復(fù)方膠原蛋白肽粉對(duì)皮膚慢性紫外線損傷小鼠的改善作用及機(jī)制研究

郭開恩，閆宮花，曾 鑫，黃光春，殷玉婷

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西南昌 330004；2.江西伍方生物科技有限公司，江西南昌 331700；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330004）

日光中的紫外線（ultraviolet，UV）輻射是造成皮膚損傷的主要外因之一，反復(fù)的UV 輻射易引起皮膚氧化應(yīng)激、色素沉積、炎癥反應(yīng)、干燥、皺紋等慢性損傷[1?3]，甚至?xí)T導(dǎo)皮膚癌的發(fā)生[4]。Col Ⅰ、ELN、HA 作為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的主要成分，與皮膚的彈性、光澤、保濕性和張力等密切相關(guān)，過量的UV 輻射會(huì)導(dǎo)致它們降解，皮膚逐漸變得松弛和干燥而呈現(xiàn)出的光老化狀態(tài)是皮膚慢性紫外線損傷的重要表征[5]。TGF-β1 是轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）家族的重要成員，已經(jīng)被證明可以刺激Ⅰ型膠原蛋白和其它ECM 的合成，同時(shí)也能夠抵抗ECM 的降解[6]，TGF-β1/Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制是皮膚光老化重要的發(fā)病機(jī)制之一[7]。皮膚暴露于UV 下會(huì)導(dǎo)致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的快速生成和持續(xù)積累，ROS 和抗氧化劑之間的不平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，是誘導(dǎo)皮膚損傷，產(chǎn)生皺紋和病理變化的主要因素[8]。

復(fù)方膠原蛋白肽粉是江西伍方生物科技有限公司以膠原蛋白肽為主要原料，輔以針葉櫻桃提取物、西蘭花胚芽提取物、玫瑰花提取物、關(guān)山櫻花提取物、殼寡糖及低聚果糖制成的一種復(fù)方制劑，富含維生素C、黃酮類、多酚和多糖類等天然抗氧化物。膠原蛋白肽作為目前研究廣泛、療效確切的功能性食品能夠改善皮膚水和作用、彈性、粗糙度和密度，顯著增加真皮層細(xì)胞外基質(zhì)含量，從而有效減少皺紋[9?10]，對(duì)光老化皮膚具有明顯修復(fù)效果[11?12]。源自不同天然植物的有效成分如皂苷類、黃酮類、多酚類和多糖類等都能夠通過清除自由基起到抗氧化、抗衰老作用[13?15]。復(fù)方膠原蛋白肽粉能否在調(diào)控TGF-β1/Smads 通路增加ECM 含量的同時(shí)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善皮膚慢性紫外線損傷，還有待深入探討。故本研究旨在觀察復(fù)方膠原蛋白肽粉以及單一魚膠原蛋白肽對(duì)小鼠皮膚慢性UV 損傷的改善效果，同時(shí)從調(diào)控小鼠皮膚中氧化水平和TGFβ1/Smads 信號(hào)通路的角度，初步探討復(fù)方膠原蛋白肽粉改善皮膚慢性紫外線損傷的重要機(jī)制，為復(fù)方類膠原蛋白肽產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供創(chuàng)新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR 雌性小鼠 SPF 級(jí)，（30±2）g，40 只，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。在江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心SPF 級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由攝食飲水，飼養(yǎng)室光照12 h，黑暗12 h，室溫22～24 ℃，濕度恒定。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)JZLLSC20 220757；復(fù)方膠原蛋白肽粉 江西伍方生物科技有限公司生產(chǎn)并提供（7.5 g/袋，批號(hào)20201206）；魚膠原蛋白肽法國羅賽洛公司生產(chǎn)（10 g/袋，純度96%，批號(hào)20200603），江西伍方生物科技有限公司提供；總抗氧化能力（T-AOC）生化試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）ELISA 試劑盒、丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒、I 型膠原蛋白（Col Ⅰ）ELISA 試劑盒、透明質(zhì)酸（HA）ELISA 試劑盒、彈性蛋白（ELN）ELISA 試劑盒、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）ELISA 試劑盒 江蘇酶免生物科技有限公司；總RNA 提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Real time PCR Master Mix（SYBR Green）試劑盒 日本TOYOBO 公司；TGF-β1 一抗江蘇親科生物研究中心有限公司；GAPDH、SMAD7、SMAD3、SMAD2 一抗 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

