不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄以及近緣種指紋圖譜的建立及有效成分分析

凌偉紅，陳 燕，馮 淼，王超純，龔慧敏，田春蓮, , 4*

不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄以及近緣種指紋圖譜的建立及有效成分分析

凌偉紅1，陳 燕2，馮 淼1，王超純1，龔慧敏3，田春蓮1, 3, 4*

1. 吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000 2. 張家界市永定區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 張家界 427000 3. 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000 4. 杜仲綜合利用技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000

建立顯齒蛇葡萄以及近緣種的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并對(duì)有效成分進(jìn)行定量分析。使用Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸，檢測(cè)波長(zhǎng)為280、360 nm，體積流量為1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃下梯度洗脫，建立顯齒蛇葡萄以及近緣種HPLC指紋圖譜，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、層次聚類分析（clustering analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）與正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares method-discriminant analysis，OPLS-DA）等化學(xué)模式識(shí)別方法，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄及近緣種的質(zhì)量。建立的HPLC指紋圖譜方法符合方法學(xué)要求，18批顯齒蛇葡萄屬樣品指紋圖譜有31個(gè)共有峰，經(jīng)對(duì)照品定性指認(rèn)4、9、11、14、15和24號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物分別為沒(méi)食子酸、兒茶素、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷和楊梅素，且相似度＞0.8；所有樣品按產(chǎn)地經(jīng)CA分為2類，PCA結(jié)果與其一致；OPLS-DA篩選出不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄及近緣種的13～14個(gè)差異標(biāo)志物，以二氫楊梅素和楊梅素為主要差異標(biāo)志物。建立的指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別可用于作為藤茶原料的蛇葡萄屬植物的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

藤茶；顯齒蛇葡萄；HPLC指紋圖譜；化學(xué)模式識(shí)別；正交偏最小二乘法-判別分析；沒(méi)食子酸；兒茶素；二氫楊梅素；蘆??；楊梅苷；楊梅素

藤茶是由葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄屬L. 植物的嫩莖葉加工而成，又稱莓茶、甜茶藤、龍須茶和甘露茶[1]。藤茶是我國(guó)南方地方習(xí)用類茶，常用于治療口腔潰瘍、咽喉腫痛、感冒發(fā)熱、濕熱黃疸、目赤腫痛和癰腫瘡癤等癥狀[2]。藤茶的化學(xué)成分、保健屬性和功能特性已受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，有望成為預(yù)防與高脂肪飲食有關(guān)的代謝性疾病的輔助飲食[3-4]。顯齒蛇葡萄(Hand.-Mazz.) W. T. Wang為主要藤茶加工原料，富含黃酮類、甾體類、萜類、多酚等有效成分，其中黃酮類成分抗病毒、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等功效顯著[5]。顯齒蛇葡萄分布區(qū)域廣，主產(chǎn)于湖南、湖北、廣東、廣西、云南等地[6]，產(chǎn)地環(huán)境及生長(zhǎng)條件造成有效成分差異較大。目前，地方標(biāo)準(zhǔn)僅以二氫楊梅素含量作為質(zhì)量控制的考察指標(biāo)，無(wú)法完整反映顯齒蛇葡萄內(nèi)在品質(zhì)和產(chǎn)地質(zhì)量差異，限制了顯齒蛇葡萄葉作為新資源食品的應(yīng)用。因此，建立一種整體、全面的藤茶植物質(zhì)量控制方法尤為重要。

