三甲胺N-氧化物與肺動脈高壓的因果關系：兩樣本孟德爾隨機化分析

曹溢，豐瑞誼，唐燕，羅強，張藝文，汪漢

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種進行性肺血管疾病，其臨床特征是持續(xù)的肺血管收縮、肺血管重塑和原位血栓形成導致肺動脈順應性降低和肺血管阻力增加，最終導致右心衰竭和死亡［1］。PAH的發(fā)病率和病死率均較高，估計每100萬成年人中就有10.6人罹患PAH［2］。盡管目前PAH治療方面有了新的進展，但尚缺乏有效藥物，故其病死率仍居高不下［3］。因此，繼續(xù)探討可能參與PAH的其他病理生理學機制非常必要。研究表明，腸道菌群代謝產(chǎn)物三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）與PAH密切相關［4］，但具體因果關系尚未完全明確。孟德爾隨機化方法是探索暴露因素與結局關系的一種流行病學方法［5］，其可克服觀察性研究中的反向因果關系和潛在混雜因素的影響。本研究基于兩樣本孟德爾隨機化分析，以TMAO為暴露因素、PAH為結局，探討了TMAO與PAH的因果關系，以期為PAH的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 TMAO的數(shù)據(jù)集來自全基因組關聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS），包括弗雷明翰心臟研究的2 076名歐洲參與者的人類代謝組的匯總數(shù)據(jù)［6］，詳見https://academic.oup.com/nar/article/42/D1/D975/1061961。PAH的數(shù)據(jù)集來自芬蘭數(shù)據(jù)庫，包括162 962名歐洲受試者的16 380 163個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）信息，詳見https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/finn-b-I9_HYPTENSPUL/。

1.2 工具變量的選擇 由于GWAS中很少有腸道菌群代謝產(chǎn)物的SNP達到全基因組顯著性水平（P＜5×10-8），故本研究選擇具有提示性全基因組顯著性水平（P＜5×10-5）的SNP作為工具變量。工具變量的選擇基于以下3個條件：（1）工具變量與TMAO顯著相關；（2）工具變量與PAH無關；（3）僅有TMAO影響PAH。采用Plink軟件提取備選SNP，備選SNP需滿足以下條件：（1）P＜5×10-5；（2）連鎖不平衡參數(shù)（r2）＜0.001；（3）設置區(qū)域寬度為10 000 kb，以保證各SNP之間相互獨立。其次，利用catalog和PhenoScanner數(shù)據(jù)庫進一步分析備選SNP是否與混雜因素相關，本研究僅納入與混雜因素不相關的SNP。最后，采用F統(tǒng)計量判斷SNP與TMAO的相關強度，以F統(tǒng)計量≤10為存在弱工具變量偏倚的可能性，剔除存在弱工具變量偏倚可能性的SNP。

1.3 孟德爾隨機化分析方法

1.3.1 效應量估計 采用逆方差加權法（inversevariance weighting，IVW）評估TMAO與PAH之間的關系，如存在異質性則使用隨機效應模型，否則使用固定效應模型。其次，使用MR-Egger回歸、最大似然比（maximum likelihood，ML）、加權中位數(shù)（weighted median，WM）和MR多效性殘差和與異常值（MR pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）及MR穩(wěn)健性評分（MR-robust adjusted profile score，MRRAPS）對IVW的結果進行補充［7］。

1.3.2 水平多效性和異質性檢驗 首先，使用MRPRESSO檢測異常值，若存在異常值，則去除異常值后重新進行分析。然后進行留一法敏感性分析，其是每次排除單個SNP，對剩余SNP重新進行IVW分析，從而判斷單個SNP對IVW結果的影響。其次，采用MR-Egger法的截距表示是否存在水平多效性，若截距的P值＜0.05則認為存在水平多效性。再者，采用Cochran'sQ檢驗分析工具變量的異質性；最后，采用漏斗圖分析研究結果的潛在偏倚情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用R軟件中的TwoSampleMR包進行統(tǒng)計分析，所有結果以OR值及其95%CI表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 工具變量的選擇 經(jīng)篩選，與TMAO密切相關的工具變量共9個，分別是rs4846884、rs12131532、rs17131718、rs1538291、rs12116428、rs7522157、rs3935570、rs6656619及rs11583422。9個工具變量的F統(tǒng)計量均＞10，提示存在弱工具變量偏倚的可能性較小。

2.2 孟德爾隨機化分析結果 IVW 分析結果顯示，TMAO可能會增加PAH發(fā)生風險〔OR=1.777，95%CI（1.002，3.149），P=0.048〕；上述關系在ML〔OR=1.806，95%CI（1.004，3.251），P=0.049〕、MR-PRESSO〔OR=2.063，95%CI（1.165，3.652），P=0.037〕及MR-RAPS〔OR=2.063，95%CI（2.054，2.259），P=0.015〕中被證實，但在MR-Egger回歸〔OR=1.394，95%CI（0.302，6.422），P=0.685〕和WM〔OR=1.919，95%CI（0.859，4.288），P=0.112〕中未被證實，見圖1～2。