SS-03AB 型紫外線光療儀 上海希格瑪高技術(shù)有限公司；JRM2016 型切片機(jī)、EG1150 HC 型包埋機(jī)、DM2000 LED 型熒光顯微鏡 德國Leica 公司；光譜MAX190 型酶標(biāo)儀、CFX96TM型Real-Time PCR儀、ChemiDoc XRS+型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)方膠原蛋白肽粉的制備 以膠原蛋白肽為主要原料，針葉櫻桃提取物、西蘭花胚芽提取物、玫瑰花提取物、關(guān)山櫻花提取物、殼寡糖及低聚果糖為輔料，混合制備成復(fù)方膠原蛋白肽粉，其中膠原蛋白肽含量為66.7%。

1.2.2 分組與給藥 小鼠按體重隨機(jī)分為：正常組、模型組、復(fù)方膠原蛋白肽粉組、魚膠原蛋白肽陽性對(duì)照組，每組10 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，根據(jù)人和小鼠間按體表面積折算的等效劑量比值[16]，設(shè)定給藥劑量復(fù)方膠原蛋白肽粉組2.73 g/kg，魚膠原蛋白肽組1.82 g/kg，兩種受試品均為粉末狀，配制溶液時(shí)使用超純水混懸，正常組和模型組給予相應(yīng)體積超純水，每天灌胃一次，連續(xù)9 周。

1.2.3 小鼠皮膚慢性紫外線損傷模型的建立 輻照前24 h，對(duì)所有小鼠進(jìn)行背部皮膚脫毛處理，先用寵物剃毛器剃去小鼠背部較長毛發(fā)，然后均勻涂抹脫毛膏去除余下細(xì)短毛發(fā)，使其形成約4 cm×3 cm 大小裸露區(qū)域。除正常組外，其余各組置于紫外光治療儀下30 cm 處，UVB 強(qiáng)度0.45 mW/cm2，UVA 強(qiáng)度6.7 mW/cm2，采用UVA 聯(lián)合UVB 模擬日光進(jìn)行5 次/周照射，每日一次，照射劑量UVA:UVB=10:1，紫外照射結(jié)束后隨即灌胃受試品，實(shí)驗(yàn)周期為9 周。第一周紫外線的起始強(qiáng)度為最小紅斑劑量（minimal erythemal dose，MED），照射劑量UVA 為0.7 J/cm2，UVB 為0.07 J/cm2，每周增加0.5 個(gè)MED，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期UVA、UVB 總照射劑量分別為94.5 J/cm2、9.45 J/cm2。當(dāng)小鼠皮膚出現(xiàn)粗糙皺紋、局部損傷且有皮革樣觸感時(shí)，表明小鼠皮膚慢性紫外線損傷模型構(gòu)建成功[17?18]。

1.2.4 樣本采集 參考鄧明高[19]的方法進(jìn)行。末次給藥24 h 后，用化妝棉蘸取純水清洗小鼠背部裸露皮膚后腹腔注射劑量為80 mg/kg 的1%戊巴比妥鈉，麻醉處死，分離背部中央皮膚，剪去皮下組織和粘連脂肪后使用4 ℃預(yù)冷PBS 浸泡去除血液，濾紙吸干表面液體，將皮膚組織切分成三份，一份液氮速凍后轉(zhuǎn)入?80 ℃凍存，一份放入4%多聚甲醛中固定，一份用于當(dāng)日干燥法測(cè)定皮膚含水量。

1.2.5 小鼠皮膚狀態(tài)變化記錄及宏觀等級(jí)評(píng)分 實(shí)驗(yàn)期間，每周最后一天利用宏觀等級(jí)評(píng)分方法（見表1）對(duì)小鼠背部皮膚皺紋情況進(jìn)行評(píng)分[20]，每3 周對(duì)小鼠背部裸露皮膚進(jìn)行拍照記錄一次，期間光照條件盡量保持一致。

表1 皮膚皺紋情況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standard of skin wrinkles

1.2.6 皮膚含水量測(cè)定 參考路寧寧[21]的方法進(jìn)行。先用電子天平稱取部分干燥前的背部皮膚質(zhì)量，標(biāo)號(hào)并記錄，于60 ℃烘箱中烘干處理6 h，相同方法再稱取干燥后的背部皮膚質(zhì)量，計(jì)算皮膚含水百分比。