化學(xué)識(shí)別模式結(jié)合指紋圖譜可將指紋圖譜中的有效信息提取，以獲得完整的質(zhì)量信息，在中藥材鑒別的作用日益凸顯[7-8]。目前，藤茶HPLC指紋圖譜研究多為方法學(xué)考察，應(yīng)用聚類分析（clustering analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)顯齒蛇葡萄分類描述[4, 9-12]，吳佳等[13]首次采用CA、PCA結(jié)合正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares method - discriminant analysis，OPLS-DA）篩選其普葉和龍須的7個(gè)差異性成分。藤茶原料植物為顯齒蛇葡萄，但同屬植物廣東蛇葡萄與羽葉蛇葡萄也為加工原料[14]，導(dǎo)致藤茶產(chǎn)品同名異物。因此，為有效甄別藤茶及其易混品，從材料源頭控制藤茶品質(zhì)，本研究采用HPLC雙波長(zhǎng)切換法，建立藤茶植物定量指紋圖譜，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、CA、PCA、OPLS-DA等化學(xué)識(shí)別模式，鑒別各地用于加工藤茶的3種蛇葡萄屬植物并篩選差異標(biāo)志物，以期為藤茶質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)制訂提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；FA1004型萬(wàn)分之一電子天平（上海舜宇恒平儀器有限公司）；EX125DZH型奧豪十萬(wàn)分之一電子天平（上海析平科學(xué)儀器有限公司）；DSA300-GL1型超聲波清洗儀（福州德森精工有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品兒茶素（批號(hào)200829）、蘆丁（批號(hào)RP190213）購(gòu)自成都麥德省科技有限公司；沒(méi)食子酸（批號(hào)202011-201215）、楊梅苷（批號(hào)202012-201218）購(gòu)自中原植提標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)耗材中心；二氫楊梅素（批號(hào)20190610）購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所；楊梅素（批號(hào)L1623059）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%。乙腈為色譜純，磷酸等其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 樣品

20批次樣品于2021年5月下旬～6月初采自湖南、湖北、廣西、云南4省18個(gè)產(chǎn)地（表1），經(jīng)吉首大學(xué)廖儒博研究員鑒定S1～S18為顯齒蛇葡萄(Hand. -Mazz.) W. T. Wang，S19為羽葉蛇葡萄(Lévl. et Vant.) Rehd.，S20為廣東蛇葡萄(Hook. et Arn.)Planch的4年生植物。取長(zhǎng)5～7 cm的嫩莖葉50 ℃烘干，分別粉碎，過(guò)40目篩備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取二氫楊梅素、楊梅素、楊梅苷、沒(méi)食子酸、兒茶素、蘆丁適量置入5 mL量瓶中，加入60%的甲醇溶解并定容，搖勻，得140 μg/mL沒(méi)食子酸、10 406 μg/mL二氫楊梅素、2034 μg/mL楊梅苷 162 μg/mL楊梅素、78 μg/mL兒茶素、126 μg/mL蘆丁的照品溶液，按一定梯度稀釋，得不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

表1 樣品及來(lái)源信息

Table 1 Samples and source information

編號(hào)產(chǎn)地品種編號(hào)產(chǎn)地品種 S1湖南永定三家館顯齒蛇葡萄S11湖南雙牌上梧江顯齒蛇葡萄 S2湖南永定溫塘顯齒蛇葡萄S12湖南桂東四都顯齒蛇葡萄 S3湖南永定王家坪顯齒蛇葡萄S13湖北來(lái)鳳綠水顯齒蛇葡萄 S4湖南永定沅古坪顯齒蛇葡萄S14湖北來(lái)鳳舊司顯齒蛇葡萄 S5湖南永定茅巖河顯齒蛇葡萄S15湖北來(lái)鳳芭蕉溪顯齒蛇葡萄 S6湖南永定羅塔坪顯齒蛇葡萄S16湖北來(lái)鳳牛耳坪顯齒蛇葡萄 S7湖南永定教字埡顯齒蛇葡萄S17云南廣南者兔顯齒蛇葡萄 S8湖南桑植橋自灣顯齒蛇葡萄S18廣西西林古障顯齒蛇葡萄 S9湖南永順潤(rùn)雅顯齒蛇葡萄S19湖北來(lái)鳳舊司羽葉蛇葡萄 S10湖南雙牌孝層場(chǎng)顯齒蛇葡萄S20湖北來(lái)鳳舊司廣東蛇葡萄

2.2 供試品溶液的制備

分別稱取0.1 g樣品于圓底燒瓶，加入10 mL 60%甲醇溶液后稱定質(zhì)量，超聲45 min，冷卻至室溫，再次稱量，加60%甲醇溶液適量補(bǔ)足質(zhì)量，過(guò)0.45 μm濾膜，4 ℃保存，供試品溶液備用[11]。

