舒筋活血片中非法染色劑酸性紅73的檢測研究

鞏長芹，鄭振秋，李志嬌，孫成考

（臨沂市檢驗(yàn)檢測中心，山東 臨沂 276001）

舒筋活血片為常用的中成藥品種，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十三冊(cè)，目前執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)有國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)[1]，處方由紅花、醋香附、燙狗脊、香加皮、絡(luò)石藤、伸筋草、澤蘭葉、槲寄生、雞血藤、煅自然銅組成；功效為舒筋活絡(luò)，活血散瘀；主治筋骨疼痛，肢體拘攣，腰背酸痛，跌打損傷。方中紅花近年應(yīng)用廣泛，由于來源有限，價(jià)格上漲，其摻偽造假情況較為嚴(yán)重，常有不法人員將其染色偽裝，或以次品染色充當(dāng)優(yōu)品[2]。染色劑的加入嚴(yán)重影響療效，危害人體健康[3-5]。如酸性紅73又名酸性大紅GR，為黃光紅色粉末，是食品禁用色素，具有致癌性。紅花摻偽染色的鑒別方法有較多文獻(xiàn)報(bào)道，但中成藥中染色劑的篩查卻鮮有報(bào)道。本文用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）確認(rèn)舒筋活血片中的非法染色劑酸性紅73并采用HPLC定量測定，為打擊中成藥非法添加染色劑提供了技術(shù)手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD/API4000+液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（日本島津/美國AB公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫）；XS205電子分析天平（美國梅特勒托利多）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

酸性紅73對(duì)照品（來源：中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111773-201602）；乙腈（德國默克，色譜純）；水為超純水；其余試劑均為分析純。46批舒筋活血片來自2020年山東省風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測抽檢樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC排查

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取酸性紅73對(duì)照品11.78 mg，置50 ml量瓶中，加入70 %乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取酸性紅73對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml，置100 ml量瓶中，加70 %乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液I。

2.1.1.2 供試品溶液的制備 分別取舒筋活血片20片，包衣片除去包衣，研細(xì)，精密稱取2.0 g，置具塞錐形瓶中，加70 %乙醇20 ml[6-10]，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）20 min，濾過，濾液回收溶劑，置5 ml量瓶中，加70 %乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.1.3 陰性溶液的制備 未檢出染色試劑的樣品溶液即為陰性樣品溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05 mol/L乙酸銨溶液（B），按表1進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長：515 nm；流速：0.8 ml/min；柱溫：30 ℃。

表1 HPLC梯度洗脫程序

取2.1.1項(xiàng)下的供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液（A）、供試品溶液（B）、陰性溶液（C）HPLC圖譜

2.1.3 專屬性試驗(yàn)

2.1.3.1 HPLC-DAD 取2.1.1項(xiàng)下供試品（檢出酸性紅73）溶液與對(duì)照品溶液進(jìn)入液相色譜儀，比較190～700 nm波長范圍內(nèi)的紫外-可見吸收光譜，其光譜圖基本一致，見圖2。

圖2 對(duì)照品溶液（A）和供試品（檢出酸性紅73）溶液（B）光譜圖

2.1.3.2 HPLC-MS/MS 色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），按表2進(jìn)行梯度洗脫；柱溫：35 ℃；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

表2 HPLC-MS/MS 梯度洗脫程序

質(zhì)譜采集參數(shù)：電噴霧負(fù)離子掃描模式（ESI-），氣簾氣（CUR）：35 psi，離子化電壓（IS）：-4500 V，溫度：350 ℃，噴霧氣（GS1）：40 psi，輔助加熱氣（GS2）：40 psi，選擇質(zhì)荷比m/z255.0→150.3和m/z255.0→240.6為檢測離子對(duì)，碰撞能量：-19 V，去簇電壓（DP）：-60 V。

對(duì)照品溶液：取2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液I 0.2 ml，置200 ml量瓶中，加70 %乙醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液II。