1.2.7 皮膚組織病理學(xué)觀察 參考逯巖松[22]的方法進(jìn)行。取4%多聚甲醛固定的小鼠背部皮膚組織，常規(guī)脫水、包埋，制備石蠟切片，HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.8 FRAP 法檢測(cè)皮膚組織中T-AOC 水平 參考王天順[23]方法。稱取0.1 g 皮膚組織，加入1 mL的80%乙醇進(jìn)行勻漿，勻漿后轉(zhuǎn)入2 mL 離心管中；于60 ℃，200～300 W 條件下超聲提取30 min（間隔5 min 振蕩混勻一次），12000 r/min 離心10 min，取上清，按試劑盒說明書，檢測(cè)T-AOC 水平。

1.2.9 ELISA 檢測(cè)皮膚組織中Col I、ELN、HA、SOD、GSH-Px、MDA、AGEs 水平 參考王明月[24]方法。取適量皮膚組織，剪碎，加入4 ℃ 0.9% NaCl 溶液（0.9%NaCl 溶液的體積總量是皮膚質(zhì)量的9 倍）和適量蛋白裂解液，用組織勻漿機(jī)勻漿（頻率90 Hz，冰上操作，每次10 s，間隔15 s，重復(fù)6 次），勻漿后在3000 r/min、4 ℃下冷凍離心15 min，取適量上清液按試劑盒說明檢測(cè)并計(jì)算皮膚組織中上述指標(biāo)含量。

1.2.10 RT-qPCR 檢測(cè)皮膚組織中TGF-β1/Smads 信號(hào)通路相關(guān)mRNA 表達(dá) 參考謝璟[25]方法。稱取0.1 g 小鼠皮膚組織，加入1 mL 裂解液后充分研磨勻漿提取組織總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)其含量及純度，OD260/280在1.9～2.2，說明RNA 的純度符合要求，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，條件設(shè)置為95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，共40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果以GAPDH 作為內(nèi)參，使用2?ΔΔCt表示最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用相對(duì)定量法進(jìn)行分析后得到mRNA 的表達(dá)水平。所有引物均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.11 Western blot 檢測(cè)皮膚組織中TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 參考金媛媛[26]方法。稱取小鼠皮膚組織約0.1 g，加入10 倍體積量的RIPA 組織裂解液，于4 ℃下消化1 h 后勻漿，勻漿后13000 r/min、4 ℃冷凍離心40 min，取上清20 μL 根據(jù)BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。剩余上清液加入1/4 體積量的5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃下煮15 min 使蛋白變性，自然冷卻、混勻后分裝。蛋白上樣量30 μg，加樣經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，用5%的BSA 按1:10000比例稀釋一抗4 ℃搖床孵育過夜，12 h 后用5%的BSA 按1:1000 比例稀釋對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育75 min，TBST清洗3 次，每次10 min 后，滴入ECL超敏顯影液曝光成像，采用Image J 1.53a 軟件進(jìn)行灰度值分析，以內(nèi)參GAPDH 計(jì)算蛋白相對(duì)灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism software 8.1統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠背部皮膚評(píng)價(jià)

2.1.1 小鼠背部皮膚外觀變化 圖1 所示為各組小鼠在第0 周、第3 周、第6 周及第9 周最后一天時(shí)的背部裸露皮膚外觀，正常組小鼠背部皮膚紋理細(xì)膩，光滑飽滿；模型組小鼠背部皮膚逐漸增厚，產(chǎn)生較多粗糙皺紋，有些許色素沉著，最后伴有局部損傷出現(xiàn)；與模型組相比，復(fù)方膠原蛋白肽粉組和魚膠原蛋白肽組小鼠皮膚外觀均有不同程度的改善，其皮膚皺紋減少，表皮增厚減弱，色素沉著減輕，外觀較為接近正常組；復(fù)方膠原蛋白肽粉組小鼠皮膚始終未出現(xiàn)粗大皺紋，細(xì)淺皺紋也較少，同時(shí)表皮增厚肉眼觀察不明顯，表明雖然魚膠原蛋白肽組小鼠的皮膚損傷得到一定的改善，但沒有復(fù)方膠原蛋白肽粉組效果顯著。