2.3 色譜條件

采用Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為0.01%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，5%～15% A；8～18 min，15%～24% A；18～25 min，24%～40% A；25～35 min，40%～50% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～15 min，280 nm；15～35 min，360 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 將含沒(méi)食子酸、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素、兒茶素、蘆丁的對(duì)照品溶液梯度稀釋，得不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，分別按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，將對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度與峰面積線性回歸，得回歸方程（表2），6種成分的相關(guān)系數(shù)（2）均大于0.999，各成分在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系數(shù)據(jù)

Table 2 Linear relationship data

對(duì)照品回歸方程線性范圍/(μg·mL?1)R2 沒(méi)食子酸Y＝40.196 X－41.2541.40～140.000.999 5 二氫楊梅素Y＝2.041 2 X－56.867104.06～10 406.000.999 9 楊梅苷Y＝19.843 X＋371.9720.34～2 034.000.999 6 楊梅素Y＝33.787 X＋142.8616.20～162.000.999 4 兒茶素Y＝4.740 8 X－1.009 77.80～78.000.999 7 蘆丁Y＝28.98 X－20.2251.26～126.000.999 8

2.4.2 精密度試驗(yàn) 稱取S2樣品0.1 g，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各共有峰的保留時(shí)間及峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果保留時(shí)間的RSD為0.53%～1.42%，峰面積的RSD為0.78%～1.92%，儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S2樣品0.1 g，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各共有峰的保留時(shí)間及峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.89%～1.73%，相對(duì)峰面積RSD為0.61%～1.62%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一份S2樣品0.1 g，共6份，按“2.2”項(xiàng)方法制備成6份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄各共有峰的保留時(shí)間及峰面積。得出保留時(shí)間RSD為0.829%～1.26%，相對(duì)峰面積的RSD為2.24%～4.41%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取5份S2樣品0.1 g，按“2.2”項(xiàng)方法制備樣品液，取500 μL樣品溶液按比例（1∶1）加入相應(yīng)的對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)方法測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算各成分的加樣回收率及RSD。沒(méi)食子酸、兒茶素、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、楊梅素的加樣回收率結(jié)果分別為104.22%、102.73%、101.73%、96.48%、101.25%、98.76%，RSD分別為2.5%、0.6%、2.3%、1.0%、0.5%、1.5%，表明本方法的加樣回收率良好。

2.5 指紋圖譜的建立和相似度評(píng)價(jià)

取20批樣品供試液20 μL按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。將S1～S18的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版），以S1圖譜為參照匹配共有峰，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.2 min，生成疊加圖譜，采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜[15]。再將對(duì)照、S19、S20的圖譜導(dǎo)入，并評(píng)價(jià)相似度。圖1和圖2分別為對(duì)照指紋圖譜及HPLC指紋圖譜，標(biāo)定出31個(gè)共有峰，通過(guò)與混合對(duì)照品出峰時(shí)間相匹配，確認(rèn)峰4為沒(méi)食子酸、峰9為兒茶素、峰11為二氫楊梅素、峰14為蘆丁、峰15為楊梅苷、峰24為楊梅素。峰11保留時(shí)間（16.161 min）居中、峰面積大且分離度良好，作為參照峰計(jì)算出樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.86%，說(shuō)明樣品共有峰出峰時(shí)間穩(wěn)定；但共有峰相對(duì)峰面積RSD為21.47%～117.93%，相差較大，表明S1～S20共有化合物的含量差異較大。樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度（表3）分別為S1～S16（0.943～0.998），S17、S18（0.869、0.868），S19、S20（0.319、0.389），表明湖南和湖北產(chǎn)顯齒蛇葡萄化學(xué)成分種類相似度極高，而廣西、云南產(chǎn)顯齒蛇葡萄與前2個(gè)產(chǎn)地有差異，不同種蛇葡萄屬植物化學(xué)成分種類差異大。

4-沒(méi)食子酸 9-兒茶素 11-二氫楊梅素 14-蘆丁 15-楊梅苷 24-楊梅素

圖2 20批次樣品HPLC指紋圖譜疊加圖

表3 20批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度結(jié)果

Table 3 Similarity results of fingerprints of 20 batches of raw material plants and reference atlas samples

