彭群藝,李純團(tuán),鄭艷,朱雄鵬
362000福建 泉州,福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院 血液科
近年來,將嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)與T細(xì)胞結(jié)合的一種T細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于腫瘤免疫治療中已成為學(xué)術(shù)研究的主要焦點(diǎn)[1-2]。通過基因修飾使T細(xì)胞表達(dá)CAR,從而針對靶細(xì)胞進(jìn)行直接識別和殺傷,這項(xiàng)技術(shù)在血液腫瘤治療中取得了顯著效果[3-5]。
CART細(xì)胞治療常用的轉(zhuǎn)染方法有三種:電穿孔、基于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶基因傳遞和慢病毒轉(zhuǎn)染[6]。電穿孔法效率最差;基于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶基因傳遞法成本低,轉(zhuǎn)染效率僅次于慢病毒法[7];慢病毒轉(zhuǎn)染效果最佳,但成本高[8]。
由于構(gòu)建不同CAR載體,轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)方式的不同,以及細(xì)胞株等因素影響,導(dǎo)致每一次轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染效率差異較大,對CART細(xì)胞功能研究造成嚴(yán)重的影響。故本研究擬構(gòu)建一種靶向程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1,PDL1)的CAR慢病毒載體(抗PDL1-CAR),并采用非磁珠法進(jìn)行轉(zhuǎn)染和擴(kuò)增培養(yǎng),并利用不同的病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)對T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,保證抗PDL1-CAR慢病毒轉(zhuǎn)染效率,從而優(yōu)化CART細(xì)胞最佳的轉(zhuǎn)染條件與培養(yǎng)方式,為CART細(xì)胞的功能研究奠定基礎(chǔ)。
人伯基特淋巴瘤CA46細(xì)胞株由福建省血液病研究所提供。本課題組在前期研究中,已將CD274基因慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到CA46細(xì)胞中得以產(chǎn)生表達(dá)PD L1和mCherry熒光蛋白的PDL1-CA46細(xì)胞,并使用含有5 mg/mL嘌呤霉素的10%胎牛白清培養(yǎng)基培養(yǎng)。293T細(xì)胞(購自武漢普諾賽生命科技有限公司)為慢病毒的包裝細(xì)胞,按5×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于10 cm的培養(yǎng)皿中,加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP) 的質(zhì)粒GV401(購自上海吉凱基因科技有限公司)結(jié)構(gòu)圖見圖1A,構(gòu)建 50 μL酶切體系:ddH2O 43μL,CutSmart Buffer 2.5μL,質(zhì)粒 DNA3μL,BamH I 1.5μL,混勻,37℃反應(yīng) 3 h。反應(yīng)后將產(chǎn)物電泳并回收目的條帶。
圖1 抗PDL1-CAR載體的設(shè)計(jì)與鑒定Figure 1.Design and Identification of the Anti-PDL1-CAR Vectors
設(shè)計(jì)抗PDL1-CAR基因引物:上游5’-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTG-3’,下游3’-ATAAGCTTGATATCGAATTCTTAAACAACAGAGAAACGGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCG-5’。建立PCR體系:5×PS Buffer 10μL, 上下游引物(10μM)各1μL,dNTP Mix 4μL, Prime STAR HS DNA 聚合酶 0.5μL,抗PDL1-CAR基因(上海生工合成)樣本1μL,ddH2O 32.5μL,共50μL。PCR循環(huán)條件:98℃加熱5 min;98℃ 10 s、56℃ 10 s、72℃ 90 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min,4℃保溫。PCR基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測,110 V,電泳0.5 h。
于冰浴中配制反應(yīng)體系,樣本組:ddH2O 3.5μL,5×CE II 緩沖液 2μL,酶切后載體DNA 2.5μL,抗PDL1-CAR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 1μL,Exnase TM II 1μL,共10μL。GAPDH對照組:ddH2O 2.5μL,5×CE II緩沖液 2μL,酶切后的載體 DNA 2.5μL,GAPDH基因2μL,Exnase TM II 1μL,共10μL?;靹蚝?7℃30 min,再冰浴 5 min 后立即轉(zhuǎn)化。將 5μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與100 μL感受態(tài)混勻,冰上放置 30 min。 42℃熱激 90 s,冰育 5 min。再加入 450 μL LB 培養(yǎng)基,37℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h?;旌弦壕鶆蛲吭谄桨迳希怪门囵B(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中12~16 h。 轉(zhuǎn)化后的樣本送往上海生工進(jìn)行測序,測序結(jié)果用基因比對軟件DNA-MAN進(jìn)行分析比對。最后將測序陽性的樣本提取質(zhì)粒。