圖1 各組小鼠背部裸露皮膚外觀變化圖Fig.1 Changes of nude skin on the back of mice in each group

2.1.2 小鼠皮膚皺紋宏觀等級(jí)評(píng)分 如圖2 所示，隨著累積輻照時(shí)長的增加，模型組小鼠皮膚皺紋得分不斷遞增，說明其皺紋逐漸由少變多，由淺入深，從第7 周開始，小鼠皮膚開始有深皺紋出現(xiàn)，亦有一只小鼠出現(xiàn)皮膚破損現(xiàn)象；復(fù)方膠原蛋白肽粉組和魚膠原蛋白肽組小鼠得分均極顯著低于模型組（P<0.01），表明復(fù)方膠原蛋白肽粉和魚膠原蛋白肽可緩解紫外線輻射引起的皮膚皺紋；除第5 周外，復(fù)方膠原蛋白肽粉組得分均低于魚膠原蛋白肽組，第8 周和第9 周有顯著性差異（P<0.05），表明復(fù)方膠原蛋白肽粉對(duì)皮膚皺紋的改善效果更加顯著。

圖2 各組小鼠皮膚皺紋情況得分統(tǒng)計(jì)圖（n=10）Fig.2 Skin wrinkle score of mice in each group (n=10)

2.2 對(duì)小鼠皮膚含水量的影響

皮膚含水量是評(píng)估皮膚角質(zhì)層屏障功能和健康狀況的常用指標(biāo)。皮膚暴露于紫外線會(huì)對(duì)皮膚屏障功能產(chǎn)生影響，真皮深層的水分通過表皮蒸發(fā)散失，從而造成皮膚含水量下降[27?28]。有研究表明，皮膚含水量與皮膚的光澤度、粗糙度、飽滿度密切相關(guān)，皮膚含水量下降會(huì)造成皮膚暗沉、觸感變硬、表面粗糙有細(xì)紋[29]。各組小鼠皮膚含水量如圖3 所示，與正常組比較，模型組小鼠皮膚含水量極顯著降低（P<0.01），說明經(jīng)過紫外線輻照后，小鼠皮膚角質(zhì)層屏障功能受到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致背部皮膚水分大量散失；與模型組比較，復(fù)方膠原蛋白肽粉組和魚膠原蛋白肽組小鼠皮膚含水量顯著升高（P<0.05），表明復(fù)方膠原蛋白肽粉和魚膠原蛋白肽都能夠有效抑制紫外線輻照過程中小鼠背部皮膚的水分散失，對(duì)小鼠皮膚屏障具有保護(hù)作用；復(fù)方膠原蛋白肽粉組小鼠皮膚含水量極顯著高于魚膠原蛋白肽組（P<0.01），表明復(fù)方膠原蛋白肽粉對(duì)皮膚的保濕補(bǔ)水效果更佳。

圖3 各組小鼠皮膚含水量測(cè)定結(jié)果（n=10）Fig.3 Determination of skin water content in mice (n=10)

2.3 皮膚組織病理學(xué)改變

圖4 所示為紫外線輻照結(jié)束后，各組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)變化HE 染色圖。正常組小鼠表皮層厚度均勻且較薄，真皮-表皮連接（dermal-epidermal junction，EDJ）區(qū)結(jié)構(gòu)呈波浪狀起伏，有明顯表皮突和真皮乳頭，真皮層內(nèi)膠原纖維束較粗大，且相互交織，排列緊密[30]；模型組小鼠表皮層角化過度，較正常組顯著增厚，EDJ 區(qū)結(jié)構(gòu)扁平，表皮突和真皮乳頭不明顯，真皮層內(nèi)膠原纖維束較為纖細(xì)，排列分散，這與紫外線輻照引起的皮膚組織病理學(xué)改變特征相一致[31]；與模型組相比，復(fù)方膠原蛋白肽粉組和魚膠原蛋白肽組皮膚結(jié)構(gòu)均有一定程度的改善，表皮層厚度減少，EDJ 區(qū)結(jié)構(gòu)再次呈現(xiàn)出波浪狀，表皮突和真皮乳頭數(shù)量增多，真皮層膠原纖維較為飽滿，排列趨向整齊，說明復(fù)方膠原蛋白肽粉和魚膠原蛋白肽均能有效改善紫外線輻照引起的皮膚組織病理學(xué)改變。其中復(fù)方膠原蛋白肽粉組改善效果更明顯，較為接近正常組小鼠皮膚組織。