編號(hào)相似度編號(hào)相似度編號(hào)相似度編號(hào)相似度 S10.996S60.970S110.993S160.994 S20.966S70.943S120.984S170.869 S30.998S80.987S130.995S180.868 S40.986S90.994S140.992S190.319 S50.995 S100.975S150.993S200.389

2.6 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.6.1 聚類分析（cluster analysis analysis，CA）以地域及種類將樣品分組，然后以31個(gè)共有峰相對(duì)峰面積為變量，運(yùn)用微生信在線繪圖（http://www.bioinformatics.com.cn），采用組間均聯(lián)法，選擇平方Euclideam距離為測(cè)度進(jìn)行系統(tǒng)聚類，繪制聚類熱圖[16]。熱圖顏色代表歸一化后的值，顏色越紅說(shuō)明共有峰相對(duì)峰面積越大，顏色越藍(lán)表示共有峰相對(duì)峰面積越小。如圖3所示，除S18外，其他樣品被分為2類，S20、S19、S7、S12、S9、S6聚為第I類，其他聚為第II類，每類又分2小類，第Ⅰ類S19、S20單獨(dú)聚成1小類，顯示顯齒蛇葡萄與廣東蛇葡萄、羽葉蛇葡萄差異較大，第Ⅱ類中S13、S14、S16聚為1小類，說(shuō)明湖北產(chǎn)顯齒蛇葡萄與其他產(chǎn)地不同。同時(shí)，熱圖顯示廣西顯齒蛇葡萄未知峰17、6、26、23的相對(duì)峰面積比其他樣品高，S19、S20的15號(hào)峰楊梅苷相對(duì)峰面積高于S1～S18，S20未知峰1、2、21相對(duì)峰面積高于S1～S18。聚類分析表明，不同產(chǎn)地來(lái)源的顯齒蛇葡萄質(zhì)量與地理差異存在一定相關(guān)性，不同種的蛇葡萄屬植物化學(xué)成分差異較大。

圖3 不同顯齒蛇葡萄樣品聚類熱圖

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）采用SPSS 22.0系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化處理31個(gè)共有峰峰面積，對(duì)S1～S20指紋圖譜所得的6個(gè)共有峰PCA，見(jiàn)表4，以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，提取8個(gè)主成分（1～8），累積方差貢獻(xiàn)率90.41%（＞80%），可代表所有樣品指紋圖譜共有峰的絕大多數(shù)信息。主成分載荷矩陣反映了各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小及方向，載荷值越大，對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大[17]，由圖4可知，峰29、18、20、25對(duì)主成分1貢獻(xiàn)較大，峰11、13、23、24對(duì)主成分2貢獻(xiàn)較大，除峰23對(duì)第2主成分呈負(fù)相關(guān)外，其他均呈正相關(guān)。依各主成分貢獻(xiàn)率，按公式計(jì)算綜合得分值（F）。

表4 特征值和方差貢獻(xiàn)率

Table 4 Characteristic value and variance contribution rate

主成分特征值方差比/%累積貢獻(xiàn)率/% 111.305 9636.4736.47 2 5.102 7216.4652.93 3 3.103 2410.0162.94 4 2.911 98 9.3972.34 5 2.185 28 7.0579.38 6 1.446 59 4.6784.05 7 1.063 90 3.4387.48 8 1.005 05 3.2490.41

