可持續(xù)蛋白納米纖維及其功能因子遞送研究進(jìn)展

鄭為君,張玲鶯,陳星

(食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫, 214122)

隨著全球人口的不斷增長(zhǎng),人類對(duì)自然資源的需求量也不斷提高,日益加劇的資源緊張問題已引起全球關(guān)注[1]。蛋白質(zhì)作為食物中重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一,不僅可以為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng),同時(shí)其良好的起泡性、乳化性和凝膠特性等功能特性使之可以作為食品配方成分來改善食品質(zhì)構(gòu),這使得食品研究人員和生產(chǎn)制造商們一方面需要使現(xiàn)有的蛋白質(zhì)最大限度得到可持續(xù)利用,另一方面需要更大程度的開發(fā)蛋白質(zhì)的潛在功能來應(yīng)對(duì)這場(chǎng)資源風(fēng)暴。

淀粉樣蛋白是蛋白質(zhì)經(jīng)過一系列結(jié)構(gòu)變化后形成的一種富含交叉β-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白聚集體。德國(guó)內(nèi)科科學(xué)家 VIRCHOW于1854年提出了淀粉樣蛋白這一術(shù)語[2],基于陽性的碘染色反應(yīng),起初將其識(shí)別為淀粉。病理學(xué)家在患病的大腦和其他組織中觀察到了淀粉樣纖維[3],這一現(xiàn)象本質(zhì)上與蛋白質(zhì)發(fā)生的錯(cuò)誤折疊有關(guān),這種變化導(dǎo)致纖維結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)許多功能蛋白或類似蛋白質(zhì)都能形成這種纖維結(jié)構(gòu),它通常可以通過X射線衍射顯示出典型的交叉β-折疊結(jié)構(gòu)衍射圖案[4]。

隨著研究的進(jìn)展,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白除了在醫(yī)學(xué)研究方面有所貢獻(xiàn),還可以在其他方面得到應(yīng)用,如可作為新型生物材料應(yīng)用于各種納米生物技術(shù),作為生物支架[5-6],參與可持續(xù)水凈化[7],其對(duì)蛋白自身特性如機(jī)械特性、起泡性、穩(wěn)定性、乳化特性等也具有增強(qiáng)效應(yīng)[8],此外,因其較高的比表面積和良好的物理化學(xué)性能,也可以做包埋負(fù)載材料[9]。

JIANG等[10]研究了乳清分離蛋白(whey protein isolate, WPI)自組裝纖維的結(jié)構(gòu)和乳化特性,為乳劑給藥系統(tǒng)的開發(fā)提供了理論依據(jù)。此外,淀粉樣纖維與其他生物大分子組分(如多糖)的結(jié)合以增強(qiáng)材料性能[11]方面的研究也有很大的進(jìn)展。目前對(duì)于各種食源性蛋白淀粉樣纖維的形成條件,功能特性及其在材料方面的功能應(yīng)用等綜述已有所報(bào)道。本文將重點(diǎn)闡述可持續(xù)蛋白的纖維化和其包埋遞送功能因子的原理及途徑,旨在推動(dòng)蛋白淀粉樣纖維在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展。

1 淀粉樣蛋白原纖維的結(jié)構(gòu)

1.1 結(jié)構(gòu)特征與形成機(jī)制

淀粉樣蛋白的名稱來自醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,但已被生物化學(xué)家和生物物理學(xué)家采用,現(xiàn)在普遍用于定義所有交叉β-折疊纖維結(jié)構(gòu)的蛋白[12]。盡管來自不同蛋白的淀粉樣蛋白的大小、天然結(jié)構(gòu)有很大的差異,但纖維在結(jié)構(gòu)上是相似的。淀粉樣蛋白纖維是細(xì)長(zhǎng)的、堅(jiān)硬的、未分枝的扭曲結(jié)構(gòu),直徑約為1～10 nm[13],它具有特殊的交叉β結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)中多肽在β鏈構(gòu)象中的重復(fù)排列,多肽鏈平行于纖維軸排列形成β-折疊結(jié)構(gòu),其組成的β-折疊層垂直于纖維軸[14](圖1)。淀粉樣蛋白可以定義為蛋白質(zhì)分子的有序重復(fù)[15],同時(shí)淀粉樣纖維中的β-片狀結(jié)構(gòu)伴隨著整個(gè)纖維扭曲[16]。原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)分析表明,纖維具有多股螺旋形狀和扭曲的帶狀結(jié)構(gòu)[17]。盡管不同的淀粉樣纖維在大小上看起來相似,但蛋白質(zhì)序列會(huì)影響片狀堆積成原細(xì)絲,例如,二硫鍵的限制。原絲在組裝過程中存在一系列鏈間相互作用,這些相互作用可以在纖維生長(zhǎng)過程中傳遞。

