益生元對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌的作用

常馨佳，梁馨文，劉建偉，邵明亮

西安諾眾康健生物科技有限責(zé)任公司（西安 710000）

幽門(mén)螺桿菌是感染者胃微生物群的主要組成部分，是慢性胃炎、消化性潰瘍病和癌癥的致病因素之一。目前幽門(mén)螺旋桿菌根除方案主要以鉍劑四聯(lián)療法為主，但隨著抗生素耐藥性的增加，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者不斷探索兼具有效根除率和副作用可控的新療法[1]。益生菌作為一種佐劑在臨床應(yīng)用中可提高幽門(mén)螺旋桿菌根除率和（或）減少根除過(guò)程中的不良反應(yīng)，在免疫與非免疫方面都呈現(xiàn)出相應(yīng)的作用[2]。目前臨床上常用的益生菌包括乳酸菌、雙歧桿菌等[3]。其中有研究和發(fā)明專(zhuān)利表明約氏乳桿菌MH-68[4]、植物乳桿菌CN 2018[5]、副干酪乳桿菌JLPF-176[6]、乳雙歧桿菌Probio-M 8[7]、嗜酸乳桿菌LA-10 A[8]可以抑制幽門(mén)螺旋桿菌。

但益生菌存在定殖率低、活菌存活率低、產(chǎn)品貨架期短等問(wèn)題，而益生元作為能夠促進(jìn)益生菌在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)或繁殖的一種有益成分，具有穩(wěn)定性好、貨架期長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，能很好地解決以上缺點(diǎn)[9]。益生元是不能被宿主消化，但可以被益生菌利用和發(fā)酵的化合物，從而促進(jìn)腸道益生菌的繁殖和代謝，促進(jìn)身體健康[10]。益生元通常是指一些多糖、低聚糖、微藻類(lèi)、天然植物等，來(lái)源比較廣泛[11]。目前市面上的食品中最常添加的益生元有低聚甘露糖、菊粉、低聚木糖、水蘇糖、低聚半乳糖、抗性糊精、低聚異麥芽糖、低聚果糖等。但不同益生菌對(duì)不同益生元具有選擇偏好性，且具有菌株特異性[12-15]。針對(duì)不同益生元對(duì)不同益生菌的增殖效果存在差異這一現(xiàn)象，此研究選擇低聚甘露糖、菊粉、低聚木糖、水蘇糖、低聚半乳糖、抗性糊精、低聚異麥芽糖、低聚果糖共8種益生元與約氏乳桿菌MH-68、植物乳桿菌CN 2018、副干酪乳桿菌JLPF-176、乳雙歧桿菌Probio-M 8、嗜酸乳桿菌LA-10 A共5種能夠抗幽門(mén)螺旋桿菌的益生菌進(jìn)行體外試驗(yàn)，分析不同益生元及其對(duì)應(yīng)單糖對(duì)益生菌的增殖情況，以期確定增殖效果最優(yōu)的益生元組合，為益生元協(xié)同益生菌抗幽門(mén)螺旋桿菌的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料

低聚甘露糖（85%，西安諾眾康健生物科技有限責(zé)任公司）；菊粉（90%，重慶驕王天然產(chǎn)物股份有限公司）；低聚木糖（95%，山東龍力生物科技股份有限公司）；水蘇糖（80%，西安天美生物科技股份有限公司）；低聚半乳糖（90%，山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司）；抗性糊精（保齡寶生物股份有限公司）；低聚異麥芽糖（90%，山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司）；低聚果糖（95%，保齡寶生物股份有限公司）；D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖（北京索萊寶生物科技有限公司）。

約氏乳桿菌MH-68（中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC NO：M 2011128，錦喬生物科技有限公司）；植物乳桿菌CN 2018（中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，CGMCC No.4286，河北一然生物科技股份有限公司）；副干酪乳桿菌JLPF-176（中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，CGMCC No.18043，山東中科嘉億生物工程有限公司）；乳雙歧桿菌（Probio-M 8，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，CGMCC No.18610，北京科拓恒通生物技術(shù)股份有限公司）；嗜酸乳桿菌LA-10 A[中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC NO：M 2019012，善恩康生物科技（蘇州）有限公司]。

1.1.2 試劑與儀器

酪蛋白胨、牛肉粉、酵母粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；葡萄糖、硫酸鎂、檸檬酸三銨（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；硫酸錳、磷酸氫二鉀、乙酸鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）；吐溫80（阿拉丁試劑上海有限公司）。

SW-CJ-2 FD超凈工作臺(tái)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；LDZF-50 L高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；LAI-3厭氧培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；Alpha 1502紫外分光光度儀（上海譜元儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制方法

MRS培養(yǎng)基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1.0 L，pH 6.2±0.2。其中每1.0 LMRS培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂粉，即可配制成MRS固體培養(yǎng)基。

缺碳培養(yǎng)基：MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去除葡萄糖即可制備為缺碳培養(yǎng)基。