圖4 公共因子得分和載荷散點(diǎn)圖

F＝0.364 7 F1＋0.164 6 F2＋0.100 1 F3＋0.093 9 F4＋0.070 5 F5＋0.046 7 F6＋0.034 3 F7＋0.032 4 F8

由表5所知，綜合排名前3為S13、S16、S18，最小是S19。PCA與聚類分析結(jié)果基本一致。

2.6.3 正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）以指紋圖譜31個(gè)共有峰為變量系數(shù)，參照文獻(xiàn)方法[14]將31個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMAC 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA，并繪制散點(diǎn)得分圖（圖5）。S13～S16分布在中線右側(cè)，S19、S20在圖的左下角，其結(jié)果與PCA結(jié)果一致。為尋找藤茶植物的差異標(biāo)志物，結(jié)合OPLS-DA模型中變量重要性投影值（variable importance forthe projection，VIP值）分析，以VIP＞1.0為閾值，從不同地域顯齒蛇葡萄篩選出14個(gè)差異標(biāo)志物（圖6-A），影響程度為峰7＞峰28＞峰24（楊梅素）＞峰26＞峰17＞峰29＞峰9（兒茶素）＞峰11（二氫楊梅素）＞峰31＞峰13＞峰22＞峰5＞峰16＞峰23。圖6-B顯示近緣植物羽葉蛇葡萄、廣東蛇葡萄、顯齒蛇葡萄有13個(gè)差異標(biāo)志物，影響程度為峰18＞峰17＞峰29＞峰1＞峰13＞峰31＞峰11（二氫楊梅素）＞峰10＞峰27＞峰24（楊梅素）＞峰5＞峰6＞峰28。差異標(biāo)志物數(shù)量見(jiàn)表6，顯齒蛇葡萄12～17個(gè)，3種蛇葡萄屬植物11～13個(gè)，為進(jìn)一步確認(rèn)差異標(biāo)志物，通過(guò)計(jì)算各共有峰峰面積占總共有峰峰面積的占比以及各共有峰峰面積的RSD值，可知楊梅素（峰24）與二氫楊梅素（峰11）占共有峰峰面積比率大且RSD值偏高，說(shuō)明二氫楊梅素和楊梅素是影響顯齒蛇葡萄產(chǎn)地差異的主要因素，也是區(qū)別其他藤茶原料的主要指標(biāo)。

表5 主成分得分和綜合排名

Table 5 Principal component score and comprehensive score

編號(hào)主成分得分排名 F1F2F3F4F5F6F7F8F S13 1.156 0.952 1.234 2.046?0.275?1.119 0.332?0.957 0.803 1 S16 0.866 0.975 1.063 0.332 0.509?0.023?0.099 1.728 0.701 2 S18 2.370?1.988?0.104?1.155 2.313?0.220 1.104 0.033 0.610 3 S14 0.909 0.955?0.752 0.870?0.056?0.172?0.924?0.326 0.441 4 S15 0.602 0.158 0.790?0.081?0.364 0.254 0.427?0.412 0.304 5 S10 0.706?0.349 0.318 0.534?0.902 0.603?0.867?0.464 0.202 6 S11 0.596?0.187?0.683 0.106?0.100 2.287?1.260?0.556 0.167 7 S7?0.305?0.287 2.459 0.165?0.328?0.050?0.460 0.096 0.065 8 S5?0.008 0.603?0.577 0.015?0.361?0.344 0.284 1.242 0.048 9 S1 0.093 0.587?2.406 0.931 0.955 0.444?0.585 0.045 0.04710 S3 0.199 0.452?1.030 0.177?0.302?0.828 0.005 0.845 0.02811 S12?0.505 0.827 0.861?1.304 0.576 0.387?0.466 1.546 0.00912 對(duì)照 0.030?0.001 0.091?0.329?0.686?0.044?0.095?0.043?0.06613 S4?0.455 0.154?0.132?0.498?0.415 1.479 0.065?0.161?0.16414 S9?1.148 1.545 0.089?0.580 1.809?0.810 0.857?2.609?0.17515 S8 0.111?0.777 0.263?1.311?0.927 0.931 0.663?0.726?0.20716 S2?0.550 0.577?0.851?0.705?0.685?1.006 1.787 1.348?0.24717 S6?1.511 0.587 0.068?1.095?0.142 0.688 0.003?0.450?0.54318 S20?1.696?1.800?0.027 2.449 0.198 0.921 1.995 0.357?0.55119 S17 0.217?1.357?0.862?0.740?2.162?1.914?0.326?0.970?0.58420 S19?1.677?1.626 0.186 0.174 1.345?1.465?2.443 0.432?0.88721

圖5 OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖(A) 和OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖 (B)

圖6 S1～S18樣品（A）和S19～S20、對(duì)照（B）各共有峰的VIP圖

表6 不同樣品的差異標(biāo)志物

Table 6 Differential markers of different samples

樣品差異代謝物共有峰號(hào)總數(shù)/個(gè) 顯齒蛇葡萄（湖南-湖北）27、29、28、4、3、17、31、16、30、5、7、25、18、2014 顯齒蛇葡萄（湖南-云南）24、9、13、1、11、23、3、4、31、14、2、2212 顯齒蛇葡萄（湖南-廣西）26、17、23、27、29、16、7、11、6、20、31、5、10、18、28、24、2517 顯齒蛇葡萄（湖北-云南）24、9、1、3、4、13、2、11、8、14、19、2312 顯齒蛇葡萄（湖北-廣西）26、7、28、23、11、24、9、10、13、17、2、6、14、3014 顯齒蛇葡萄（云南-廣西）26、7、1、6、4、24、13、19、27、8、9、28、2913 顯齒蛇葡萄-羽葉蛇葡萄18、29、13、31、11、27、5、28、22、24、25、15、2013 顯齒蛇葡萄-廣東蛇葡萄13、17、24、28、11、27、6、25、1、16 、18、31、2613 羽葉蛇葡萄-廣東蛇葡萄18、29、1、31、17、10、5、6、2、22、1111

2.7 不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄及近緣種植物中酚類成分的測(cè)定

取20批樣品粉末各適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中6種待測(cè)成分的含量，平行操作3次，結(jié)果見(jiàn)表7。20批樣品中6種成分含量熱圖見(jiàn)圖7。二氫楊梅素和楊梅素在顯齒蛇葡萄含量較高，但楊梅苷含量最低。就各地區(qū)顯齒蛇葡萄上述成分含量差異明顯，原產(chǎn)地張家界羅塔坪樣品中二氫楊梅素含量最高。羽葉蛇葡萄與廣東蛇葡萄中楊梅苷含量明顯高于顯齒蛇葡萄，說(shuō)明楊梅苷可作為廣東蛇葡萄、羽葉蛇葡萄質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)成分。

3 討論

目前，關(guān)于藤茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是以二氫楊梅素含量作為藤茶質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)，但中藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣，有效成分難以一一明確，因此，如何在化學(xué)成分不完全明確的前提下對(duì)藥材進(jìn)行質(zhì)量控制十分有必要。而指紋圖譜技術(shù)與相似度、聚類、主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)手段可以用于綜合評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量?jī)?yōu)劣，避免了以單一成分含量來(lái)評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量好壞的弊端。多酚類化合物抗氧化、抗病毒、抗心腦血管疾病、抗腫瘤等生物活性顯著，類黃酮是多酚類化合物的典型代表，二氫楊梅素、楊梅素、楊梅苷為3種藤茶植物嫩莖葉的主要化學(xué)成分[13]，兒茶素是詮釋茶葉保健功能的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抗菌、抗突變、抗癌和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等功效[18]，兒茶素在藤茶茶多酚中占60%～80%[19]，沒(méi)食子酸是一種富含于藤茶植物中的多酚類化合物，具有抗癌等多種生物活性[20]。因此，選用上述成分作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。本研究基于HPLC指紋圖譜技術(shù)，得到31個(gè)共有峰，指認(rèn)其中6個(gè)共有成分，與已報(bào)道的顯齒蛇葡萄（藤茶）指紋圖譜的文獻(xiàn)相比[9,21]，本研究得到的共有峰更多，且指認(rèn)出的成分不僅為黃酮成分，并通過(guò)相似度分析初步評(píng)價(jià)了20批不同樣品的相似性。同時(shí)，本研究利用PCA和OPLS-DA等化學(xué)模式識(shí)別分析技術(shù)評(píng)價(jià)了不同藤茶原料植物間的質(zhì)量差異，初步篩選出了不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄及其近緣種的差異性標(biāo)志物。此外，研究發(fā)現(xiàn)羽葉蛇葡萄與廣東蛇葡萄中楊梅苷含量明顯高于顯齒蛇葡萄。因此，該研究可為顯齒蛇葡萄、羽葉蛇葡萄與廣東蛇葡萄的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)，并為藤茶植物綜合開(kāi)發(fā)提供技術(shù)參考。