目的基因引物:上游5’-CCACCCAATGCTAATGAAG-3’,下游3’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-5’。建立反應(yīng)體系:ddH2O 8.2μL,轉(zhuǎn)化后陽性樣本1μL,2× Taq Plus Master Mix 10μL,上下游引物(10 μM)各0.4μL,共20μL。PCR循環(huán)條件:95℃加熱3 min,1個(gè)循環(huán);95℃30 s,55℃30 s,72℃90 s,32個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min,4℃保溫。PCR擴(kuò)增基因產(chǎn)物的凝膠電泳檢測:制2%濃度的瓊脂糖凝膠,取5μL的PCR產(chǎn)物,與1μL的EB混合后加入凝膠孔中,110 V,電泳0.5 h。
配制體系: pHelper 1.0質(zhì)粒 15 μg,GV401質(zhì)粒20 μg, pHelper 2.0 質(zhì)粒10 μg,Lipo3000 22.5μL,用Opti-MEM將體積調(diào)整為 1 mL,加入293T細(xì)胞當(dāng)中,培養(yǎng)6 h后更換含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48 h。收集293T細(xì)胞的上清液,過濾后25 000 rpm 4℃離心2.5 h,棄上清,加入200 μL的DMEM培養(yǎng)基,于-80℃保存?zhèn)溆谩B《镜味葯z測由上海吉凱基因科技有限公司通過qPCR絕對定量法和熒光法檢測完成,病毒滴度為2.07×105TU/μL。
采用非磁珠法,每次收集50~100 mL健康志愿者的外周血,并同時(shí)告知和簽署科研知情同意書。通過連續(xù)密度梯度離心法從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞,在包被有抗CD3mAb和抗CD28mAb的6孔板中培養(yǎng),加入IL-2(20 U/mL)。第2天, 取2 × 105個(gè)/孔的淋巴細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中,每孔體積為200 μL,按MOI= 10、20、40分別加入抗PDL1-CAR病毒載體10μL、20μL、40μL于24孔培養(yǎng)板中,IL-2(30 IU /mL),Histrnas P 10μL,transA 20μL。第4天, 去上清更換新鮮1640培養(yǎng)基,加IL-2(200 U/mL)。第8天,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況,流式檢測抗PDL1-CAR細(xì)胞的陽性率。并用Flowjo軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。
按MOI = 20的條件轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞,每孔取5×104個(gè)表達(dá)mCherry熒光的PDL1-CA46于24孔板中,按1∶1、2∶1、5∶1和10∶1的效靶比加入相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞(CART細(xì)胞和T細(xì)胞)進(jìn)行混合共培養(yǎng),每組重復(fù)3次。培養(yǎng)16 h后,先通過JIMBIO FIL檢測細(xì)胞總數(shù),再加入AnnexinV 5μL,流式檢測儀檢測0 h和16 h PDL1-CA46細(xì)胞百分率(Annexin V陰性mCherry陽性)。殺傷率% = (1-細(xì)胞總數(shù)×16 h PDL1-CA46細(xì)胞百分率/細(xì)胞總數(shù)×0 h PDL1-CA46細(xì)胞百分率)100%。
使用SPSS 17.0軟件分析兩獨(dú)立樣本均數(shù),采用 MannWhitney U檢驗(yàn)比較兩組間差異,P < 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
GV401載體經(jīng)酶切后電泳顯示PCR產(chǎn)物分子量約為10kb(圖1B)??筆DL1-CAR目的基因片段經(jīng)電泳后顯示條帶的分子量為1.5 kb(圖1C)。與線性表達(dá)載體進(jìn)行重組和轉(zhuǎn)化后,含有目的基因片段的轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為1 kb(圖1D),構(gòu)建出的慢病毒載體經(jīng)上海生工基因測序比對,與MEDI4736序列一致。
抗PDL1-CAR載體結(jié)構(gòu)的胞外段是信號肽和抗PD-L1 單鏈抗體可變區(qū)片段,單鏈抗體可變區(qū)片段可結(jié)合腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1,該片段是源自于MEDI4736的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL序列,跨膜區(qū)序列是CD8鉸鏈,胞內(nèi)段由4-1BB和CD3ζ信號區(qū)組成,EGFP連接于信號區(qū)末端(圖2A、2B)。構(gòu)建的抗PDL1-CAR載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72 h后,在熒光顯微鏡下可以觀察到表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞(圖2C)。
圖2 抗PDL1-CAR的構(gòu)建與表達(dá)Figure 2.Construction and Expression of Anti-PDL1-CAR
淋巴細(xì)胞在活化后按MOI = 10、 20、 40的條件加入抗PDL1-CAR病毒,培養(yǎng)第8天進(jìn)行流式檢測,各組CART細(xì)胞陽性表達(dá)率分別為28.80%±0.46%、54.77%±0.32%、71.37%±0.42%(圖3A、B)。通過熒光顯微鏡檢測,可觀察到表達(dá)出綠色熒光的CART細(xì)胞(圖3C)。
圖3 抗PDL1-CAR不同MOI下的轉(zhuǎn)染效率Figure 3.Efficiency of Anti-PDL1-CART Cells with Different MOI
