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    艾葉黃酮提取工藝的優(yōu)化及抗氧化活性分析

    2023-08-30 14:51:12徐源赫丁軒
    安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2023年14期
    關(guān)鍵詞:抗氧化活性響應(yīng)面法

    徐源 赫丁軒

    摘要 為探索超聲波輔助提取艾葉黃酮的最佳工藝及其抗氧化活性,以黃酮提取率為指標(biāo),采用單因素試驗(yàn)分別考察乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間對(duì)艾葉黃酮提取量的影響,再通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳提取工藝。結(jié)果表明:艾葉黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度62.78%,料液比1∶30.29(g/mL),提取時(shí)間63.46 min,按上述最佳工藝得到黃酮提取率為12.88%;抗氧化活性分析表明艾葉黃酮提取液有一定的抗氧化活性,對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的半抑制濃度(IC50)分別為0.084、0.217 mg/mL。

    關(guān)鍵詞 艾葉黃酮;超聲輔助提取;響應(yīng)面法;抗氧化活性

    中圖分類號(hào) TQ460.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

    文章編號(hào) 1007-7731(2023)14-0043-06

    艾葉別名艾蒿、灸草,為菊科植物艾的干燥葉[1],主要有效成分包括揮發(fā)油、黃酮類、鞣質(zhì)類和多糖等[2]?,F(xiàn)代藥理試驗(yàn)表明,黃酮類物質(zhì)不但具有降血壓、降血脂、緩解心血管疾病、抗菌消炎等作用,還具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生理活性作用[3],已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。艾葉的綜合開發(fā)及利用已逐漸成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[4]。本文主要對(duì)艾葉中的有效成分黃酮進(jìn)行研究,對(duì)艾葉黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并在最佳提取條件下研究艾葉黃酮的抗氧化活性,為艾葉的深度開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    艾葉,南陽(yáng)老艾嶺股份集團(tuán)有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,合肥巴斯夫生物科技有限公司;無(wú)水乙醇,鄭州派尼有限公司;氫氧化鈉(分析純)、亞硝酸鈉(分析純)、硝酸鋁(分析純)、維生素C(分析純)、DPPH,福州飛興生物科技有限公司;H2O2,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    電子分析天平,上海良平儀器儀表有限公司;恒溫水浴鍋,浙江聚能儀器設(shè)備有限公司;超聲波提取儀,長(zhǎng)沙明杰儀器有限公司;高速粉碎機(jī)-6202型,河南立鑫機(jī)械設(shè)備有限公司;高速離心機(jī),南京伊若達(dá)儀器有限公司;雙光束紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵,南京嘉美倫科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 根據(jù)李學(xué)玲等[5]的方法,用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測(cè)定,得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,如圖1所示。結(jié)果表明,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在0.005~0.025 mg/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

    1.3.2 艾葉黃酮提取液制備? 艾葉黃酮提取液制備方法[6]:將干燥的艾葉粉碎制成粉末,精確稱取1.0 g艾葉粉末,然后按照一定的料液比加入不同濃度的乙醇溶液,超聲提取,提取液7 000 r/min離心10 min,取上清液,可得艾葉黃酮提取液。

    1.3.3 艾葉黃酮含量測(cè)定? 將制備得到提取液用移液管移取0.5 mL置于10.0 mL帶有刻度的試管中,隨即加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液到5.0 mL刻度線處,振蕩混勻后按照1.3.1的操作方法進(jìn)行后續(xù)操作,最后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度。得到的數(shù)據(jù)按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算,按照下列公式計(jì)算出艾葉黃酮的得率[7]。

    式中:[C]—測(cè)得的黃酮質(zhì)量濃度,單位為mg/mL;[V]—艾葉樣品定容體積,單位為mL;n—稀釋倍數(shù);

    m—艾葉樣品質(zhì)量,單位為g。

    1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 本試驗(yàn)的主要思路是研究單因素在不同梯度條件下對(duì)艾葉黃酮提取率的影響[8]。在研究乙醇體積分?jǐn)?shù)作為單因素影響艾葉黃酮提取率時(shí),設(shè)置其梯度為30%、40%、50%、60%、70%,并且設(shè)置料液比1∶20 (g/mL),提取時(shí)間30 min;研究料液比梯度1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40時(shí),設(shè)置乙醇濃度30%,提取時(shí)間30 min;最后研究提取時(shí)間梯度30、40、50、60、70 min時(shí),其他2個(gè)單因素此時(shí)設(shè)置為乙醇濃度60%、料液比1∶20(g/mL)。

