葡萄糖酸鈣注射液中細菌內(nèi)毒素的定量檢測

朱文娟，李錦妹，翁 嘉，陳文靜，林鳳屏，李紅靜，黃永德

（惠州市食品藥品檢驗所，廣東 惠州 516003）

葡萄糖酸鈣注射液臨床主要用于治療人畜鈣缺乏癥及過敏性疾病，也可用于鎂、氟離子引起的中樞抑制的中毒解救[1-2]。微量動態(tài)顯色法（microkinetic chromogenic method）是一種新型內(nèi)毒素定量檢測方法，具有靈敏度高、檢測范圍寬和鱟試劑用量少等優(yōu)點，近年來受到越來越多的關(guān)注[3]。該方法使用酶標儀，通過檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出的對硝基苯胺（呈色團）的數(shù)量，依據(jù)呈色團的吸光度和內(nèi)毒素濃度間對應(yīng)關(guān)系，計算樣品中的內(nèi)毒素含量[4-5]。微量動態(tài)顯色法不需要凝固蛋白原形成凝膠，直接通過儀器讀取結(jié)果，實現(xiàn)精準定量；實驗操作、數(shù)據(jù)記錄實現(xiàn)了從手工到自動化，保障了實驗過程的完整性和結(jié)果數(shù)據(jù)的可溯源性；96孔反應(yīng)板可同時檢測多個濃度樣品，省時省力；此外，微量動態(tài)顯色法靈敏度比凝膠法高，適用于內(nèi)毒素限值低的樣品的檢測，能較好地消除實驗中的干擾[6]。

本研究采用微量動態(tài)顯色法對葡萄糖酸鈣注射液進行內(nèi)毒素定量檢測，同時與傳統(tǒng)的凝膠法進行比較，建立該品的細菌內(nèi)毒素定量檢測方法，實現(xiàn)在線實時記錄生產(chǎn)各環(huán)節(jié)樣品內(nèi)毒素含量的動態(tài)變化，有助于及時發(fā)現(xiàn)和分析潛在的污染來源，實現(xiàn)無菌藥品安全生產(chǎn)的全過程控制，更好地保障臨床安全用藥。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Multiskan ET內(nèi)毒素檢測儀（美國賽默飛）；BioProbe生物探針5.2系統(tǒng)（湛江安度斯）；MS3漩渦混勻器（美國IKA）；TAL-96G試管恒溫儀（湛江安度斯）。

1.2 試藥

葡萄糖酸鈣注射液6批（規(guī)格為10 ml:1 g×5支，其中焦作市民康藥業(yè)有限公司3批，批號：21060403，21060502，22061903；常州蘭陵制藥有限公司3批，批號：12104090，12104210，12104130）；細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE，中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201987，規(guī)格：80 EU/ml；湛江安度斯生物有限公司，批號：2201260，濃度范圍為0.02～2.0 EU/ml）；動態(tài)顯色法鱟試劑（批號：2202230，規(guī)格：0.35 ml，定量范圍：10～0.01 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）；凝膠法鱟試劑（TAL，批號：2204190，規(guī)格：0.65 ml/支，靈敏度：0.25 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號：2002260，湛江安度斯生物有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細菌內(nèi)毒素的限值

2020年版《中國藥典》第二部品種項下規(guī)定：每1 mg葡萄糖酸鈣中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.17 EU[7]。

2.2 微量鱟試劑動態(tài)顯色法標準曲線可靠性試驗及凝膠法鱟試劑靈敏度復核

按使用說明，取3支湛江安度斯細菌內(nèi)毒素工作標準品，濃度分別為0.02，0.2，2.0 EU/ml，用BET水復溶，并在漩渦混勻器上充分混勻30 s，同時用BET水作為陰性對照管。吸取上述系列濃度細菌內(nèi)毒素標準溶液各25 μl至96孔反應(yīng)板中；取動態(tài)顯色法鱟試劑，加BET水0.35 ml，充分復溶后吸取25 μl，分別加入標準溶液進行反應(yīng)，每個濃度平行3管。預設(shè)吸收度（A）值為0.1，反應(yīng)時間T為3600 s，溫度37 ℃，檢測波長405 nm，以T的對數(shù)為橫坐標，濃度（C）的對數(shù)為縱坐標，得出標準曲線和相關(guān)系數(shù)（r）值?；貧w方程為lgT=2.8974-0.29133lgC，相關(guān)系數(shù)│r│=1.0000＞0.980，變異系數(shù)（CV）值均＜10 %，陰性對照反應(yīng)時間>3600 s，標準曲線可靠性試驗各數(shù)據(jù)符合要求，結(jié)果見表1。

表1 標準曲線的可靠性試驗結(jié)果（n=3）

凝膠法鱟試劑按2020年版《中國藥典》第四部通則1143要求進行靈敏度復核[8]，靈敏度為λ，符合規(guī)定。

2.3 兩種檢測法最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根據(jù)MVD=cL/λ，c為樣品溶液濃度（100 mg/ml），L為葡萄糖酸鈣注射液細菌內(nèi)毒素限值（0.17 EU/mg）；微量動態(tài)顯色法中λ為0.02 EU/ml，凝膠法中λ為0.25 EU/ml，計算出MVD在動態(tài)顯色法中為850，在凝膠法中為68。

