苧麻expansin 家族成員鑒定與表達(dá)分析

石亞亮，鐘意成，黃坤勇，牛娟，孫志民，陳建華?，欒明寶?

(1.三亞中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家南繁研究院，海南 三亞 572024；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410221)

擴(kuò)展蛋白最早被鑒定為一種具有細(xì)胞壁松弛作用的蛋白，部分介導(dǎo)了植物細(xì)胞壁延伸和細(xì)胞生長(zhǎng)。 擴(kuò)展蛋白主要分為兩個(gè)蛋白家族，即α 和β 擴(kuò)展蛋白亞族，他們不僅作用于細(xì)胞膨脹，還參與調(diào)節(jié)包括形態(tài)發(fā)生、果實(shí)軟化、花粉管生長(zhǎng)等多種植物生長(zhǎng)過(guò)程[1]。 蛋白功能被細(xì)胞壁酸性條件激活，在植物中存在一些反應(yīng)機(jī)制會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞壁pH 值發(fā)生變化而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[2]。 由于擴(kuò)展蛋白對(duì)細(xì)胞壁具有獨(dú)特的修飾作用，先后在棉花和苧麻關(guān)于纖維發(fā)育的研究中得到關(guān)注，已有研究發(fā)現(xiàn)3 種編碼擴(kuò)展蛋白的基因在苧麻的上部莖皮上調(diào)表達(dá)[3－4]。 一些家族成員基因在其他植物中的功能相繼被證實(shí)，涉及促進(jìn)生長(zhǎng)、改善纖維品質(zhì)和鹽脅迫響應(yīng)，例如水稻OsEXP4[5]、棉花GhEXPA8[6]和GbEXPATR[7]、小麥OsEXPB23[8]等。 擴(kuò)展蛋白在苧麻中的研究才剛剛起步，該家族基因具體的分子功能及其對(duì)纖維細(xì)胞的發(fā)育和纖維品質(zhì)的影響尚不清楚。

在Swiss－Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)中:水稻的56 個(gè)編碼擴(kuò)展蛋白的基因，包括α 亞族34 個(gè)，β 亞族19 個(gè)；擬南芥36 個(gè)編碼擴(kuò)展蛋白的基因包括α 亞族25 個(gè)和β 亞族7 個(gè)；玉米4 個(gè)基因都屬于β 亞族。苧麻中通過(guò)轉(zhuǎn)錄組序列拼接和同源基因克隆的方法發(fā)現(xiàn)了12 個(gè)α 亞族和4 個(gè)β 亞族，共16 個(gè)編碼擴(kuò)展蛋白的基因[9]。 然而，目前還未對(duì)苧麻expansin家族成員的具體數(shù)目和類型進(jìn)行全面鑒定。苧麻基因組測(cè)序草圖的順利完成[10]，使利用生物信息學(xué)在全基因組水平上分離和鑒定expansin家族成為可能。 因此，本研究利用苧麻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)苧麻expansin家族成員及其類型進(jìn)一步鑒定與分析，旨在為苧麻纖維發(fā)育候選基因挖掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 苧麻expansin 家族成員鑒定

在Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)下載擴(kuò)展基因家族保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)文件(登錄號(hào)分別為PF03330 和PF01357)，利用hmmer v3.0 軟件構(gòu)建苧麻expansin家族專有的保守結(jié)構(gòu)域隱馬爾可夫模型文件，然后在苧麻基因組蛋白數(shù)據(jù)中搜索家族成員[11]。 將家族蛋白氨基酸序列在HMMER 網(wǎng)站(https:/ /www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer)進(jìn)行序列分析。

1.2 理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位

通過(guò)ExPASy 網(wǎng)站(https:/ /www.expasy.org/)中的Protparam 程序分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)，利用Signal P－5.0 預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽，采用pLoc－mPlant 進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 擴(kuò)展基因結(jié)構(gòu)及蛋白序列分析

利用在線軟件MEME(http:/ /meme－suite.org/)對(duì)擴(kuò)展蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。 最大motif數(shù)量設(shè)為20，其他參數(shù)為默認(rèn)值。 根據(jù)苧麻基因組的DNA 序列和編碼區(qū)序列，使用TBtools 軟件[12]分析和繪制基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)圖。

1.4 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用分子進(jìn)化分析軟件MEGA7 的ClustalW 程序?qū)﹁b定的苧麻擴(kuò)展蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用鄰接法(NJ，neighbor－joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。 在Swiss－Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)下載水稻和擬南芥的expansin家族的蛋白氨基酸序列，與苧麻的蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，默認(rèn)參數(shù)，bootstrap值設(shè)為500，構(gòu)建NJ 進(jìn)化樹(shù)。

