烏雞肽中潛在功能活性肽段的研究

方磊,李詒光,陳亮,劉丹,王雨晴,廖群,張新雪,許錦珍,劉文君*,劉文穎*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京,100015)2(江中藥業(yè)股份有限公司,江西 南昌,330096)

烏雞,又稱烏骨雞,是我國傳統(tǒng)滋補(bǔ)食材、藥材,具有補(bǔ)氣血、益肝腎等功效。烏雞肉中含有20種氨基酸、27種微量元素和多種脂肪酸,鮮肉中氨基酸含量較高,必需氨基酸齊全,且第一、二、三限制性氨基酸含量較高,營養(yǎng)價(jià)值較高,是典型的藥食同源原料[1-3]。烏雞富含微量元素,血液中所含γ球蛋白、血清酶類、血小板均高于普通雞。此外,還具有增加血紅素和血細(xì)胞、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)生理機(jī)能的功能[4]。王勇[4]基于血虛小鼠模型評(píng)價(jià)了烏骨雞多肽的功能活性,發(fā)現(xiàn)其通過提高小鼠的紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量發(fā)揮補(bǔ)血養(yǎng)血的作用。以烏雞為主藥的烏雞白鳳丸具有補(bǔ)養(yǎng)氣血、調(diào)經(jīng)止帶的主要功效[5]。烏雞肽是烏雞肉蛋白經(jīng)過蛋白酶酶解工藝優(yōu)化,再經(jīng)一定分離純化得到的多肽混合物,烏雞肽對(duì)5-氟尿嘧啶貧血模型有恢復(fù)作用,作用機(jī)制與烏雞肽促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)、調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素3及干擾素γ的表達(dá)有關(guān)[4]。但烏雞肽發(fā)揮補(bǔ)血養(yǎng)血作用的核心功能肽段目前尚不明確。因此,本研究以烏雞肽為考察對(duì)象,對(duì)烏雞肽的總蛋白、肽含量、氨基酸組成、分子質(zhì)量分布以及潛在功能活性的特征肽段進(jìn)行研究,為烏雞肽發(fā)揮補(bǔ)血養(yǎng)血作用和營養(yǎng)保健功能應(yīng)用奠定理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏雞肽,北京中食海氏生物技術(shù)有限公司;低聚肽標(biāo)準(zhǔn)品:谷氨酰精氨酸二肽(glutyl-arginine dipeptide,ER)、異亮氨酰精氨酸二肽(isoleucyl-arginine,IR)、天冬酰胺酰精氨酸二肽(asparagyl-arginine,NR)、脯氨酰天冬氨酰精氨酸三肽(prolyl-aspartyl-arginine,PDR)、丙氨酰丙氨酰精氨酸三肽(alanyl-alanyl-arginine,AAR) (純度均≥99%),蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司;乙腈(色譜純),德國Merck公司;甲酸(色譜純),迪馬科技;蒸餾水,屈臣氏;其余藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DU-20恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;L-8900日立全自動(dòng)氨基酸分析儀,天美(中國)科學(xué)儀器有限公司;LC-20AD型高效液相色譜儀、色譜儀Nexera X2、LCMS-8060三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)(配有LabSolutions Ver.5.91色譜工作站),日本島津公司。

1.3 分子質(zhì)量分布的測(cè)定

首先將烏雞肽用流動(dòng)相配成1 mg/mL的溶液,經(jīng)聚四氟乙烯過濾膜(孔徑0.2 μm)過濾后上樣分析,以乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子質(zhì)量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子質(zhì)量451)、桿菌酶(分子質(zhì)量1 450)、細(xì)胞色素C(分子質(zhì)量12 500)為肽標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用高效凝膠過濾色譜法測(cè)定分子質(zhì)量的分布[6-7]。

1.4 烏雞肽蛋白和氨基酸組成測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》方法,氨基酸含量按照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》方法。

1.5 烏雞肽結(jié)構(gòu)序列的鑒定

參照文獻(xiàn)[8-10]的液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法,將烏雞肽配制成20 μg/mL的水溶液,10 000 r/min離心10 min后取上清液,用0.22 μm孔徑的尼龍過濾膜過濾后,制得待測(cè)樣品。按照原創(chuàng)肽段數(shù)據(jù)庫進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描,將Inertsil ODS-3色譜柱連接在液相色譜儀,進(jìn)樣體積10 μL。在正離子模式下,碰撞能量設(shè)置為-25 V和-35 V,將烏雞肽進(jìn)行前體離子掃描(precursor ion scan,PIS),然后對(duì)碰撞后生成的產(chǎn)物離子進(jìn)行分析。