將PDL1-CA46腫瘤細(xì)胞按不同的效靶比與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)16 h,在1∶1效靶比時(shí),CART細(xì)胞和T細(xì)胞兩者對PDL1-CA46細(xì)胞殺傷率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z = -0.218, P = 0.827)。在2∶1、5∶1和10∶1效靶比時(shí),CART 細(xì)胞對PDL1-CA46細(xì)胞殺傷率顯著高于T細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z = -1.964, P < 0.05),且效靶比越高殺傷活性越強(qiáng)(圖4A),殘留的PDL1-CA46細(xì)胞越少(圖4B)。
圖4 抗PDL1-CART細(xì)胞的體外殺傷檢測Figure 4.Cytotoxicity of Anti-PDL1-CART Cells in Vitro
CART細(xì)胞利用胞外的嵌合受體與靶細(xì)胞結(jié)合,可以不受主要組織相容性復(fù)合體限制,直接激活T細(xì)胞,從而對靶細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[9-10]。盡管CART細(xì)胞治療在臨床上已取得了一定的突破,但是CART細(xì)胞的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染培養(yǎng)仍然是影響CART細(xì)胞免疫治療的關(guān)鍵因素之一[11-13]。
本次研究構(gòu)建了一種新的抗PDL1-CAR慢病毒載體,其主要結(jié)構(gòu)由抗PDL1 scFv(胞外段)和胞內(nèi)的信號區(qū)(4-1BB和CD3ζ)組成,信號區(qū)末端協(xié)同表達(dá)一個(gè)EGFP,以便于在流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡下監(jiān)測抗PDL1-CAR慢病毒載體的轉(zhuǎn)染情況[14-15]。
在慢病毒轉(zhuǎn)錄過程中,常常會由于構(gòu)建的載體不同,實(shí)驗(yàn)條件的差異,每一次構(gòu)建的慢病毒載體滴度不同和細(xì)胞株的差異等因素,導(dǎo)致每一次轉(zhuǎn)染后CART細(xì)胞的表達(dá)率也不相同,從而對接下來的CART功能研究產(chǎn)生許多不利的影響[16]。本課題組通過qPCR技術(shù)檢測抗PDL1-CAR慢病毒載體滴度,利用3種不同的MOI進(jìn)行抗PDL1-CAR慢病毒載體的轉(zhuǎn)染,通過流式和熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染后抗PDL1-CAR細(xì)胞的表達(dá)率分別為28.80%±0.46%、54.77%±0.32%、71.37%±0.42%,每組MOI樣本都重復(fù)3次,重復(fù)誤差很小,從圖3結(jié)果可以看出MOI = 20或者40的轉(zhuǎn)染效率大于30%,在越高的效靶比下,CART細(xì)胞對PDL1-CA46細(xì)胞殺傷性越高,完全滿足后續(xù)CART細(xì)胞的功能研究,而且不用擔(dān)心重復(fù)轉(zhuǎn)染造成轉(zhuǎn)染效率結(jié)果的差異性。
CART細(xì)胞只有體外擴(kuò)增培養(yǎng)出足夠數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞,才有利于CART細(xì)胞功能研究和體內(nèi)回輸治療,目前最常用的CART細(xì)胞體外培養(yǎng)方式是磁珠刺激培養(yǎng),Davila等[17]在研究中采用CD3/CD28磁珠刺激培養(yǎng)CD19-CART細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率達(dá)38.4%。通過加入CD3/CD28磁珠反復(fù)刺激培養(yǎng)可以將細(xì)胞體外培養(yǎng)超過60天,且擴(kuò)增數(shù)量達(dá)到109~1011[18]。采用磁珠方法效果雖好,但磁珠和相應(yīng)設(shè)備昂貴,成本高,操作復(fù)雜。非磁珠法CART細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)往往是通過培養(yǎng)瓶中包被抗CD3和CD28抗體來刺激細(xì)胞,并加入細(xì)胞因子進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),Gargett 等[19]研究發(fā)現(xiàn),CD3/Retronectin/IL-2激活擴(kuò)增的GD1-iCART細(xì)胞低于CD3/CD28/IL-7/IL-15和CD3/CD28/IL-2,培養(yǎng)10~14天后細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)增至106~107。本次研究采用非磁珠法對CART細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),并對此進(jìn)行優(yōu)化,培養(yǎng)出的抗PDL1-CAR細(xì)胞數(shù)量完全滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要,并且對表達(dá)PD-L1的血液腫瘤細(xì)胞CA46具有很強(qiáng)的殺傷性[20]。轉(zhuǎn)染效率高,且成本相對磁珠法低,操作簡單,但體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性持續(xù)時(shí)間不長,無法超過21天。
總之,本研究進(jìn)一步探索了CART細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,為CART細(xì)胞的構(gòu)建提供良好參考,同時(shí)優(yōu)化CART細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件和培養(yǎng)方法,增加CART細(xì)胞的表達(dá)率和殺傷活性,為CART細(xì)胞的功能研究提供了基礎(chǔ)。
作者聲明:本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任;并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存,可接受核查。
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