表7 20批樣品6種酚類活性成分含量

Table7 Content of six polyphenol active components in 20 batch of samples

編號(hào)二氫楊梅素/%楊梅素/%楊梅苷/%蘆丁/%兒茶素/%沒(méi)食子酸/% S129.014 91.040 71.031 90.824 40.308 50.041 7 S233.137 01.907 91.138 30.340 10.255 40.051 6 S329.971 31.068 01.000 00.371 30.275 90.075 8 S428.204 20.603 60.741 50.584 70.160 00.077 1 S531.027 9 1.117 9 1.133 00.563 6 0.310 8 0.098 8 S635.731 10.579 71.060 10.475 20.237 40.089 4 S714.867 90.425 81.058 20.312 50.072 10.167 0 S814.874 20.361 30.433 60.312 60.085 80.094 9 S935.420 01.120 60.910 30.492 90.264 50.102 4 S1013.894 00.430 70.686 00.466 50.102 80.116 2 S1121.193 50.573 40.681 10.733 80.093 00.079 3 S1233.411 01.627 91.113 20.417 10.058 60.161 8 S1325.795 70.893 50.684 10.460 50.290 90.152 5 S1429.793 71.173 70.662 80.496 50.289 70.104 4 S1523.744 80.627 90.639 50.312 10.225 70.140 3 S1634.809 61.146 90.753 80.456 90.175 10.146 0 S17 6.179 60.049 10.357 00.148 70.026 30.029 5 S18 7.773 40.295 90.513 60.222 20.077 30.116 7 S19 1.313 10.105 54.139 50.407 10.069 80.106 5 S20 3.194 60.050 52.761 00.736 30.101 00.065 6

圖7 20批樣品6種成分含量熱圖

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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HPLC fingerprint and chemical pattern recognition offrom different producing areas

LING Wei-hong1, CHEN Yan2, FENG Miao1, WANG Chao-chun1,GONG Hui-min3, TIAN Chun-lian1,3,4

1. Hunan Key Laboratory of Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China 2. Zhangjiajie Yongding County Agricultural and Rural Bureau, Zhangjiajie427000, China 3. College of Biology and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou 416000, China 4. National and Local United Engineering Laboratory of Integrative Utilization Technology of, Jishou University, Jishou 416000, China

To establish the HPLC fingerprint of Xianchi Sheputao () and perform chemical pattern recognition.The gradient elution was carried out on an Ultimate XB-C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase of acetonitrile-0.01% phosphoric acid, detection at 280 nm and 360 nm, a volume flow rate of 1 mL/min, an injection volume of 20 μL and a column temperature of 30 ℃. HPLC fingerprints ofand closely related species was established and a combination of chemical pattern recognition methods such as similarity evaluation, cluster analysis (CA), principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA), were used to evaluate the quality ofand closely related species from different producing areas.The HPLC fingerprint method was developed in accordance with the methodological requirements, with 31 common peaks from 18 batches ofThe peaks 4, 9, 11, 14, 15 and 24 were qualitatively identified as gallic acid, catechin, dihydromyricetin, rutin, myricetrin andmyricetin , respectively, and the similarity was more than 0.8. The samples were divided into two categories according to different origins through CA and the results of PCA were consistent with it. Moreover, thirteen to fourteen markers of variation were identified in OPLS-DA, with dihydromyricetin and myricetin as the main markers of variation in the different origins ofand closely related species.The established fingerprint method is stable, reliable and reproducible; Combined with chemical pattern recognition, it can be used for the quality evaluation ofgenus as raw material plant of vine tea.

vine tea;(Hand.-Mazz.) W. T; HPLC fingerprint; chemical pattern recognition; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; gallic acid; catechin; dihydromyricetin; rutin; myricetrin; myricetin

R286.2

A

0253 - 2670(2023)17 - 5725 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.025

2023-02-03

湖南省科技廳資助項(xiàng)目（2019NK4164）；林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（LCHG21908）

凌偉紅（1997—），女，碩士研究生，從事天然產(chǎn)物研發(fā)及藥物質(zhì)量控制研究。Tel: 15580542151 E-mail: 1455426685@qq.com

田春蓮，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥、民族藥質(zhì)量控制及新藥研發(fā)工作。E-mail: tianchunlian1970@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]