柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚營(yíng)養(yǎng)代謝的影響

魏奇，黎鑫，楊菲，周逢芳，黃偉卿，陳美霞，劉偉,3

（1.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建省科技廳產(chǎn)學(xué)研合作示范基地，福建 寧德 352100；4.閩東水產(chǎn)品精深加工福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100）

大黃魚（Larimichthys crocea）又名黃瓜魚，兩側(cè)和腹側(cè)呈金黃色，肉質(zhì)鮮嫩且富含蛋白質(zhì)，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1,2]。目前，大黃魚多以集約化網(wǎng)箱養(yǎng)殖為主。網(wǎng)箱養(yǎng)殖的大黃魚活動(dòng)空間受限，養(yǎng)殖密度大，活動(dòng)量少，飼料中脂肪含量過高，人工養(yǎng)殖的大黃魚魚肉品質(zhì)降低于野生大黃魚[3]。已有研究表明，改變養(yǎng)殖模式或在飼料中添加天然植物提取物能提高水生動(dòng)物的存活率，改善其肌肉品質(zhì)[4,5]。鄧超準(zhǔn)等[6]研究表明，在飼料中加入原花青素能夠促進(jìn)星洲紅魚（Singapore red tilapia,O.mossambicus）的生長(zhǎng)。天然植物提取物具有綠色、安全和效果穩(wěn)定等特點(diǎn)，作為飼料添加劑能夠提高水生動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，天然植物提取物作為飼料添加劑受到了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的廣泛關(guān)注[7,8]。

柳葉蠟梅（Chimonanthus salicifolius）是畬族民間常用的藥用和保健兩用植物，其主要活性成分為揮發(fā)油、香豆素和黃酮等。已有研究表明，柳葉蠟梅具有止瀉，清熱解毒，抗氧化，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)肝臟等多種藥理作用[9-12]。柳葉蠟梅的鮮葉可以加工成風(fēng)味茶，用于沖泡飲用。目前，關(guān)于柳葉蠟梅作為大黃魚的飼料添加劑的研究較少。鄒永等[13]研究表明，在大黃魚的飼料中加入柳葉蠟梅醇提物可以有效改善大黃魚的肌肉品質(zhì)，促進(jìn)大黃魚對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。然而，關(guān)于柳葉蠟梅對(duì)大黃魚營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和糖脂代謝的研究較少。本研究通過給大黃魚投喂含有0%、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%柳葉蠟梅醇提物的飼料，以探究柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚消化酶和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝酶活性的影響，并為大黃魚的科學(xué)養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

柳葉蠟梅由福瑞泰生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。試驗(yàn)魚購(gòu)買于寧德市鼎誠(chéng)水產(chǎn)有限公司。

試劑：4%多聚甲醛，生工生物工程（上海）股份有限公司；伊紅染液、蘇木素，北京索萊寶科技有限公司；戊二醛、中性樹膠，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。胃蛋白酶測(cè)定試劑盒、總蛋白定量測(cè)定試劑盒、丙二醛（MAD）測(cè)定試劑盒、蘋果酸脫氫酶（ME）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、己糖激酶（HK）測(cè)定試劑盒、丙酮酸激酶（PK）測(cè)定試劑盒、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1試劑盒（CPT-1）、激素敏感脂肪酶試劑盒（HSL）、脂肪酸合成酶試劑盒（FAS）、α 淀粉酶測(cè)試盒和脂肪酶（LPS）測(cè)定試劑盒，南京建成科技有限公司。

儀器與設(shè)備：BSA224S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DK-98-II 電子恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；3-16KL 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；HistoCore Biocut R 切片機(jī)、M199 切片刀，德國(guó)徠卡公司；BA210T 顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；Varioskan LUX 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 柳葉蠟梅提取物的制備

柳葉蠟梅葉片置于65 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥10 h。采用中藥粉碎機(jī)粉碎干燥的柳葉蠟梅葉片（0.15 mm）。稱取1 kg 柳葉蠟梅粉末，以料液比1∶30 的比例加入85%的乙醇，于70 ℃條件下進(jìn)行熱回流提取3 h。濾液經(jīng)45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥，即得柳葉蠟梅醇提取物。