烏雞肽肽段標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)LCMS-8060進(jìn)行Q3掃描、PIS掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)優(yōu)化及肽段序列定量,MRM參數(shù)如表1所示。

表1 肽段序列的MRM優(yōu)化參數(shù)

液相色譜條件:色譜柱:Inertsil ODS-3(2.1 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相A為純水(含0.1%甲酸),流動(dòng)相B為100%乙腈(含0.1 %甲酸),流速0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～15 min,流動(dòng)相B 0%～50%;15～20 min,流動(dòng)相B 50%～100%;20～25 min,流動(dòng)相B 100%;25.1～35 min,流動(dòng)相B 0%;進(jìn)樣體積10 μL;柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件:離子化模式:ESI,正離子模式;離子噴霧電壓+4.5 kV;霧化氣N23.0 L/min;加熱氣N2流速 10 L/min;干燥氣N2流速10 L/min;DL溫度250 ℃;加熱模塊溫度400 ℃;離子源溫度300 ℃;掃描模式MRM;駐留時(shí)間100 ms;延遲時(shí)間3 ms。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Origin 9軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏雞肽的蛋白質(zhì)和氨基酸組成

烏雞肽中總蛋白質(zhì)含量(干基,除去水分所占比例)為94.88%,肽含量(干基)為78.93%,其蛋白質(zhì)和肽含量均較高。肽的基本組成單位是氨基酸,氨基酸的種類和含量對(duì)其功能活性有非常大的影響。從表2可知,烏雞肽含有17種氨基酸,其中含有人體必需的7種氨基酸和2種半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸),其含量分別為25.25%和7.11%,對(duì)人體的營養(yǎng)價(jià)值較高。歐金秀等[11]采用柱前衍生反相高效液相色譜法測(cè)定了驢膠補(bǔ)血顆粒中水解氨基酸,分別是谷氨酸[Glu(E)]、甘氨酸[Gly(G)]、丙氨酸[Ala(A)]、精氨酸[Arg(R)]、脯氨酸[Pro(P)]。張虹等[12]通過魚皮脫脂、脫雜蛋白處理制備魚皮明膠粗提物,經(jīng)多孔型親水聚合物離子交換層析和葡聚糖柱色譜串聯(lián)分離得到活性組分,最終通過環(huán)磷酰胺致小鼠血虛模型,并使用高分辨的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出7條補(bǔ)血肽段,其中肽段序列中含有較多的Gly(G)、Pro(P)、Ala(A)。上述研究結(jié)果說明這些氨基酸可作為補(bǔ)血養(yǎng)血作用的優(yōu)勢(shì)氨基酸,從而肽段發(fā)揮補(bǔ)血養(yǎng)血作用。此外,烏雞肽中Glu(E)、Ala(A)、天冬氨酸[Asp(D)]、Gly(G)、Arg(R)含量較高,有助于烏雞肽發(fā)揮補(bǔ)血養(yǎng)血作用,說明烏雞肽中也存在潛在的補(bǔ)血養(yǎng)血活性功能肽段。

表2 烏雞肽的氨基酸含量 單位:%

2.2 烏雞肽的分子質(zhì)量分布

通過對(duì)圖1中色譜峰進(jìn)行分析計(jì)算,得到烏雞肽的分子質(zhì)量分布,結(jié)果如表3所示。

圖1 烏雞肽的凝膠色譜圖

表3 烏雞肽的分子質(zhì)量分布

烏雞肽的分子質(zhì)量1 000 Da以上的只有8.91%,主要分布在1 000 Da以下,占分子質(zhì)量總量的91.04%,其中主要集中在189～1 000,重均分子質(zhì)量為507.8 Da。相對(duì)分子質(zhì)量的大小與肽的吸收速率有直接的關(guān)系。目前認(rèn)為,分子質(zhì)量1 000 Da以下的多數(shù)為二肽、三肽和四肽,二肽和三肽的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收存在獨(dú)立系統(tǒng)以及相應(yīng)的載體,三肽以上的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還具有一定的爭(zhēng)議[13]。小分子多肽進(jìn)入人體后不需要進(jìn)行消化可直接被人體吸收,具有主動(dòng)性、完整性和載體功能等特點(diǎn),且吸收速度比游離氨基酸快,并具有氨基酸不可比擬的生理功能和改善食品感官的效應(yīng)[14-16]。