圖1 淀粉樣蛋白交叉β-片狀結(jié)構(gòu)

目前研究認(rèn)為,淀粉樣纖維形成機(jī)制可分為3種:成核聚合、成核構(gòu)象轉(zhuǎn)化、自上而下聚合[18]。第一種機(jī)制認(rèn)為,蛋白質(zhì)聚集是通過成核聚合發(fā)生的,其中形成了高能、稀少的低聚物或單體,一旦形成核,單體就會(huì)迅速組裝到不斷增長(zhǎng)的非共價(jià)聚合物中,以產(chǎn)生熱力學(xué)上更穩(wěn)定的聚合體。酸性條件下淀粉樣蛋白的形成通常被認(rèn)為是通過成核聚合形成的;第二種聚集機(jī)制-成核構(gòu)象轉(zhuǎn)化中,單體和結(jié)構(gòu)上不均勻的低聚物之間存在平衡,這些低聚物一般比單體更穩(wěn)定。低聚物隨后逐漸成核,最終轉(zhuǎn)化為淀粉樣纖維。纖維可以從構(gòu)象上將近端的單體轉(zhuǎn)化為淀粉樣纖維,但這種機(jī)制并不適用于所有的淀粉樣纖維蛋白;第三種機(jī)制假設(shè)蛋白質(zhì)通過一種自上而下聚合作用,從天然折疊的蛋白質(zhì)形成易于聚集的折疊單體。錯(cuò)誤折疊的單體裝配到不斷生長(zhǎng)的聚合物中,形成熱力學(xué)上更穩(wěn)定的高階聚集體,進(jìn)而形成淀粉樣纖維(圖2)。

圖2 纖維演變過程

1.2 主要表征方法

目前學(xué)界已應(yīng)用多種手段對(duì)淀粉樣蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。表征手法主要包括X-射線衍射[19]、X-射線衍射晶體分析法[20]、固態(tài)核磁共振[21]、透射電鏡[22]、冷凍電鏡[23]、原子力顯微鏡[17]、紅外光譜[24]、拉曼光譜。這些表征技術(shù)中,目前只有X-射線衍射晶體分析、固態(tài)核磁共振和冷凍電鏡技術(shù)能夠給出非常精細(xì)的達(dá)到氨基酸殘基分辨率以上的結(jié)構(gòu)模型[25]。一個(gè)更方便的方法是硫黃素T(thioflavin T, ThT)熒光法,1959年染料ThT首次被描述為淀粉樣蛋白的熒光指示劑,其對(duì)淀粉樣蛋白的高度選擇性結(jié)合作用,使其成為體內(nèi)和體外淀粉樣蛋白纖維染色和鑒定最廣泛使用的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”之一[26]。

2 形成淀粉樣纖維的可持續(xù)蛋白質(zhì)

近期科學(xué)研究表明,淀粉樣纖維或類淀粉樣纖維可以由各種食源蛋白質(zhì)形成。食源性蛋白具有無毒[27],營(yíng)養(yǎng)豐富,且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn),是形成淀粉樣纖維的良好蛋白質(zhì)來源。如圖3所示,食源性蛋白可分為4類,包括動(dòng)物蛋白,植物蛋白、真菌蛋白和牛奶蛋白。截至目前,已經(jīng)有20多種食源性蛋白在一定條件下成功組裝成了淀粉樣纖維,如乳清蛋白[28]、玉米醇溶蛋白[29]、谷蛋白[30]、各種豆類蛋白[31]和可食用種子蛋白等[32]。各類食源性淀粉樣纖維的形成也很大程度上證實(shí)了所有蛋白都能形成淀粉樣纖維這一說法,為淀粉樣纖維數(shù)據(jù)庫(kù)的拓展貢獻(xiàn)了巨大力量。許多研究表明,淀粉樣纖維的形成能夠使原蛋白的功能特性得到顯著提高,從而更好地滿足工業(yè)需求,如制成良好的增稠劑,膠凝劑[11]和乳化劑等。