圖1 主效應圖Figure 1 Main effect diagram

圖2 每個SNP對PAH影響的森林圖Figure 2 Forest map of the effects of each SNP on PAH

2.3 水平多效性和異質性檢驗結果 MR-PRESSO分析結果顯示，本研究納入的SNP不存在異常值。留一法敏感性分析結果顯示，逐一刪除單個SNP后IVW分析結果無明顯變化，見圖3。MR-Egger法的截距分析結果顯示，本研究不存在任何水平多效性（P=0.369）。Cochran'sQ檢驗結果顯示，工具變量不存在異質性（P=0.586）。漏斗圖分析結果顯示，所有工具變量呈非對稱性分布，表明該研究結果可能存在潛在偏倚，見圖4。

圖3 留一法敏感性分析結果Figure 3 The results of leave-one-out sensitivity analysis

圖4 漏斗圖Figure 4 Funnel plot

3 討論

本研究基于兩樣本孟德爾隨機化分析探討了TMAO與PAH的因果關系，IVW分析結果顯示，TMAO可能會增加PAH發(fā)生風險〔OR=1.777，95%CI（1.002，3.149）〕；上述關系在ML、MR-PRESSO及MR-RAPS中被證實，但在MR-Egger回歸和WM中未被證實，考慮IVW分析的統(tǒng)計效應值最好，故認為該結果比較可靠，提示TMAO與PAH可能存在因果關系，TMAO每升高1個單位，PAH發(fā)生風險升高77.7%，故干預TMAO或產(chǎn)TMAO的腸道菌群可能對預防PAH具有積極作用。

本研究孟德爾隨機化分析結果與既往臨床研究結果一致，如MOUTSOGLOU等［8］研究表明，PAH患者腸道菌群失調，其中血液循環(huán)中短鏈脂肪酸和次級膽汁酸較低可能會促進PAH的發(fā)生。KIM等［9］通過宏基因組學分析比較了18名1型PAH患者〔平均肺動脈壓為57.4 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）〕和13名對照者的糞便微生物組，結果顯示，PAH患者微生物菌落的分類和功能發(fā)生了明顯變化，與對照者相比，PAH患者精氨酸、脯氨酸和鳥氨酸的合成途徑增加，與TMAO和嘌呤代謝相關的細菌菌落增多。HONG等［10］研究表明，腸道微生物組變化與PAH代謝組變化有關，且這些變化受到NPS2143的影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性PAH和野百合堿誘導的PAH高風險大鼠模型TMAO水平升高，而特發(fā)性多環(huán)芳烴或缺氧誘導的PAH低風險小鼠模型TMAO水平則未升高，表明TMAO表達升高可能僅發(fā)生于嚴重PAH患者；此外，3，3-二甲基-1-丁醇是TMAO合成抑制劑，可以減輕PAH的病理改變，如其可以降低野百合堿誘導的PAH高風險大鼠模型的收縮壓、最大右心房壓，減輕右心室肥厚和減小肺血管厚度［11］，提示TMAO在PAH進展中具有重要作用，可能是治療PAH的靶點。

目前，TMAO誘導PAH的具體機制尚不清楚。HUANG等［11］研究發(fā)現(xiàn)，DMB可以阻止巨噬細胞分泌炎癥因子，從而減輕肺血管損傷。此外，PAH的最重要病理生理學機制是肺動脈平滑肌細胞增殖，而TMAO可以促進肺動脈平滑肌細胞增殖和巨噬細胞遷移［8］。TMAO僅是腸道菌群代謝產(chǎn)物的一種，盡管目前對其研究較多，但腸道菌群本身及其他代謝產(chǎn)物也可能對PAH的發(fā)生發(fā)展具有一定作用，如腸道菌群失調導致腸壁滲透性改變，細菌或細菌成分從腸道直接轉移到血液循環(huán)中［12-13］；血液循環(huán)中的微生物代謝產(chǎn)物負荷改變可以誘導巨噬細胞激活、炎性細胞因子釋放、血小板異常聚集和泡沫細胞形成，從而促進PAH的發(fā)生發(fā)展。另外，微生物菌落其他代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸可激活G-蛋白偶聯(lián)受體或通過抑制組蛋白去乙酰酶來改變表觀遺傳，進而激活調節(jié)性T淋巴細胞，發(fā)揮抗炎作用［14］。

綜上所述，TMAO增加可能導致PAH，TMAO與PAH可能存在因果關系，這為臨床設計PAH的微生物組依賴性代謝產(chǎn)物干預措施提供了思路。本研究基于大數(shù)據(jù)探討了TMAO與PAH的因果關系，此外，ML和MRRAPS分析結果與IVW分析結果一致，表明本研究結果比較穩(wěn)健。但本研究結果仍存在一定局限性：首先，不能完全排除飲食-基因或基因-環(huán)境之間的相互作用，這可能會影響研究結果；其次，無法解決孟德爾隨機化分析中未觀察到的多效性；最后，本研究對象為歐洲人群，該結果是否能推廣至其他國家的人群尚不清楚。

作者貢獻：曹溢、汪漢進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，負責撰寫、修訂論文；唐燕、羅強、張藝文進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；豐瑞誼、羅強進行結果分析與解釋；汪漢負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。