    1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù),根據(jù)Box-Behnken進(jìn)行設(shè)置表格(表1),通過(guò)Design-Expert 13.0軟件,選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)3個(gè)因素,設(shè)計(jì)出3因素3水平共17組試驗(yàn),包括5組中心試驗(yàn),通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析[9]得到最佳的艾葉黃酮提取工藝數(shù)據(jù),優(yōu)化艾葉黃酮的提取工藝。

    1.3.6 艾葉黃酮對(duì)DPPH自由基清除分析? 按照響應(yīng)面優(yōu)化得到的最優(yōu)條件提取艾葉黃酮[10],得到的艾葉黃酮提取液用60%乙醇進(jìn)行稀釋,配制成

    5個(gè)濃度梯度黃酮提取液。取2.0 mL質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的DPPH溶液,與2.0 mL不同濃度的艾葉黃酮提取液混合搖勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A,按下列公式計(jì)算其對(duì)DPPH自由基的清除率[11]。

    式中:A0—DPPH和蒸餾水混合液的吸光度;A1—樣品液和DPPH混合液的吸光度;A2—蒸餾水和樣品混合后得到的吸光度。

    1.3.7 艾葉黃酮對(duì)羥基自由基清除分析? 該試驗(yàn)通過(guò)水楊酸法研究艾葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除率[12-13]。按照響應(yīng)面法得到的最優(yōu)條件提取艾葉黃酮,得到的艾葉黃酮提取液用60%乙醇進(jìn)行稀釋,配制成5個(gè)濃度梯度黃酮提取液。然后分別配制5 mmoL/L的硫酸亞鐵溶液、水楊酸溶液和過(guò)氧化氫溶液。分別取不同濃度的艾葉黃酮提取液置于不同試管中,先加入1 mL硫酸亞鐵溶液,然后分別加入2 mL過(guò)氧化氫和水楊酸溶液。然后將上述提取液放置在37℃水浴鍋中水浴加熱30.00 min,使用紫外可見分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)量樣品溶液的吸光度;最后用相同質(zhì)量濃度梯度的維生素C作為樣品對(duì)照,根據(jù)下列公式求艾葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除率。

    式中:A0—蒸餾水和3種試劑混合得到的吸光度;A1—樣品液和3種試劑混合得到的吸光度;A2—3種試劑(過(guò)氧化氫替換為蒸餾水)和樣品液混合得到吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    上述所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)處理后作圖,使用Design-Expert 13.0軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析,P<0.05表示為顯著差異,P<0.01表示為極顯著差異,P>0.05,影響不顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 乙醇濃度對(duì)艾葉黃酮提取率的影響? 由圖2可知,當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí),艾葉黃酮提取率最大。在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%之前,艾葉黃酮的提取率和乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān),超過(guò)60%以后,提取率和乙醇體積分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)??赡苁俏镔|(zhì)極性的差異導(dǎo)致這種結(jié)果的產(chǎn)生,艾葉黃酮更容易溶于該體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,使得黃酮的提取率達(dá)到最大。經(jīng)過(guò)分析,最適乙醇濃度為60%。

    2.1.2 料液比對(duì)艾葉黃酮提取率的影響? 由圖3可知,當(dāng)料液比為1∶30(g/mL)時(shí),艾葉黃酮提取率最大。在這個(gè)料液比之前,提取率隨著料液比的增大而上升;在此之后,則隨著料液比的增大而降低。原因是隨著溶劑量的增加,在超聲作用下溶劑更易滲透進(jìn)入到細(xì)胞中,有利于艾葉中的黃酮溶出。而過(guò)量的溶劑會(huì)降低超聲效率,使艾葉中的黃酮不易充分溶出。因此,最適料液比為1∶30。

    2.1.3 提取時(shí)間對(duì)艾葉黃酮提取率的影響? 由圖4可知,當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí),艾葉黃酮提取率最大。在此之前,提取率隨著提取時(shí)間的增加而增加,在此之后,提取率隨著提取時(shí)間增加而降低,60 min之前可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間增大,艾葉結(jié)構(gòu)被徹底破壞,目標(biāo)物質(zhì)溶出增多;60 min后,黃酮提取率表現(xiàn)出與之前相反的趨勢(shì),可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致黃酮的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變,造成提取率下降。因此,最佳時(shí)間為60 min。

    2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果與建模有效性分析? 本試驗(yàn)以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),建立了3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),根據(jù)Box-Behnken原理并利用Design-Expert 13.0軟件進(jìn)試驗(yàn)結(jié)果分析,見表2。數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見表3。