淀粉樣纖維可以在特定條件下形成,實(shí)際中最常應(yīng)用的蛋白質(zhì)成纖維條件是在強(qiáng)酸環(huán)境下適當(dāng)加熱[40]。大豆蛋白是纖維化最常用的植物蛋白之一,WANG等[24]證實(shí)和表征了大豆分離蛋白(soybean protein isolate, SPI)淀粉樣纖維的形成,將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SPI溶液用6 mol/L鹽酸將pH值調(diào)整到2.0,用NaCl溶液將體系離子強(qiáng)度調(diào)整到100 mmol/L,然后將蛋白質(zhì)懸浮液在85 ℃油浴中加熱不同的時(shí)間,隨后在室溫下培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)7 d,使纖維成熟。通過AFM和ThT熒光分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)加熱時(shí)間在6～10 h時(shí),水解物出現(xiàn)小顆粒(直徑約100 nm);隨著加熱時(shí)間達(dá)到12和24 h,水解物開始聚集,并在24 h時(shí)形成線狀聚集。這些現(xiàn)象表明,適度的培養(yǎng)時(shí)間有利于纖維的形成。在酸性加熱的條件下,大豆蛋白的一些肽鍵被水解,產(chǎn)生的肽單體聚集成核狀低聚物,并在孵化過程中進(jìn)一步成長(zhǎng)為纖維。

卵清蛋白(ovalbumin, OVA)是一種糖蛋白,其等電點(diǎn)為4.5。研究發(fā)現(xiàn)OVA在遠(yuǎn)低于等電點(diǎn)時(shí)的自組裝與pH值超過等電點(diǎn)時(shí)的自組裝結(jié)構(gòu)顯著不同[41]。在酸性條件下加熱卵清蛋白,可減少α-螺旋和無規(guī)則卷曲的含量,增加β-片層的含量。加熱后,ThT和8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)的熒光都明顯增強(qiáng),表明聚集體顯示的淀粉樣結(jié)構(gòu)比OVA本身更疏水[42-43]。當(dāng)OVA溶液(pH 2.5)連續(xù)搖床培育多天時(shí),在室溫下也會(huì)形成有熒光增強(qiáng)現(xiàn)象的聚集體。在90 ℃和pH 2.0下進(jìn)行1～265 h的熱處理過程中,無論溶液中是否含有鹽,都會(huì)同時(shí)形成不同類型的卵清蛋白原纖維。

3 淀粉樣纖維在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用

3.1 輸送功能因子的卓越性能

物理結(jié)構(gòu)上,淀粉樣纖維憑借它突出的長(zhǎng)徑比,可以形成物理纏結(jié)網(wǎng)絡(luò),使得比其他蛋白質(zhì)聚集體更有效地提高黏度,高效的凝膠和增稠性能使其可作為凝膠劑或增稠劑,甚至具有應(yīng)用到微膠囊方面的可能性[44];化學(xué)特點(diǎn)上,淀粉樣纖維特殊的交叉β-片層結(jié)構(gòu)以及氫鍵和疏水相互作用使其穩(wěn)定性更強(qiáng)。此外,纖維化后表面豐富的表面活性基團(tuán)也有利于結(jié)合更多的小分子功能物質(zhì),從而與多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或藥物相互作用,淀粉樣纖維在熱和酸性條件下的高度穩(wěn)定性和耐受能力也使其可以突破胃腸消化屏障,實(shí)現(xiàn)對(duì)功能物質(zhì)的靶向輸送[45];在生物特性層面,淀粉樣纖維的形成過程中破壞了原蛋白的結(jié)構(gòu),因此有利于降低食品蛋白的致敏性。此外,纖維中的多肽也存在抗氧化或抗菌性能的潛力。上述淀粉樣纖維的特性使其在作為納米載體負(fù)載和輸送生物活性化合物等方面的應(yīng)用具有巨大的潛力。