1.2.2 飼料的制備

基礎(chǔ)飼料為“海馬”牌大黃魚人工配合飼料，含粗脂肪6%，粗蛋白45%，粗灰分14%，粗纖維5%，氯化鈉0.5%～3%，賴氨酸2.8%，鈣1%～3%，總磷1%，水分10%。將基礎(chǔ)飼料粉碎后加入柳葉蠟梅醇提物（0%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%），拌勻后過60 目篩，用飼料制粒機(jī)加工成試驗(yàn)飼料（3 mm），干燥避光保存。

1.2.3 分組及飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)于寧德師范學(xué)院國(guó)家海洋局海西海洋生物種質(zhì)資源及生物制品開放利用公共服務(wù)平臺(tái)養(yǎng)殖基地進(jìn)行。養(yǎng)殖池長(zhǎng)（4 m）×寬（2 m）×高（2.5 m）。健康大黃魚在水體溶氧5 mg·L-1以上、水溫15 ℃～25 ℃、鹽度24.2～27.7 和pH7.92～8.23 的條件下適應(yīng)性養(yǎng)殖兩周。健康大黃魚的平均體質(zhì)量為（10.31±2.88）g，平均體長(zhǎng)為（10.21±0.81）cm。將500 尾大黃魚隨機(jī)分為5 組，每組100 尾，按大黃魚體質(zhì)量的2%～3%投喂飼料，養(yǎng)殖8 周。飼料中柳葉蠟梅醇提物的添加量分別為0%（對(duì)照組，L-0）、0.5%（L-0.5）、1%（L-1）、2%（L-2）和4%（L-4）。

1.2.4 采樣與測(cè)定

8 周后，大黃魚經(jīng)停食處理24 h。每組隨機(jī)選取10 尾大黃魚，冰盤解剖取大黃魚肝臟、胃、腸道和右側(cè)背部肌肉組織，備用。

消化道中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)酶活測(cè)定：稱取大黃魚胃和腸道樣品100 mg，加入0.9 mL 磷酸緩沖鹽溶液，勻漿和離心處理后，取上清液備用。根據(jù)試劑盒說明書測(cè)定樣品的總蛋白濃度、α 淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性。

營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)酶活及抗氧化指標(biāo)測(cè)定：大黃魚肝臟中丙酮酸激酶（PK）、己糖激酶（HK）、乳酸脫氫酶（LDH）、蘋果酸脫氫酶（ME）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）、脂蛋白脂酶（LPL）、脂肪酸合成酶（FAS）、激素敏感脂肪酶（HSL）、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、總超氧化物歧化酶（SOD）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）和丙二醛（MDA）等指標(biāo)采用南京建成生物工程研究所試劑盒的方法測(cè)定。大黃魚肌肉組織中測(cè)定TG、TC、HDL-C、LDL-C、MDA和SOD。

肌肉微觀結(jié)構(gòu)觀察：取大黃魚背肌樣品（1 mm3），置于戊二醛中固定，然后經(jīng)生理鹽水清洗后，經(jīng)固定、脫水、滲透、包埋、切片和染色處理。采用透射電鏡觀察大黃魚肌肉的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，取其平均值。應(yīng)用SPSS 23 進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著用Duncan’s 多重比較進(jìn)行，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚消化酶的影響

柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚肝臟和消化道中消化酶活性的影響如表1 所示。由表1 可知，L-4 組中大黃魚肝臟、腸道和胃中的α 淀粉酶的活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；肝臟和腸道中的脂肪酶活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；肝和胃中的蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。4%的柳葉蠟梅醇提物能有效提高大黃魚肝臟和消化道內(nèi)的α 淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性，促進(jìn)大黃魚對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。

表1 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚消化酶的影響Tab.1 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on activities of the digestive enzymes of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

2.2 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚糖代謝的影響

柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚糖代謝的影響見表2。由表2 可知，對(duì)照組和試驗(yàn)組中柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚肝臟組織中G6PDH、LDH、ME 和PK 的活性影響顯著（P＜0.05）。L-4 組大黃魚肝中LDH 和PK 的活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。L-4 組的G6PDH 和ME 的活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。L-1 組、L-2 組和L-4 組大黃魚肝臟組織中的HK活性與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚TG、TC、HDL-C和LDL-C 的影響

柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚肝臟和肌肉中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 的影響如表3 所示。柳葉蠟梅醇提物能降低大黃魚肝臟和肌肉中的TG、TC 和LDL-C 含量；且HDL-C 含量高于對(duì)照組。試驗(yàn)組L-1、L-2 和L-4 中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 的含量沒有顯著性差異（P＞0.05）。由此可知，添加4%柳葉蠟梅醇提物能夠降低大黃魚肝臟和肌肉中TG 和TC 的含量，改善大黃魚體內(nèi)脂質(zhì)堆積。

