QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測果蔬中苯并烯氟菌唑殘留

葉慧娟

肇慶市食品檢驗(yàn)所（肇慶 526040）

苯并烯氟菌唑（Benzovindiflupyr）是先正達(dá)開發(fā)的一類吡唑酰胺類殺菌劑，是琥珀酸脫氫酶抑制劑。苯并烯氟菌唑廣譜、高效，持效期長，作用于病原菌線粒體呼吸電子傳遞鏈上的蛋白復(fù)合體Ⅱ，阻礙其能量代謝，進(jìn)而抑制病原菌的生長，導(dǎo)致其死亡，從而達(dá)到防治病害的目的[1-8]。但過量的使用會導(dǎo)致食品中殘留苯并烯氟菌唑，危害人體健康。GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[9]規(guī)定苯并烯氟菌唑在部分果蔬中的最大殘留限量（MRL）為0.02～1 mg/kg。已報(bào)道僅有常海龍等[10]采用高效液相色譜測定45%苯并烯氟菌唑.嘧菌酯水分散粒劑中有效成分苯并烯氟菌唑和嘧菌酯的含量，隋程程等[11]采用QuEChERS與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測動物源產(chǎn)品中苯并烯氟菌唑殘留，姜宜飛等[12]采用高效液相色譜分析苯并烯氟菌唑原藥，尚缺乏果蔬中苯并烯氟菌唑殘留分析方法的報(bào)道。

我國是果蔬生產(chǎn)大國，苯并烯氟菌唑被廣泛應(yīng)用于果蔬病害的防治，因此檢測果蔬中該類農(nóng)藥的殘留對消費(fèi)者的健康非常重要。采用QuEChERS法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立適用于檢測果蔬中苯并烯氟菌唑殘留方法，該方法簡單快速、分析速度快、回收率高。我國關(guān)于食品中苯并烯氟菌唑殘留的檢測方法還沒有相應(yīng)的國家及部頒標(biāo)準(zhǔn)，國外也鮮見報(bào)道，試驗(yàn)旨在為食品中苯并烯氟菌唑殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯并烯氟菌唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度＞99%，F(xiàn)irst standard公司）；C18、乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA，美國Aglient公司）；氯化鈉為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）；乙腈（質(zhì)譜級，德國Merck公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity H-class/X evo TQD超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（沃特世公司）；KQ-300DA臺式數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；Fotectorp氮吹儀（美國Reeko公司）；UMV-3多管漩渦混合器（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；高速臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；GM200刀式混合研磨儀（德國Retsch公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取10.0 g粉碎混勻果蔬樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩2 min；加入3 g氯化鈉渦旋振蕩2 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心6 min；吸取上清液于15 mL具塞離心管中，加入500 mg PSA、500 mg C18，渦旋振蕩2 min，以10 000 r/min離心6 min；取上清液于40 ℃氮?dú)獯抵两桑? mL 20%乙腈溶液溶解，渦旋30 s，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg苯并烯氟菌唑標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1%氨水，流動相B為乙腈，流速0.25 mL/min；進(jìn)樣量10.0 μL；柱溫40 ℃。梯度洗脫程序：0～0.5 min，5%～50% B；0.5～1.0 min，50%～95% B；1.0～2.0 min，95% B；2.0～2.1 min，95%～5% B；2.1～5 min，5% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

霧化氣3 mL/min；干燥氣10 mL/min；加熱氣10 mL/min；電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），負(fù)離子掃描；監(jiān)測方式采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源接口溫度300 ℃；脫溶劑溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃。苯并烯氟菌唑質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 苯并烯氟菌唑質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將1.0 μg/mL苯并烯氟菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動注射的方式進(jìn)樣。噻霉酮在ESI源負(fù)離子模式下信號豐度遠(yuǎn)高于正離子模式下，產(chǎn)生帶負(fù)電荷的分子離子峰[M-H]-，因此選擇負(fù)離子掃描模式。通過優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，選擇離子豐度最高、基體干擾較小的離子對作為特征離子對，選擇豐度最強(qiáng)的碎片離子作為定量離子。進(jìn)一步優(yōu)化毛細(xì)管電壓等參數(shù)，使其離子化效率達(dá)到最佳，苯并烯氟菌唑的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 色譜柱的選擇