供試品溶液：取2.1.1項(xiàng)下供試品（檢出酸性紅73）溶液，用水稀釋10倍，搖勻，作為供試品溶液。

陰性溶液：取2.1.1項(xiàng)下陰性溶液。

供試品溶液與對(duì)照品溶液二者的離子流色譜圖一致，而陰性溶液未呈現(xiàn)與對(duì)照品溶液相同的離子流圖。二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 二級(jí)質(zhì)譜圖

2.1.4 樣品排查結(jié)果 排查46批次舒筋活血片樣品，有4批次呈陽性結(jié)果。

由排查結(jié)果可見，46批舒筋活血片中有4批樣品檢出與酸性紅73對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，且190～700 nm的波長范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜一致。4批陽性樣品采用HPLC-MS/MS進(jìn)行確認(rèn)，呈現(xiàn)與酸性紅73對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，且二者質(zhì)譜圖一致。其他42批次樣品均未檢出非法染色劑酸性紅73。

2.2 HPLC-DAD含量測定

2.2.1 色譜條件 同2.1.2項(xiàng)下色譜條件。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 取2.1.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液I 1 ml，置10 ml量瓶中，加70 %乙醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液III。

2.2.2.2 供試品溶液的配制 按2.1.1.2項(xiàng)下方法配制。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液III作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液1，對(duì)照品溶液I作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液2，取對(duì)照品儲(chǔ)備液1，2，5 ml，分別加70 %乙醇稀釋至10 ml，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液3，4，5，對(duì)照品儲(chǔ)備液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液6。取以上標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：Y=2.9885×106X+7.332×104，r=0.9999，結(jié)果酸性紅73進(jìn)樣量在0.004712～4.712 μg之間與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液Ⅲ20 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果酸性紅73峰面積的RSD為0.87 %，表明儀器具有良好的精密度。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一舒筋活血片（批號(hào)：20440301）6份，分別按2.1.1.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，各進(jìn)樣20 μl分析，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果舒筋活血片中酸性紅73含量平均值為2.53 μg/g，RSD為0.85 %。表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份舒筋活血片（批號(hào)：20440301）供試品溶液，分別于制備后的0，1，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測定，進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積，結(jié)果酸性紅73峰面積的RSD為1.20 %，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液I 2.0，2.5，3.0 ml各3份，分別置9個(gè)具塞錐形瓶中，置水浴上蒸干[6]。取已知酸性紅73含量的舒筋活血片（批號(hào)為：20440301）樣品9份，各精密稱取2.0 g，分別置上述9個(gè)錐形瓶中，各加入70 %乙醇20 ml，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）20 min，濾過，濾液回收溶劑，置5 ml量瓶中，加70 %乙醇至刻度，搖勻，即得。按2.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測定，計(jì)算平均回收率為97.91 %，RSD為0.81 %。結(jié)果見表3。

2.2.8 樣品中酸性紅73染色劑的測定 根據(jù)2.1.4項(xiàng)下排查結(jié)果，取檢出酸性紅73舒筋活血片樣品，按2.1.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μl，注入液相色譜儀，進(jìn)行分析測定，結(jié)果4批舒筋活血片樣品中酸性紅73的含量分別為2.70，2.94，2.53，3.52 μg/g。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測波長的選擇

采用HPLC-DAD，在190～700 nm進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)酸性紅73在515 nm處有較強(qiáng)的吸收，因此選擇515 nm作為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的檢測酸性紅73等色素的HPLC流動(dòng)相主要有乙腈-乙酸銨溶液[4,6-7]、甲醇-乙酸銨溶液[5,8]、乙腈-甲酸銨溶液[9]等。本文綜合考慮并經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終選擇乙腈-乙酸銨溶液、乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)分別作為HPLC和HPLC-MS/MS的流動(dòng)相。

本文采用HPLC-DAD檢測舒筋活血片中酸性紅73染色劑，采用建立的方法對(duì)46批舒筋活血片樣品進(jìn)行了排查，其中4批檢出了酸性紅73，說明化工染色劑在中成藥中的使用情況依然嚴(yán)峻，應(yīng)引起重視及加大監(jiān)管力度。