2.4 預干擾試驗

分別選取2個廠家各1批樣品，用BET水依次稀釋至25，50，100，200倍（濃度分別為4，2，1，0.5 mg/ml），作為供試品溶液。按使用說明，吸取不同稀釋倍數(shù)的供試品溶液各700 μl，加入濃度為0.2 EU/ml的CSE干粉中，渦漩混勻30 s使其充分復溶，作為供試品陽性對照溶液。取上述制備的各溶液和標準曲線可靠性試驗中的0.02，0.2，2.0 EU/ml系列濃度CSE溶液各25 μl，加入96孔反應(yīng)板，每個濃度平行2份；取BET水作為陰性對照。最后每孔加入25 μl 動態(tài)顯色法鱟試劑，用內(nèi)毒素檢測儀測定。不同的稀釋倍數(shù)，樣品回收率均在50 %～200 %范圍內(nèi)，見表2。在稀釋25倍時，不同樣品的回收率分別為64.46 %和56.13 %，由于56.13 %較低且接近最低限值，故選擇50倍稀釋的樣品進行正式干擾試驗。

表2 預干擾試驗結(jié)果（n=2）

2.5 正式干擾試驗

為確證葡萄糖酸鈣注射液50倍稀釋的有效性，進行2個不同廠家各3個批號樣品的正式干擾試驗。樣品稀釋50倍后，按預干擾試驗的方法進行測定，計算樣品內(nèi)毒素加標回收率和本底內(nèi)毒素含量。實驗的回收率范圍在63.49 %～69.55 %，符合藥典要求，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，樣品在50倍稀釋下不存在抑制或增強的干擾作用；各試驗組平行管的CV值均＜1.5 %；供試品的平均反應(yīng)時間均＞3600 s，實測值均＜0.00391 EU/ml。標準曲線的最小濃度為0.02 EU/ml，稀釋倍數(shù)為50，因此6批葡萄糖酸鈣注射原液內(nèi)毒素結(jié)果均＜1.000 EU/ml，結(jié)果最后換算為＜0.01 EU/mg，符合藥典規(guī)定的＜0.17 EU/mg。在本試驗條件下，葡萄糖酸鈣注射液的最大無干擾稀釋倍數(shù)為50倍。如果采用的鱟試劑靈敏度不同，需按本試驗方法重新確認稀釋倍數(shù)。

表3 正式干擾試驗結(jié)果（n=2）

2.6 凝膠法檢測

用BET水將樣品依次稀釋至34，68倍，作為2倍供試品溶液和供試品溶液。用BET水將CSE標準品（80 EU/ml）稀釋至1.0，0.5 EU/ml，作為4λ，2λ陽性對照溶液。取等量2倍供試品溶液和4λ陽性對照溶液充分混勻，作為供試品陽性對照溶液（2λ）。吸取0.05 ml鱟試劑溶液至各小試管，分別加入0.05 ml供試品溶液、供試品陽性對照溶液（2λ）、陽性對照溶液（2λ）、陰性對照溶液，每種平行兩管，輕搖混勻，放入試管恒溫儀中，37 ℃孵育60 min后取出，觀察凝膠成像結(jié)果。結(jié)果均符合規(guī)定，詳見表4。

表4 凝膠法檢測結(jié)果

3 討論

葡萄糖酸鈣注射液細菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果，微量動態(tài)顯色法與凝膠法一致，均符合《中國藥典》2020年版品種項下規(guī)定[7]。相較凝膠法，微量動態(tài)顯色法有以下優(yōu)勢：一是鱟試劑的使用量僅為凝膠法的1/4，可大大減少對國家二級保護動物鱟資源的需求；二是微量動態(tài)顯色法的檢測限寬，有利于一次性對各種潛在干擾濃度進行篩選，大幅減少鱟試劑的用量，實現(xiàn)大范圍快速篩查；三是可實現(xiàn)實時定量檢測，靈敏度高[9]，檢測結(jié)果可以精確的數(shù)值表示，生產(chǎn)質(zhì)控人員可了解產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量的變化趨勢，有利于注射液生產(chǎn)全過程中的關(guān)鍵風險控制點的安全監(jiān)控[10-13]；四是檢測過程和數(shù)據(jù)處理皆由儀器自動化控制，可實時觀察和監(jiān)控動態(tài)反應(yīng)，避免主觀判斷影響結(jié)果，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的可溯源。除此之外，基于顯色基質(zhì)顏色的變化速率來定量檢測內(nèi)毒素的微量動態(tài)顯色法，不受凝膠形成和濁度測定的的干擾因素影響[14-15]，同時具備動態(tài)濁度法和終點法的優(yōu)點。

葡萄糖酸鈣注射液的臨床用途和適用人群廣泛，內(nèi)毒素限值較低，更應(yīng)嚴控質(zhì)量，降低風險。本實驗建立的微量動態(tài)顯色法，實現(xiàn)了過程的可控和結(jié)果的精確定量，操作簡便，可用于大批量檢測，能更好地保障臨床用藥和藥品的安全生產(chǎn)。