圖4 各組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)變化HE 染色圖（100×，200×）Fig.4 HE staining of mouse skin structure in each group (100×,200×)

2.4 對(duì)皮膚組織中氧化指標(biāo)水平的影響

皮膚暴露于紫外輻照環(huán)境中，極易導(dǎo)致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）過度蓄積[32]。抗氧化防御系統(tǒng)主要由SOD、GSH-Px 為主的抗氧化酶組成[33]，ROS 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激時(shí)，SOD、GSH-Px 等能夠通過清除自由基，避免脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)糖基化的發(fā)生，起到抗氧化、抗衰老作用[34]，同時(shí)氧化反應(yīng)發(fā)生也能夠降低抗氧化酶活性[35]。MDA、AGEs 分別是膜脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)糖基化的產(chǎn)物，可以很好地反映氧化應(yīng)激嚴(yán)重程度[36]。如表3 所示，與正常組比較，模型組的T-AOC、SOD、GSH-Px 水平均極顯著降低（P<0.01），MDA、AGEs 水平極顯著升高（P<0.01），說明經(jīng)紫外線輻照后，小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性降低，總抗氧化能力減弱，相反氧化損傷加重，小鼠模型構(gòu)建成功；與模型組比較，復(fù)方膠原蛋白肽粉組和魚膠原蛋白肽組T-AOC、SOD、GSH-Px 水平均極顯著升高（P<0.01），MDA、AGEs 水平極顯著降低（P<0.01），其中復(fù)方膠原蛋白肽粉組SOD、MDA、AGEs 水平變化較魚膠原蛋白肽組更加顯著（P<0.05），表明復(fù)方膠原蛋白肽粉和魚膠原蛋白肽均能有效緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高小鼠的總抗氧化能力，整體上復(fù)方膠原蛋白肽粉的抗氧化效果更佳。

表3 各組小鼠皮膚組織中T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA、AGEs 水平的檢測(cè)結(jié)果（n=8）Table 3 Levels of T-AOC,SOD,GSH-Px,MDA and AGEs in skin of mice in each group (n=8)

2.5 對(duì)皮膚組織中細(xì)胞外基質(zhì)水平的影響

Col I、ELN、HA 是真皮層重要的細(xì)胞外基質(zhì)，也是評(píng)估一般功能性食品對(duì)皮膚營養(yǎng)補(bǔ)充效果的關(guān)鍵性指標(biāo)[37]。Col I、ELN 屬結(jié)構(gòu)蛋白，起支撐、填充作用，對(duì)維持皮膚的飽滿度和彈性至關(guān)重要[38]；HA是皮膚中的“保濕因子”，起滋潤和營養(yǎng)作用，直接決定皮膚含水量和保濕能力[39]。有研究表明，經(jīng)紫外線輻照后的皮膚中Col I、ELN、HA 含量下降，導(dǎo)致真皮層營養(yǎng)流失，水合作用大大減弱，由此皮膚褶皺變形，從而加速衰老[40]。各組小鼠ECM 水平如表4 所示，與正常組比較，模型組小鼠皮膚組織中的Col I、ELN、HA 水平均極顯著降低（P<0.01），符合紫外線損傷小鼠皮膚細(xì)胞外基質(zhì)含量變化特征；與模型組比較，復(fù)方膠原蛋白肽粉組和魚膠原蛋白肽組小鼠皮膚組織中Col I、ELN、HA 水平均顯著升高（P<0.05），其中復(fù)方膠原蛋白肽粉組變化更為顯著（P<0.05），表明復(fù)方膠原蛋白肽粉和魚膠原蛋白肽均可有效抵抗紫外輻照誘導(dǎo)的小鼠真皮層細(xì)胞外基質(zhì)流失，增加小鼠皮膚細(xì)胞外基質(zhì)含量，其中復(fù)方膠原蛋白肽粉效果更加顯著。

表4 各組小鼠皮膚組織中Col I、ELN、HA 水平的檢測(cè)結(jié)果（n=8）Table 4 Levels of Col I,ELN and HA in skin of mice in each group (n=8)