    應(yīng)用Design-Expert 13.0軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析,得到二次多項(xiàng)回歸方程:

    Y=12.78+0.57A+0.341 3B+0.486 2C+0.282 5AB-0.027 5AC-0.18BC-2.13A2-1.44B2-0.852 5C2

    由表3可知:歸回模型P<0.000 1,達(dá)極顯著水平;失擬項(xiàng)P=0.065 3,不顯著;決定系數(shù)R2=0.996 9,表明該模型擬合度良好;矯正決定系數(shù)R2Adj=0.992 6,表明約99.69%的相應(yīng)值(Y)變化可以用該模型解釋。結(jié)果表明,艾葉黃酮提取率影響因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>提取時(shí)間(C)>料液比(B)。并且通過(guò)對(duì)表中數(shù)據(jù)顯著性(P)的分析,可得到一次項(xiàng)A和C,二次項(xiàng)A2、B2、C2的影響極顯著;交互項(xiàng)AB和BC的P<0.05,影響顯著,交互項(xiàng)AC的P>0.05,影響不顯著。綜上分析,該響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)P捅容^可靠。

    根據(jù)響應(yīng)面數(shù)據(jù)模擬結(jié)果,繪制出三維響應(yīng)面圖和等高線圖,見圖5。3D響應(yīng)面圖呈現(xiàn)凸起峰值,峰值與最低處的趨勢(shì)越陡峭,此因素對(duì)響應(yīng)面影響越大,表明該交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響越大,2D等高線圖呈橢圓狀且分布集中時(shí),則說(shuō)明兩個(gè)單因素交互作用達(dá)到顯著。圖中乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)和料液比(B)、提取時(shí)間(C)和料液比(B)的交互作用顯著,乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)和提取時(shí)間(C)的交互作用不顯著,3個(gè)單因素的交互作用與表3(方差結(jié)果)分析一致。

    2.2.2 最佳工藝條件驗(yàn)證? 通過(guò)Design-Expert 13.0軟件對(duì)所建模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化,得出艾葉黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度62.78%,料液比1∶30.29,提取時(shí)間63.46 min,提取率12.88%??紤]試驗(yàn)的可操作性,調(diào)整最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度63%,料液比1∶30 (mg/mL),提取時(shí)間64 min,進(jìn)行3次平行試驗(yàn),得到黃酮提取率為(12.86±0.036)%,得到的試驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面理論預(yù)測(cè)值比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05),表明該擬合模型可靠。

    2.3 艾葉黃酮抗氧化活性分析

    2.3.1 艾葉黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用? 由圖6可知,DPPH自由基的清除作用隨著艾葉黃酮提取液濃度的增加而增加。通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除率的線性方程分析,可以計(jì)算出艾葉黃酮提取液的半抑制濃度(IC50)為0.084 mg/mL。從圖6還可以看出,維生素C對(duì)DPPH自由基的清除能力要強(qiáng)于艾葉黃酮提取液,并且清除率均保持在90%以上。

    2.3.2 艾葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用? 由圖7可知,隨著艾葉黃酮提取物質(zhì)量濃度的增加,對(duì)羥基自由基清除能力呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì),在質(zhì)量濃度大于0.1 mg/mL后清除率遞增趨于平緩,并且通過(guò)艾葉黃酮對(duì)羥基自由基清除率的線性方程,可以計(jì)算出艾葉黃酮的半抑制濃度(IC50)為0.217 mg/mL。在質(zhì)量濃度為0.050~0.135 mg/mL,艾葉黃酮羥基自由基清除能力明顯高于維生素C的自由基清除能力,在質(zhì)量濃度為0.135 mg/mL時(shí),艾葉黃酮的羥基自由基清除能力與維生素C相持平,但是在此之后,艾葉黃酮的自由基清除率低于維生素C。

    3 結(jié)論

    本研究主要對(duì)艾葉黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到艾葉黃酮提取的最佳單因素條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30 (g/mL)、提取時(shí)間60 min;在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Design-Expert 13.0軟件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出艾葉黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度62.78%,料液比1∶30.29 (g/mL),提取時(shí)間63.46 min,并且在此工藝條件艾葉黃酮的提取率達(dá)到12.88%。在最佳提取工藝下得到艾葉黃酮提取液并進(jìn)行抗氧化活性分析,其對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除率的IC50值分別為0.084、0.217 mg/mL,表明艾葉黃酮提取液具有良好的抗氧化活性。本研究結(jié)果可為艾葉資源的深度開發(fā)利用提供參考。

    參考文獻(xiàn)

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    (責(zé)編:張宏民)

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