表3 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚TG、TC、HDL-C 和LDL-C 的影響Tab.3 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on the values of TG,TG,HDL-C,and LDL-C of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

2.4 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚脂質(zhì)代謝酶的影響

柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚脂質(zhì)代謝酶活性的影響見表4。柳葉蠟梅醇提物能調(diào)控大黃魚肝臟組織中脂質(zhì)代謝酶（FAS、CPT-1、HSL 和LPL）的活性。L-4 組大黃魚肝臟組織中FAS 的活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；L-0.5 組、L-1 組和L-2 組中的FAS酶活性差異不顯著（P＞0.05）。L-4 組的CPT-1、HSL和LPL 酶的活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。由此可知，4%柳葉蠟梅醇提物作為飼料添加劑能有效促進(jìn)大黃魚體內(nèi)脂肪分解，抑制脂肪合成，降低大黃魚體內(nèi)脂肪的含量。

表4 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚肝臟中脂質(zhì)代謝酶活性的影響Tab.4 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on activities of lipid metabolism enzymes in liver of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

2.5 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚抗氧化活性的影響

柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚體內(nèi)抗氧化活性的影響見表5。L-4 組大黃魚肝臟中SOD 酶的活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而MDA 含量則顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。L-0.5 組、L-1 組和L-2 組肌肉中SOD 的活性高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。L-0.5 組、L-1 組和L-2 組肌肉中MDA 的含量低于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。由此可知，柳葉蠟梅醇提物作為大黃魚飼料添加劑能夠提高大黃魚肝臟中SOD 酶的活性，降低大黃魚肝臟中MDA 的含量，提高大黃魚肝臟的抗氧化能力。

表5 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚抗氧化活性的影響Tab.5 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on antioxidant activity of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

2.6 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚肌纖維超微結(jié)構(gòu)的影響

柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚肌纖維超微結(jié)構(gòu)的影響見表6 和圖1。觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大黃魚肌肉縱切面的肌節(jié)長(zhǎng)度小于L-1 組、L-2 組和L-4 組（P＜0.05）。由圖1 可知，對(duì)照組的肌纖維紋理較不清晰，排列不整齊。L-2 組和L-4 組的肌節(jié)長(zhǎng)度和明帶長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組L-4 的肌纖維排列整齊，明帶暗帶紋理更加清晰。

圖1 大黃魚肌肉透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscope in muscle tissues of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

表6 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚肌肉超微結(jié)構(gòu)的影響Tab.6 Effects of Chimonanthus salicifolius extract on ultrastructure of large yellow croaker（Larimichthys crocea）

3 討論

3.1 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚消化道中消化酶的影響

天然植物提取物能有效促進(jìn)魚類生長(zhǎng)、提高存活率和改善魚肉品質(zhì)，能維持和改善水域的生態(tài)平衡，已被廣泛用于水生動(dòng)物養(yǎng)殖研究。在飼料中添加天然植物提取物能夠有效促進(jìn)大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）[14]、小龍蝦（Procambarus clarkii）[15]、大黃魚[16]和鯉（Cyprinus carpio）[17]等水生動(dòng)物的生長(zhǎng)，增強(qiáng)其抗病能力。腸道是水生動(dòng)物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所。鄧超準(zhǔn)[6]研究發(fā)現(xiàn)，將原花青素添加到星洲紅魚飼料中能夠有效提高星洲紅魚腸和胃中的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力。劉淑蘭等[18]研究發(fā)現(xiàn)，槐屬植物黃酮添加到飼料中，能夠提高羅非魚（Oreochromis niloticus）胃部和腸道中消化酶活性。該研究結(jié)果與本研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，4%的柳葉蠟梅醇提物作為大黃魚的飼料添加劑能夠提高大黃魚肝臟、腸道、胃部中α 淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性，促進(jìn)大黃魚對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。由此可知，柳葉蠟梅醇提物作為大黃魚飼料添加劑對(duì)大黃魚消化道消化酶的分泌具有促進(jìn)作用。