益生元培養(yǎng)基：先將益生元配制為10%益生元溶液，再以20%的比例將10%益生元溶液加入缺碳培養(yǎng)基中，即可制備為益生元培養(yǎng)基。

1.2.2 試驗(yàn)菌培養(yǎng)方法

菌種活化：將益生菌干粉用涂布器均勻涂布于培養(yǎng)皿上，于指定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)皿上的單菌落接種至裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)。

生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制：將活化好的菌株按2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。分別于2，4，6，8，10，12，14，16，18和24 h測(cè)定1次菌液的吸光度（A600），以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A600為縱坐標(biāo)建立菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.3 接種試驗(yàn)

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液以2%的接種量分別接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基、缺碳培養(yǎng)基和益生元培養(yǎng)基中，于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，在穩(wěn)定期測(cè)定OD600值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

此試驗(yàn)使用SPSS 22.0分析軟件進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，不同小寫(xiě)字母表示各個(gè)處理之間有顯著性差異（P＜0.05）。使用Origin 2022作圖。每個(gè)處理測(cè)定3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行各種特性的比較研究時(shí)，一般選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期、穩(wěn)定期初始階段的細(xì)菌[16]。此試驗(yàn)對(duì)不同乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行了繪制。由圖1（A）可以看出約氏乳桿菌MH-68在2～10 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10 h后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。由圖1（B）可知，植物乳桿菌CN 2018在2～12 h為對(duì)數(shù)期，12 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖1（C）和（D）可知，副干酪乳桿菌JLPF-176和乳雙歧桿菌Probio-M 8在16 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖1（E）可知，嗜酸乳桿菌LA-10A在2～14 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，針對(duì)不同乳桿菌分別選擇它們的穩(wěn)定期初始階段作為發(fā)酵終點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同乳桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2 不同益生元對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌增殖試驗(yàn)

試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度來(lái)評(píng)價(jià)8種益生元對(duì)5種抗幽門(mén)螺旋桿菌的益生菌的增殖能力，結(jié)果如圖2所示。

圖2 益生元對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌的增殖作用

（1）低聚木糖、抗性糊精和菊粉對(duì)5種益生菌增殖效果均較差，菌液吸光度均小于1.5。

（2）低聚甘露糖對(duì)5種抗幽門(mén)螺旋桿菌的益生菌均有較好的增殖效果，菌液吸光度均大于1.5。其中，低聚甘露糖對(duì)約氏乳桿菌MH-68和嗜酸乳桿菌LA-10 A的增殖效果均顯著高于其他益生元（P＜0.05）。

（3）低聚異麥芽糖和低聚果糖對(duì)植物乳桿菌CN 2018、副干酪乳桿菌JLPF-176和乳雙歧桿菌Probio-M 8增殖效果較強(qiáng)，與其他益生元相比有顯著性差異（P＜0.05）。

從上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出，低聚甘露糖、低聚果糖和低聚異麥芽糖對(duì)5種抗幽門(mén)螺旋桿菌的益生菌增殖有較強(qiáng)的效果，且不同益生菌對(duì)不同益生元的利用度存在差異。其中菊粉的增殖效果顯著低于低聚果糖（P＜0.05），菊粉和低聚果糖均是果糖聚合物，菊粉聚合度在2～60之間，低聚果糖聚合度在2～10之間[17]。由此可見(jiàn)，菊粉對(duì)5種抗幽益生菌的增殖效果差的可能原因是聚合度較高，其高聚合度結(jié)構(gòu)使益生菌較難分解利用，且低聚合度的低聚果糖的水溶性高于高聚合度的菊粉，有利于益生菌的快速利用[10,18]。可見(jiàn)益生元聚合度大小是影響抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌增殖效果的原因之一。

2.3 單糖對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌的增殖試驗(yàn)

為探究不同益生元對(duì)菌株增殖效果存在顯著性差異的其他原因，試驗(yàn)選用不同益生元所對(duì)應(yīng)的單糖增殖抗幽門(mén)螺旋桿菌的益生菌，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖4 益生元及對(duì)應(yīng)單糖對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌的增殖作用

（1）D-木糖對(duì)5種益生菌的增殖效果較差，與其他益生元相比均有顯著性差異（P＜0.05）。由圖4可以看出，這與低聚木糖的試驗(yàn)結(jié)果相吻合。說(shuō)明低聚木糖對(duì)抗幽門(mén)菌株的增殖作用顯著低于其他益生元主要是由于D-木糖構(gòu)型引起的，這5種抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌對(duì)D-木糖的利用度低。

（2）D-甘露糖對(duì)5種益生菌增殖效果較好，菌液吸光度均大于1.5。D-甘露糖對(duì)嗜酸乳桿菌LA-10 A的增殖效果均顯著高于其他單糖（P＜0.05）。與上一試驗(yàn)結(jié)果吻合，說(shuō)明低聚甘露糖對(duì)于嗜酸乳桿菌LA-10 A的增殖優(yōu)勢(shì)主要是由于D-甘露糖構(gòu)型所決定的。