1.5 表達(dá)分析

依據(jù)本課題組已經(jīng)完成的苧麻轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，即2 個(gè)纖維細(xì)度差異大的品種，編號(hào)為2－25(纖維細(xì)度1312 m/g)和3－4(2788 m/g)，發(fā)芽2 周(T1)、4 周(T2)、6 周(T3)、8 周(T4)、10 周(T5)5 個(gè)不同纖維發(fā)育時(shí)期莖皮中各基因的FPKM 值[13－14]，分析其5 個(gè)發(fā)育時(shí)期的expansin家族基因表達(dá)模式。 利用與轉(zhuǎn)錄組相同的樣品材料(液氮冷凍，－80 ℃保存)，提取苧麻莖皮總RNA，RNA 提取方法和模板cDNA 的合成均按照試劑盒操作手冊(cè)。 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 用于莖皮總RNA 提取，Thermo Scientific RevertAid first－strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific， Vilnius， Lithuania)用于cDNA 合成，合成20 μL 體系cDNA，用ddH2O 稀釋一倍后備用。 根據(jù)擴(kuò)展蛋白基因家族表達(dá)差異的結(jié)果在Primer 5 設(shè)計(jì)相關(guān)基因的特異性引物，以苧麻18S rRNA為內(nèi)參基因， 于Bio－Rad iQ5 Real－Time PCR System (Bio－Rad， CA， USA)分析儀上進(jìn)行qRT－PCR 分析，25 μL qPCR 體系，即1 μL cDNA，12.5 μL 2×SYBR qPCR Mix (北京艾德萊生物公司)， 各1 μL 上下游引物(10 μmol/L)和10.5 μL ddH2O， 程序?yàn)?5 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s和55 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)，并按照2－ΔΔCT的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[15]。利用GraphPad Prism 8 軟件的Holm－Sidak 方法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)，以比較基因在品種間和時(shí)期間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

通過(guò)全基因組基因家族成員挖掘，去掉結(jié)構(gòu)和功能冗余的2 個(gè)候選序列，共獲得了27 個(gè)expansin基因候選序列。 在Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域注釋，發(fā)現(xiàn)24 個(gè)具有家族保守結(jié)構(gòu)域的DPBB＿1 和Pollen＿allerg＿1，3 個(gè)缺失第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的候選序列。 對(duì)此24 個(gè)具有完整結(jié)構(gòu)域基因的命名沿用苧麻基因組蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。

比較和分析24 個(gè)苧麻擴(kuò)展蛋白序列的理化性質(zhì)(表1)，氨基酸數(shù)目213aa(Expansin－A23)～589aa(Expansin－B15＿3)，分子量23 253.44 Da(Expansin－A23)～62 928.18 Da(Expansin－B15＿3)，等電點(diǎn)4.78(Expansin－like＿2)～9.96(Expansin－A12＿1)。 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)5 個(gè)蛋白序列沒(méi)有信號(hào)肽，分別為Expansin－A23、Expansin－A12＿2、Expansin－A4＿1、Expansin－B15＿3、Expansin－A12＿1。 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示24 個(gè)苧麻擴(kuò)展蛋白均位于細(xì)胞壁。

表1 苧麻擴(kuò)展蛋白基本理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical characteristics of ramie expansins

續(xù)表1

2.2 基因家族的基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)基序預(yù)測(cè)

苧麻expansin家族成員外顯子數(shù)目為2～9 個(gè)，內(nèi)含子數(shù)目為1～8 個(gè)。 根據(jù)MEME 分析結(jié)果，選擇其中E－value 最低為8.4e－003 的17 個(gè)保守基序作圖(圖1)。 同一進(jìn)化支蛋白的結(jié)構(gòu)域均保守且每個(gè)基因亞族蛋白含特有的保守基序(motif)，α 亞族蛋白特有motif 3，β 亞族特有motif 8，EXPL 支(EXPLA亞族和EXPLB亞族)特有motif 15。

圖1 擴(kuò)展家族蛋白序列保守基序和基因結(jié)構(gòu)與3 個(gè)特有保守基序Fig.1 Protein sequence conserved motifs and gene structure of expansin family and 3 specific motifs

2.3 苧麻expansin 家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在Swiss－Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)下載水稻和擬南芥的expansin家族的蛋白氨基酸序列，分別為36 和56條，與24 條苧麻蛋白氨基酸序列一起構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖2)。expansin家族包括EXPA、EXPB、EXPLA、EXPLB等4 個(gè)亞族，在進(jìn)化樹(shù)中可分為EXPA、EXPB、EXPL 3 大類。 EXPA 類包含苧麻expansin家族的17 個(gè)基因(α 亞族)，EXPB 類包含4 個(gè)基因(β 亞族)，EXPL 類有3 個(gè)基因(1 個(gè)α 類亞族和2個(gè)β 類亞族)。

圖2 苧麻expansin 家族進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Expansin family phylogenetic tree in ramie