2.3 烏雞肽的結(jié)構(gòu)序列鑒定

原創(chuàng)肽段數(shù)據(jù)庫包含二肽及三肽的肽段前體離子信息,無需再對(duì)樣品進(jìn)行分離純化和Q3掃描,可以縮短結(jié)構(gòu)鑒定周期,基于原創(chuàng)肽段數(shù)據(jù)庫直接對(duì)烏雞肽進(jìn)行PIS掃描,采集肽段的碎片離子信息,以便獲得其產(chǎn)物離子信息,若質(zhì)譜圖解析后有對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物離子信息,說明烏雞肽中含有對(duì)應(yīng)的肽段結(jié)構(gòu),結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道的具有補(bǔ)血養(yǎng)血肽段的氨基酸組成含有Glu(E)、Gly(G)、Ala(A)、Arg(R)、Pro(P)[11-12]的特點(diǎn),以及天冬氨酸和天冬酰胺對(duì)補(bǔ)血養(yǎng)血也有重要作用,從中篩選潛在的功能活性肽段。

在正離子模式碰撞能量分別為-25 V和-35 V的條件下對(duì)肽段前體離子進(jìn)行碰撞,然后對(duì)產(chǎn)物離子譜圖進(jìn)行解析,以ER肽段為例說明,圖2-a譜圖解析后發(fā)現(xiàn)304.2是ER的前體離子,然后基于前體離子進(jìn)一步碰撞得到產(chǎn)物離子譜圖,如圖2-b、圖2-c所示,102.1是E的亞胺離子、130.2是E的b1離子、175.4和158.4分別是R的y1離子和z1離子,從而確定烏雞肽樣品中存在ER肽段,同理其他肽段經(jīng)譜圖解析共得到5條主要肽段序列,分別為Glu-Arg(ER)、Ile-Arg(IR)、Asn-Arg(NR)、Pro-Asp-Arg(PDR)、Ala-Ala-Arg(AAR)如表4所示。

a-前體離子;b、c-產(chǎn)物離子

表4 烏雞肽中鑒定出的5條肽段序列

利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)自動(dòng)優(yōu)化功能對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了定量離子對(duì)和電壓的優(yōu)化,利用MRM優(yōu)化參數(shù)對(duì)烏雞肽各肽段進(jìn)行了定量,肽段定量色譜圖及校準(zhǔn)曲線如圖3所示。根據(jù)表5中校準(zhǔn)曲線計(jì)算各肽段含量,分別為ER(4.28 mg/g)、IR(0.61 mg/g)、NR(0.38 mg/g)、PDR(0.38 mg/g)、AAR(0.14 mg/g)。烏雞肽肽段含量大小為:ER>IR>PDR=NR>AAR。研究表明,細(xì)胞穿膜肽能夠穿過細(xì)胞膜或組織屏障達(dá)到細(xì)胞內(nèi)部,大多數(shù)細(xì)胞穿膜肽都具有精氨酸結(jié)構(gòu),因?yàn)榫彼岬碾一诩?xì)胞穿膜肽表面提供正電荷,與細(xì)胞膜中帶負(fù)電荷的羧酸、磷酸基團(tuán)能夠相互作用形成氫鍵,從而穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,含有精氨酸的肽段可能具有較好的生物功能活性,并且是潛在細(xì)胞滲透肽和分子載體[17-18]。從烏雞肽中鑒定出的5條肽段的C端均有精氨酸殘基,可能具有分子載體的潛力作為細(xì)胞穿膜進(jìn)入細(xì)胞,從而發(fā)揮生理活性作用。

a-肽段標(biāo)準(zhǔn)品定量色譜圖;b-烏雞肽定量色譜圖;c-校準(zhǔn)曲線

表5 五條肽段的校準(zhǔn)曲線方程

3 結(jié)論

烏雞肽的總蛋白含量為94.88%,肽含量(干基)為78.93%,氨基酸組成豐富,富含人體必需氨基酸和半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸);烏雞肽的分子質(zhì)量<1 000 Da的肽段含量高達(dá)91.04%,以二肽和三肽為主;經(jīng)超快速液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對(duì)烏雞肽產(chǎn)物離子以及MRM優(yōu)化進(jìn)行掃描,并從中分離鑒定出5條潛在補(bǔ)血養(yǎng)血功能的肽段序列,包含3條二肽序列(ER、IR、NR)和2條三肽序列(PDR、AAR),為烏雞肽補(bǔ)血養(yǎng)血的營養(yǎng)保健應(yīng)用提供了一定的理論支持,但對(duì)于這些肽段補(bǔ)血養(yǎng)血的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。