3.2 目前的應(yīng)用

3.2.1 礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素

鐵是人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)素,鐵缺乏是全球三大“隱性饑餓”(微量營(yíng)養(yǎng)元素缺乏)之首,是全世界尤其是發(fā)展中國(guó)家面臨的最主要的營(yíng)養(yǎng)問題之一。缺鐵性貧血是比較常見的營(yíng)養(yǎng)缺乏性疾病之一,是體內(nèi)鐵的儲(chǔ)存不能滿足正常紅細(xì)胞生成的需要而發(fā)生的貧血[46]。針對(duì)人群缺鐵的干預(yù)措施一般有食物搭配、食物強(qiáng)化和口服鐵補(bǔ)充劑[47]。隨著各種鐵強(qiáng)化劑的研發(fā)和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化技術(shù)的發(fā)展,鐵強(qiáng)化食品的鐵吸收率以及感官性狀的可接受度都得到了較大提升。

2017年,SHEN等[9]通過制備β-乳球蛋白的淀粉樣纖維,進(jìn)而得到鐵納米顆粒與淀粉樣纖維的復(fù)合體,展示了蛋白質(zhì)原纖維作為鐵強(qiáng)化的有效載體的原始應(yīng)用。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, BLG)纖維是鐵強(qiáng)化的理想載體,因?yàn)樗鼈兛梢允硅F保持在更可利用的Fe(II)狀態(tài),同時(shí)可以保護(hù)鐵免受植酸、多酚和鈣等因素的影響。將天然BLG在pH 2和90 ℃的條件下孵育5 h,形成淀粉樣纖維。通過將淀粉樣蛋白與氯化鐵和硼氫化鈉還原劑混合,鐵納米顆粒成核到纖維上。通過化學(xué)反應(yīng)可以制備出穩(wěn)定的鐵-BLG纖維復(fù)合材料,并且可以加工成液體、凝膠或粉末。鐵-淀粉樣蛋白纖維復(fù)合物具有還原抗氧化作用,既在水中具有良好的穩(wěn)定性,也可以改善感官性能和生物利用度,此外,其較低的經(jīng)濟(jì)成本等優(yōu)勢(shì),使得鐵-淀粉樣纖維復(fù)合材料作為新型鐵強(qiáng)化劑在食品工業(yè)中應(yīng)用具有光明前途。

目前,在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,食品蛋白與其他蛋白復(fù)合而成的淀粉樣纖維也可結(jié)合其他金屬如金、銀、鈀等探究與細(xì)胞毒性之間的關(guān)系,如β-乳球蛋白淀粉樣纖維與金、銀、鈀納米粒子的復(fù)合體被用來研究對(duì)樹突狀細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞活化狀態(tài)的影響[48]。

3.2.2 酚類營(yíng)養(yǎng)素

3.2.2.1 姜黃素

許多脂溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由于存在水溶性差、穩(wěn)定性差和生物利用率低等缺陷,在食品中的應(yīng)用受到限制。姜黃素是從植物姜黃的根莖中提取的一種天然多酚類物質(zhì)[49]。姜黃素具有廣泛的生物活性,長(zhǎng)期以來一直被用于治療多種疾病。在癌癥治療中,姜黃素能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),減少脂質(zhì)過氧化和DNA單鏈斷裂,抑制環(huán)氧合酶(COX-1、COX-2)活化,具有抗增殖作用。盡管具有廣泛的應(yīng)用前景,姜黃素同樣具有脂溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺陷,使得其應(yīng)用受阻。在MOHAMMADIAN等[50]的研究中,乳清蛋白納米纖維(whey protein nanofibers, WPN)被用作載體來改善姜黃素在酸性條件下的水溶性,以擴(kuò)大其在功能性飲料中的應(yīng)用。pH值為2.0的WPI溶液在85 ℃下加熱5 h產(chǎn)生了纖維,與原蛋白相比,WPN顯示出更高的表面疏水性,使其與姜黃素形成可溶性復(fù)合物成為可能。姜黃素與WPN的復(fù)合物和與WPI的復(fù)合物相比,姜黃素與WPN的復(fù)合物的水溶性增加了約1 000倍。乳清蛋白納米纖維與姜黃素的復(fù)合物不僅改善了表觀黏度和表面活性。還使姜黃素的抗氧化能力得到了大幅提高。綜上,該研究表明,乳清蛋白納米纖維可以作為一種負(fù)載材料來拓寬姜黃素這種水不溶性生物活性化合物在食品中的應(yīng)用。