在相同色譜條件下，考察Waters HSS T3、Waters BEH C18、Zobax Eclipse Plus C18、Waters XSelectR CSHTMC18對苯并烯氟菌唑的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用Waters BEH C18色譜柱可有效分離苯并烯氟菌唑，峰形尖銳、對稱，而且在4 min內(nèi)就可完成對樣品的分析，分析速度顯著提高，見圖1。因此選擇Waters BEH C18柱作為分析柱。

圖1 苯并烯氟菌唑的提取離子總離子流圖

2.3 流動相的選擇

分別以甲醇、乙腈作為有機(jī)相，0.1%氨水、含5 mmol/mL乙酸銨、純水作為水相，進(jìn)行組合條件的考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：水相采用0.1%氨水比純水、含5 mmol/mL乙酸銨可有效提高苯并烯氟菌唑的離子化效率，增強(qiáng)響應(yīng)信號，且有較好的峰形；以乙腈作為有機(jī)相時(shí)，與甲醇相比，可在短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)物分離出來，且出峰狀況更佳；以乙腈-0.1%氨水作為流動相時(shí)，苯并烯氟菌唑的分離效果、質(zhì)譜信號響應(yīng)強(qiáng)度最佳（圖1）。因此，選擇乙腈-0.1%氨水作為流動相。

2.4 凈化劑的選擇

果蔬中含有大量色素、有機(jī)酸、纖維素、維生素與糖類。QuEChERS方法使用較多的凈化劑材料有PSA、C18、GCB。PSA起到弱陰離子交換的作用，去除脂肪酸、糖、有機(jī)酸效果較好，C18吸附劑主要除去脂類及多環(huán)芳烴等非極性、弱極性和中等極性化合物，GCB吸附色素和非極性、弱極性化合物[13]。試驗(yàn)采用C18/PSA/MgSO4、GCB/PSA/MgSO4、PSA/MgSO4、C18/PSA、C18/MgSO4這5種組合比較凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GCB會吸附苯并烯氟菌唑，GCB/PSA/MgSO4回收率為29%，回收最低；C18/PSA/MgSO4、PSA/MgSO4和C18/MgSO4組合回收率介于52%～60%；C18/PSA組合凈化后的提取液最澄清，凈化效果最好，回收率最高。綜合不同類型吸附劑組合的凈化效果和加標(biāo)回收率，最終選擇C18/PSA作為凈化吸附劑。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別以20%乙腈-水溶液，黃瓜、番茄、冬瓜、蘋果和梨空白樣品溶液（空白樣品按照1.3.1處理所得）作為溶劑配制苯并烯氟菌唑的標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)溶液，比較兩者的平均響應(yīng)值，用以判斷基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）的影響，計(jì)算如式（1）所示[14]。

從表2可以看出，不同樣品基質(zhì)的ME在71.3%～76.8%直徑，不能忽略。因此，試驗(yàn)采用基質(zhì)標(biāo)樣外標(biāo)法定量以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 苯并烯氟菌唑的基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限與定量限

2.6 線性范圍、檢出限和定量限

將質(zhì)量濃度0.5，1.0，5.0，10.0，50.0和100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按上述分析條件進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。以濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

從表2可以看出，苯并烯氟菌唑在0.5～100.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。對不同基質(zhì)空白提取液進(jìn)行加標(biāo)測定，確定苯并烯氟菌唑在黃瓜、番茄、冬瓜、蘋果和梨中的方法檢出限均為1 μg/kg，定量限均為2 μg/kg。

2.7 準(zhǔn)確度和精密度

在空白果蔬樣品中分別添加0.5，5.0和50.0 μg/kg這3個(gè)濃度水平，按1.3.1對樣品進(jìn)行前處理，每個(gè)濃度水平平行6次試驗(yàn)。從表3可以看出，平均加標(biāo)回收率是74.3%～90.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD是1.8%～4.1%，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性與準(zhǔn)確性。

表3 不同基質(zhì)中苯并烯氟菌唑的回收率和精密度（n=6）

2.8 實(shí)際樣品分析

隨機(jī)抽取45批市售的黃瓜、番茄、冬瓜、蘋果和梨，應(yīng)用試驗(yàn)方法對樣品進(jìn)行苯并烯氟菌唑殘留檢測。結(jié)果表明，樣品中均未檢出苯并烯氟菌唑。

3 結(jié)論

采用QuEChERS樣品前處理方法，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬中苯并烯氟菌唑殘留的方法。該方法具有操作簡單、定性定量準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，滿足快速檢測果蔬中苯并烯氟菌唑殘留的分析要求。