（3）由圖4可以看出，D-半乳糖和低聚半乳糖對(duì)約氏乳桿菌MH-68的增殖效果存在較大差異。D-半乳糖對(duì)約氏乳桿菌MH-68的增殖效果較好，與D-甘露糖相比沒(méi)有顯著性差異。在上一試驗(yàn)結(jié)果中，低聚半乳糖增殖效果顯著低于低聚甘露糖和低聚果糖（P＜0.05）。這一現(xiàn)象說(shuō)明，約氏乳桿菌MH-68對(duì)低聚半乳糖的利用度低與其單糖構(gòu)型關(guān)系較小，更主要的原因可能是與低聚半乳糖所含的糖苷鍵有關(guān)。

（4）由圖4可以看出，D-果糖和低聚果糖對(duì)約氏乳桿菌MH-68的增殖效果存在較大差異。D-果糖對(duì)植物乳桿菌CN 2018的增殖效果顯著低于D-甘露糖和D-半乳糖（P＜0.05）。而在上一試驗(yàn)結(jié)果中，低聚果糖對(duì)植物乳桿菌CN 2018的增殖效果顯著高于低聚甘露糖和低聚半乳糖（P＜0.05）。這一現(xiàn)象說(shuō)明，低聚果糖對(duì)植物乳桿菌CN 2018的增殖效果可能與低聚果糖中含有的糖苷鍵有關(guān)，與其單糖構(gòu)型關(guān)系較小。

上述試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，抗幽門(mén)螺旋桿菌的益生菌對(duì)益生元的利用度高低的一部分原因是由益生元單糖構(gòu)型所決定的，另外，除了單糖的不同，益生元所含的糖苷鍵對(duì)增殖效果也有一定影響。

2.4 益生元組合對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌的增殖試驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選用對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌增殖效果較好的低聚異麥芽糖、低聚甘露糖和低聚果糖進(jìn)行復(fù)配，旨在篩選出對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌增殖效果最好的益生元組合。

由圖5可以看出：對(duì)于約氏乳桿菌MH-68、植物乳桿菌CN 2018和嗜酸乳桿菌LA-10 A來(lái)說(shuō)，MOS/FOS 3∶1和MOS/FOS 2∶2時(shí)增殖效果較好。對(duì)于副干酪乳桿菌JLPF-176來(lái)說(shuō)，MOS/FOS 1∶3和MOS/FOS 3∶1時(shí)增殖效果較好。對(duì)于乳雙歧桿菌Probio-M 8來(lái)說(shuō)，IMO/MOS 3∶1和MOS/FOS 1∶3增殖效果較好。

圖5 益生元組合對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌的增殖作用

研究得出：低聚甘露糖和低聚果糖進(jìn)行復(fù)配是較好的結(jié)果。

由表1可以看出，MOS/FOS 3∶1、MOS/FOS 2∶2與MOS/FOS 1∶3三種組合對(duì)于乳雙歧桿菌Probio-M 8和嗜酸乳桿菌LA-10 A的增殖效果均無(wú)顯著性差異（P＜0.05），但對(duì)于約氏乳桿菌MH-68和植物乳桿菌CN 2018，MOS/FOS 1∶3的增殖效果顯著低于其他兩種組合（P＜0.05）。對(duì)于植物乳桿菌CN 2018，MOS/FOS 2∶2的增殖效果顯著低于MOS/FOS 3∶1（P＜0.05）。可得出MOS/FOS 3∶1為增殖抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌的最佳組合。

表1 益生元組合對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌的增殖作用

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)的分析可以得出：低聚甘露糖、低聚果糖和低聚異麥芽糖對(duì)5種抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌（約氏乳桿菌MH-68、植物乳桿菌CN 2018、副干酪乳桿菌JLPF-176、乳雙歧桿菌Probio-M 8、嗜酸乳桿菌LA-10 A）的增殖效果優(yōu)于菊粉、低聚木糖、水蘇糖、低聚半乳糖和抗性糊精。試驗(yàn)進(jìn)一步將增殖效果較好的低聚果糖、低聚甘露糖和低聚異麥芽糖進(jìn)行復(fù)配。當(dāng)?shù)途鄹事短桥c低聚果糖比例為3∶1時(shí)對(duì)抗幽門(mén)螺旋桿菌益生菌增殖效果最好，可作為最佳的復(fù)合益生元組合。為益生元協(xié)同益生菌清除幽門(mén)螺旋桿菌提供了一定的理論參考依據(jù)。其中不同益生元對(duì)菌株增殖效果存在差異的主要原因可能是益生元聚合度的大小、其對(duì)應(yīng)單糖增殖菌株效果及其含有的糖苷鍵類(lèi)型的不同，具體的作用機(jī)制有待下一步深入研究。