3.2.2.2 白藜蘆醇

白藜蘆醇,又稱為芪三酚,從毛葉藜蘆的根部提取得到,是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的多酚化合物,具有抗腫瘤,抗自由基以及保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用[51]。然而,白藜蘆醇水溶性差,對(duì)紫外線和pH變化的化學(xué)穩(wěn)定性低,代謝速度快等特點(diǎn)導(dǎo)致其生物利用度和生物活性低,這極大地限制了其在食品和制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。2022年,YI等[52]制備出豌豆分離蛋白(pea protein isolate, PPI)納米纖維后,與白藜蘆醇絡(luò)合,得到Res-PPI納米纖維復(fù)合體,進(jìn)行自由基清除活性測(cè)試和溶解度測(cè)試,發(fā)現(xiàn)復(fù)合體的功能特性較游離態(tài)白藜蘆醇顯著提高,證實(shí)PPI納米纖維可以作為新型納米載體用于改善疏水性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水溶性、化學(xué)穩(wěn)定性和體外生物活性。

3.2.2.3 茶多酚

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)的最常見形式,已成為全球公共衛(wèi)生面臨的一個(gè)新的挑戰(zhàn)。臨床觀察表明,亞洲人喝茶或喝咖啡可以降低UC和CD的風(fēng)險(xiǎn),主要?dú)w因于其中的天然多酚[53]。綠茶中含有主要多酚是兒茶素,包括最豐富和最具生物活性的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG),以及其他表兒茶素,例如(-)表沒食子兒茶素(EGC)、(-)表沒食子兒茶素(ECG)和(-)表兒茶素(EC)。然而,茶多酚不穩(wěn)定,口服利用度較差。一種可以考慮的解決方案是與納米材料載體的結(jié)合,以促進(jìn)EGCG的穩(wěn)定性和生物活性。HU等[54]證明了蛋白淀粉樣納米纖維可以負(fù)載兒茶素等多酚類物質(zhì)制成功能性宏觀水凝膠。與其他給藥系統(tǒng)相比,這種方式的多酚的載藥量顯著增加,穩(wěn)定性得到改善?？诜?水凝膠可從胃轉(zhuǎn)運(yùn)到小腸,最后到達(dá)腸道(盲腸、結(jié)腸、直腸),并在結(jié)腸內(nèi)滯留較長(zhǎng)時(shí)間?？诜撍z可明顯改善小鼠結(jié)腸炎模型,促進(jìn)腸屏障功能,抑制促炎基因的表達(dá),并能顯著性(P<0.01)調(diào)節(jié)腸道微生物的代謝紊亂。

4 結(jié)論及展望

動(dòng)植物蛋白在合適的條件下都可形成淀粉樣纖維,這一現(xiàn)象說明形成淀粉樣纖維的傾向是所有蛋白質(zhì)的通用屬性。蛋白質(zhì)纖維化是一種改進(jìn)和擴(kuò)大蛋白質(zhì)功能的策略,特別是在功能因子載體設(shè)計(jì)的應(yīng)用中,優(yōu)勢(shì)明顯。淀粉樣纖維具有的優(yōu)良有序結(jié)構(gòu),使其可以用作生物活性成分和有效的載體來提高藥物等功能因子的生物利用度等其他功能特性。但目前沿著這些路線進(jìn)行的研究還處于起步階段,對(duì)圍繞纖維-纖維、纖維-營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和纖維-人體互作機(jī)制還尚未揭示,纖維作為載體是否能運(yùn)送多種營(yíng)養(yǎng)因子以及對(duì)人體的利害影響還不得而知,相關(guān)研究有待進(jìn)一步開展。