2.4 基因家族成員的表達(dá)分析

5 個(gè)發(fā)育時(shí)期的expansin家族基因表達(dá)模式如圖3 所示，9 個(gè)基因在兩個(gè)品種間存在明顯的差異表達(dá)情況，其中BnEXPA16、BnEXP－like－3 和BnEXPA20 僅在品種3－4 的T3、T4 及T5 期上調(diào)表達(dá)，BnEXP－like－1 和BnEXPA7 僅在品種2－25 的T4 期上調(diào)表達(dá)，BnEXPA8－2、BnEXPB3、BnEXPA23 和BnEXPA11 僅在品種2－25 的T2 期上調(diào)表達(dá)。 兩個(gè)苧麻品種5 個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，在T1 和T2 期都上調(diào)表達(dá)的有BnEXPA2－1、BnEXPA2－2、BnEXP－like－2、BnEXPA8－1、BnEXPA12－1、BnEXPA8－2、BnEXPA1、BnEXPA15、BnEXPA4－1、BnEXPA13。 在T3、T4 和T5 期都上調(diào)表達(dá)的有BnEXPB15－1、BnEXPB15－2 和BnEXPB15－3。

圖3 苧麻expansin 家族基因表達(dá)量熱圖Fig.3 Gene expression heatmap of expansin family in ramie

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果和相關(guān)差異表達(dá)基因的功能分析，選擇BnEXP－like－3 和BnEXPB15－2 這兩個(gè)基因做進(jìn)一步分析(特異性引物序列見(jiàn)表2)，熒光定量PCR 結(jié)果(圖4)顯示，5 個(gè)時(shí)期苧麻莖皮中兩個(gè)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著差異(p<0.01)，兩個(gè)基因在品種3－4 表達(dá)量明顯高于2－25 的表達(dá)量。

表2 expansin 家族基因特異qRT－PCR 引物(5’→3’)Table 2 Expansin family genes specific qRT－PCR primers (5’→3’)

圖4 BnEXP－like－3(左)和BnEXPB15－2(右)在兩個(gè)苧麻品種莖皮5 個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Expression level of BnEXP－like－3(left) and BnEXPB15－2(right) of stem bark at five growth stages of 2 varieties

3 討論與結(jié)論

苧麻中鑒定出的4 種擴(kuò)展蛋白亞族的蛋白，包括α 亞族17 個(gè)、β 亞族4 個(gè)、α 類亞族1 個(gè)和β類亞族2 個(gè)。 蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析表明，可依據(jù)其特有的保守基序區(qū)分不同亞族的擴(kuò)展蛋白，苧麻expansin家族α 亞族蛋白特有motif 3，β 亞族特有motif 8， α 類亞族和β 類亞族共特有motif 15。 表達(dá)分析結(jié)果顯示，expansin家族成員在不同品種和時(shí)期存在表達(dá)差異，且BnEXP－like－3 與BnEXPB15－2 兩個(gè)基因在品種3－4 中各個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量均高于2－25。 目前被報(bào)道與纖維發(fā)育相關(guān)的擴(kuò)展蛋白基本屬于如EXP1、EXPA2、EXPA8 等所在的成員數(shù)量占有優(yōu)勢(shì)的α 亞族[3－4，6－7]，而鮮有α 類亞族和β 亞族的成員。 另外，有研究發(fā)現(xiàn)，苧麻纖維細(xì)度還受光照、濕度、溫度等生態(tài)環(huán)境因素的影響[16]。 本研究首次發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)在纖維細(xì)度不同的兩個(gè)品種間呈表達(dá)差異的BnEXP－like－3 與BnEXPB15－2，其所在亞族的蛋白被報(bào)道與植物抗逆性相關(guān)，如啟動(dòng)子序列存在脫落酸、生長(zhǎng)素、水楊酸等激素誘導(dǎo)元件和對(duì)干旱、高溫等非生物脅迫的響應(yīng)元件的OfEXLA1[17]，及被證實(shí)由磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)且能夠提高大豆磷效率的GmEXPB2[18]。 因此，BnEXP－like－3和BnEXPB15－2 是否具有通過(guò)對(duì)苧麻生長(zhǎng)環(huán)境響應(yīng)而影響纖維細(xì)度的功能值得深入探討。

棉花中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)擴(kuò)展蛋白基因，GbEXPA2 通過(guò)增加結(jié)晶纖維素含量影響纖維細(xì)胞厚度，GbEXPATR是編碼一個(gè)缺失Pollen＿allerg＿1 結(jié)構(gòu)域的蛋白基因，同屬于擴(kuò)展蛋白α 亞族，過(guò)表達(dá)GbEXPATR纖維會(huì)產(chǎn)生更長(zhǎng)、更結(jié)實(shí)的薄壁纖維[7]。 在本研究中也發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)缺失第二結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中兩個(gè)有信號(hào)肽，但與擴(kuò)展蛋白家族各個(gè)亞族的蛋白相似性不高，其功能有待進(jìn)一步研究。