10^-6。比較常見(jiàn)的原料藥中基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)方法有高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和氣相色譜（Gaschromatography，GC）等，但溴地斯的明中的溴甲烷限度較低，常規(guī)的單一儀器檢測(cè)方法靈敏度和專屬性達(dá)不到要求。因此，本研究建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）對(duì)溴甲烷進(jìn)行測(cè)定，且該檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證能準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)溴甲烷的含量，為溴地斯的明中其他基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)提供參考[12-14]。

1?儀器與試劑

1.1? 試驗(yàn)儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7010B-8890，Agilent公司）；毛細(xì)管色譜柱（HP-1ms）；電子天平（BT-125D型，Sartorius公司）。

1.2? 試驗(yàn)試劑

乙醇（色譜純，Eternal公司）；溴甲烷（批號(hào)：218061559，AccuStandard公司）；溴乙烷（687432，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；溴地斯的明（批號(hào)：220706、220712、220713，吉林省博大偉業(yè)制藥有限公司）。

2?方法與結(jié)果

2.1? GC-MS條件

2.1.1? 色譜條件

采用規(guī)格為30 m× 0.25 mm×1.0 μm的HP-1ms毛細(xì)管柱，載氣為氦氣，柱流量為? ? ?1 mL/min；進(jìn)樣口溫度為200 ℃；頂空平衡溫度為50 ℃，平衡時(shí)間為20 min；初始柱溫為? 40 ℃，維持3 min；以25 ℃/min升至290 ℃，維持5 min。

2.1.2? 質(zhì)譜條件

采用電離源EI，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為290 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，電離電壓為70 eV，碰撞器為氮?dú)猓軇┭舆t1 min，采集模式為選擇性離子檢測(cè)（Selected Ion Monitor，SIM），溴甲烷的采集離子為97，溴乙烷的采集離子為108。

2.2? 溶液配制

2.2.1? 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取適量溴乙烷加乙醇稀釋，制成每1.00 mL中約含溴乙烷1 mg的溶液，再精確量取適量溴乙烷加水稀釋，制成每1.00 mL中約含溴乙烷100 ng的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液；精確量取適量溴甲烷對(duì)照品溶液，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋，配制成每1.00 mL中約含50 ng溴甲烷的溶液，精確量取2.00 mL作為對(duì)照品溶液。

2.2.2? 供試品溶液的制備

精確稱取適量溴地斯的明，加溴乙烷定位溶液溶解，再用溴乙烷定位溶液稀釋至適當(dāng)濃度，精確量取2.00 mL置于頂空瓶中作為供試品定位溶液。

2.2.3? 混標(biāo)溶液的制備

精確稱取適量溴地斯的明，加溴乙烷定位溶液溶解并稀釋至適當(dāng)濃度，精確加入適量溴甲烷對(duì)照品，搖勻，精確量取2.00 mL作為混標(biāo)溶液。

2.3? 方法學(xué)考察

2.3.1? 專屬性考察

分別精確量取配制好的供試品溶液2.00 mL、溴甲烷對(duì)照品溶液2.00 mL、溴乙烷對(duì)照品溶液2.00 mL、混標(biāo)溶液2.00 mL置于頂空瓶中，進(jìn)樣結(jié)果如圖1—5所示。

結(jié)果表明，在此色譜條件下，溴甲烷與溴乙烷及相鄰雜質(zhì)峰之間能較好地分離，且空白溶劑、溴地斯的明不干擾檢測(cè)。

2.3.2? 檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)

精確量取適量溴甲烷對(duì)照品溶液及溴乙烷并稱定，用水稀釋至不同濃度，按規(guī)定色譜條件進(jìn)樣，主成分信噪比約為10∶1及3∶1時(shí)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度分別為定量限及檢測(cè)限。測(cè)定結(jié)果表明，溴甲烷的檢測(cè)限為1.50 ng/mL、定量限為3.00 ng/mL，溴乙烷的檢測(cè)限為5.04 ng/mL、定量限為10.08 ng/mL。

2.3.3? 線性關(guān)系考察

精確量取適量溴甲烷對(duì)照品溶液，以內(nèi)標(biāo)溶液稀釋成每1.00 mL中約含溴甲烷500 ng的溶液，作為線性儲(chǔ)備液。精確量取線性儲(chǔ)備液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋并定容。分別精確量取上述溶液各2.00 mL置于頂空瓶中，密封，50 ℃預(yù)熱20 min，頂空進(jìn)樣，記錄結(jié)果。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以溴甲烷與溴乙烷峰面積的比值為縱坐標(biāo)，結(jié)果線性回歸方程為：Y=0.023X－0.098，相關(guān)系數(shù)r=0.999。所得結(jié)果表明當(dāng)進(jìn)樣量為2.00 mL時(shí)，在10.00～100.00 ng/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積比值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4? 精密度試驗(yàn)