3.2 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚糖代謝的影響

肝臟是大黃魚糖代謝的重要器官，主要通過糖酵解和糖異生的作用調(diào)控血糖含量。糖酵解反應(yīng)能分解魚體葡萄糖，為機(jī)體提供能量。PK 和HK 含量越高，糖酵解為魚體提供的能量越多。G-6-PDH 使6 磷酸葡萄糖脫氫產(chǎn)生NADPH，ME 能分解蘋果酸，產(chǎn)生NADPH。NADPH 是FAS 的主要能量來源，G-6-PDH 和ME 的減少會(huì)導(dǎo)致NADPH 含量減少，減少脂肪的合成效率[19,20]。本研究結(jié)果表明，在大黃魚飼料中添加4%的柳葉蠟梅醇提物，能夠顯著提高大黃魚肝臟組織中PK 和LHD 酶的活性（P＜0.05），顯著降低G-6PDH 和ME 酶的活性（P＜0.05）。由此可知，柳葉蠟梅醇提物能夠提高大黃魚的體內(nèi)糖酵解水平，為大黃魚活動(dòng)提供更多的能量，降低NADPH 的產(chǎn)生，降低脂肪在大黃魚體內(nèi)的合成和堆積。

3.3 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚脂質(zhì)代謝的影響

TG、TC、LDL-C 和HDL-C 能夠反映機(jī)體脂質(zhì)代謝的情況[21]。TG 和TC 含量過高，可導(dǎo)致血液黏稠，使脂質(zhì)在血管壁上沉積，危害機(jī)體。HDL-C 能將血液中的膽固醇運(yùn)輸?shù)礁闻K分解成膽酸鹽，降低膽固醇含量。LDL-C 通過將肝臟中的膽固醇運(yùn)輸?shù)窖海岣哐乃?，阻礙物質(zhì)在血液中的運(yùn)輸效率。已有大量的研究表明，植物提取物作為飼料添加劑能夠降低水生動(dòng)物體內(nèi)脂肪堆積。Zhai 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，將槲皮素制備成羅非魚飼料，能減低羅非魚體內(nèi)TG 和LDL-C 含量，提高HDL-C 含量。茍庚午等[23]研究發(fā)現(xiàn)，將飛薊素添加到飼料中能夠有效調(diào)節(jié)羅非魚的脂質(zhì)代謝，顯著提高羅非魚肝臟中LPL 和總脂肪酶的活性（P＜0.05）。由此可知，飼料中添加飛薊素能夠有效減少羅非魚肝臟中的脂質(zhì)沉積，提高羅非魚脂質(zhì)的利用率[23]。以上的研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，以4%的柳葉蠟梅醇提物作為大黃魚的飼料添加劑能夠顯著提高大黃魚脂肪分解酶（HSL、CPT-1 和LPL）的活性和HDL-C 含量，顯著降低ME、G-6-PDH、FAS 和MDA 酶的活性和TG、TC、LDL-C 含量。由此可推斷，柳葉蠟梅醇提物能降低大黃魚G-6-PDH 和ME酶活性和NADPH 含量，導(dǎo)致脂肪的合成效率下降，促進(jìn)大黃魚體內(nèi)脂肪的分解。LPL 活性的增加還能提高大黃魚脂肪的利用率。LDH 含量的增加，表明大黃魚的無氧代謝水平也有所提高。由此可知，柳葉蠟梅通過改善脂質(zhì)代謝水平和增加脂肪的利用率來降低體內(nèi)脂質(zhì)的含量。

3.4 柳葉蠟梅醇提物對(duì)大黃魚抗氧化活性的影響

SOD 能夠有效抑制機(jī)體氧化作用，對(duì)體內(nèi)超氧化物的自由基具有清除作用[24]。MDA 是評(píng)判脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)[25]。本研究用SOD 和MDA 評(píng)估柳葉蠟梅醇提物提高大黃魚體內(nèi)抗氧化的能力。本研究結(jié)果顯示，4%的柳葉蠟梅醇提物作為大黃魚的飼料添加劑能顯著提高大黃魚肝臟組織中的SOD 活性，降低其MDA 含量（P＜0.05），由此可知，柳葉蠟梅醇提物能夠增強(qiáng)大黃魚體內(nèi)的抗氧化作用?？寡趸钚缘奶岣咭查g接改善了大黃魚肝臟的健康狀況和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝過程。

綜上所述，柳葉蠟梅醇提物能夠改善大黃魚腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收作用，改善大黃魚糖代謝和脂質(zhì)代謝。因此，柳葉蠟梅醇提物作為飼料添加劑能夠?yàn)榫G色、新型的大黃魚飼料的開發(fā)提供新的思路。