首先，精確量取適量溴甲烷對(duì)照品溶液，以內(nèi)標(biāo)溶液稀釋成每1.00 mL中約含50 ng溴甲烷的溶液，作為精密度試驗(yàn)溶液。其次，精確量取2.00 mL置于頂空瓶中，按照設(shè)定的色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得溴甲烷相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為3.94%，溴乙烷RSD為8.98%，峰面積比值RSD為6.03%，儀器精密度良好（n=6）。

2.3.5? 重復(fù)性試驗(yàn)

取溴地斯的明約100 mg，精確稱定，置于頂空瓶中，精確加入內(nèi)標(biāo)液2.00 mL，振搖使其溶解，密封，作為供試品溶液；另按精密度試驗(yàn)方法配制對(duì)照品溶液；頂空平衡溫度為50 ℃，平衡時(shí)間為20 min，分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液頂空進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，連續(xù)測(cè)定6次，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算溴甲烷殘留量。結(jié)果顯示，6次測(cè)定溴甲烷的檢出量RSD為5.86%，重復(fù)性良好。

2.3.6? 回收率試驗(yàn)

精確稱取供試品約250 mg置于5.00 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)液稀釋“線性試驗(yàn)”項(xiàng)下的線性儲(chǔ)備液0.25、0.50、? ? 0.75 mL各3份，并定容，振搖使其溶解，作為低、中、高3種質(zhì)量濃度的溶液（分別為限量質(zhì)量濃度的50.00%、100.00%、150.00%）。另按上述方法制備對(duì)照品溶液，各精確量取2.00 mL，置于頂空瓶中，密封，50 ℃預(yù)熱? ? ? ?20 min，頂空進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果如表1所示。該結(jié)果表明，9份樣品溴甲烷平均回收率為98.53%，RSD為1.26%，回收率符合要求。

2.3.7? 中間精密度試驗(yàn)

按照重復(fù)性測(cè)定方法，由另一試驗(yàn)人員另取6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，合并計(jì)算12次測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明，12次測(cè)定溴甲烷的檢出量RSD為5.30%，中間精密度良好。

2.3.8? 耐用性試驗(yàn)

在柱流速和溫度發(fā)生微小變化時(shí)，分別精確量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2.00 mL，置于頂空瓶中，密封，50 ℃預(yù)熱20 min，頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，觀察色譜條件發(fā)生的微小變化，溴甲烷的檢出量在0.12%～0.15%，影響不大，故耐用性良好。

2.3.9? 樣品測(cè)定

取3批溴地斯的明（220706/220712/220713）配成供試品溶液，按規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣，3批樣品中溴甲烷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.000 005%、0.000 004%、0.000 007%，表明3批樣品中溴甲烷的殘留量均符合標(biāo)準(zhǔn)。

3?討論

3.1? 監(jiān)測(cè)離子的選擇

精確稱取適量溴甲烷對(duì)照品溶液及溴乙烷，頂空進(jìn)樣并分析。采用SCAN全掃描模式在50～150 amu質(zhì)量掃描范圍內(nèi)對(duì)溴甲烷、溴乙烷進(jìn)行測(cè)定，所得質(zhì)譜如圖6、圖7所示，定性分析確定溴甲烷的定量離子（m/z）為94，溴乙烷的定量離子（m/z）為108。

3.2? 各參數(shù)條件的篩選

毛細(xì)管柱的選擇很重要，不同毛細(xì)管柱（VF-624ms、VF-WAXms）對(duì)溴甲烷的影響很大，會(huì)出現(xiàn)響應(yīng)值低和空白溶劑存在干擾的情況。HP-1ms毛細(xì)管柱檢測(cè)出的峰形較好，空白溶劑不干擾檢測(cè)，專屬性強(qiáng)，故采用此毛細(xì)管柱。

在其他色譜條件的摸索過(guò)程中，首先采用的是不分流進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)色譜峰的響應(yīng)值不符合要求，峰形不完整。若采用分流進(jìn)樣，當(dāng)分流比為15∶1時(shí)，溴甲烷和溴乙烷能分離出來(lái)，且響應(yīng)值正常，故采用分流進(jìn)樣。

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