2.6 對(duì)TGF-β1/Smads 通路相關(guān)mRNA 表達(dá)水平的影響

TGF-β1/Smads 信號(hào)通路在ECM 的體內(nèi)合成過程中扮演著重要的角色[41]，TGF-β1 信號(hào)受激后的主要下游靶點(diǎn)是多個(gè)Smad 蛋白，當(dāng)TGF-β1 與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，Smad2 和Smad3 蛋白被其受體磷酸化，隨后與Smad4 形成異二聚體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，激活相關(guān)啟動(dòng)子，增加膠原蛋白、彈性蛋白和透明質(zhì)酸合成酶的表達(dá)[42?43]，而Smad7 作為負(fù)調(diào)控因子，能夠阻滯Smad2/3 活化，抑制TGF-β1/Smads 的正向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[34]。多項(xiàng)研究表明[36,41,44]，UV 輻照能夠通過ROS 介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻滯，與TGF-β配體和受體及下游Smad蛋白及其mRNA 表達(dá)下調(diào)有關(guān)。表5 所示為各組小鼠皮膚組織中TGF-β1/Smads 通路相關(guān)mRNA 表達(dá)水平，與正常組比較，模型組小鼠皮膚組織中TGF-β1、TGF-βR2、Smad2、Smad3mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），Smad7mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），表明經(jīng)紫外線輻照后，小鼠皮膚中TGF-β/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制；與模型組比較，復(fù)方膠原蛋白肽粉組和魚膠原蛋白肽組小鼠皮膚組織中TGF-β1、TGF-βR2、Smad2、Smad3mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），Smad7mRNA 表達(dá)水平極顯著降低（P<0.01），其中魚膠原蛋白肽組的Smad2mRNA、復(fù)方膠原蛋白肽粉組的Smad3mRNA 表達(dá)水平與模型組比較有上升趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表5 各組小鼠皮膚組織中TGF-β1、TGF-βR2、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果（n=6）Table 5 mRNA Expression of TGF-β1,TGF-βR2,Smad2,Smad3 and Smad7 in skin of mice in each group (n=6)

2.7 對(duì)TGF-β1/Smads 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5、表6 所示為各組小鼠皮膚組織中TGFβ1/Smads 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，與正常組比較，模型組小鼠皮膚組織中TGF-β1、TGF-βR2、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Smad7 蛋白表達(dá)水平極顯著升高（P<0.01），表明經(jīng)紫外線輻照后，小鼠皮膚中TGF-β/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制，與表5 所示結(jié)果相一致；與模型組相比，復(fù)方膠原蛋白肽粉組和魚膠原蛋白肽組小鼠皮膚組織TGF-β1、TGF-βR2、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)水平極顯著升高（P<0.01），Smad7 蛋白表達(dá)水平極顯著降低（P<0.01），其中復(fù)方膠原蛋白肽粉組的Smad3 蛋白變化更為顯著（P<0.01）。綜合表5 的數(shù)據(jù)顯示，復(fù)方膠原蛋白肽粉和魚膠原蛋白肽均可能是通過激活TGF-β1/Smads通路增加小鼠真皮層細(xì)胞外基質(zhì)合成，從而有效改善皮膚慢性紫外線損傷。

圖5 各組小鼠皮膚組織中TGF-β1/Smads 通路相關(guān)蛋白電泳條帶Fig.5 Electrophoresis band of TGF-β1/Smads pathway related proteins in skin of mice in each group

表6 各組小鼠皮膚組織中TGF-β1、TGF-βR2、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果(n=4)Table 6 Protein expressions of TGF-β1,TGF-βR2,Smad2,Smad3 and Smad7 in skin of mice in each group (n=4)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以復(fù)方膠原蛋白肽粉為研究對(duì)象，通過建立小鼠皮膚慢性紫外線損傷模型，觀察復(fù)方膠原蛋白肽粉對(duì)慢性紫外線損傷小鼠皮膚的改善作用，并初步探討其作用機(jī)制。經(jīng)復(fù)方膠原蛋白肽粉灌胃后，小鼠皮膚外觀出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，皺紋情況得分顯著降低，皮膚水分流失得到有效抑制，一定程度上改善了小鼠皮膚組織病理變化；小鼠皮膚中SOD、GSH-Px 活性均有不同程度的提高，MDA、AGEs 含量有所下降，有效抑制了體內(nèi)氧化反應(yīng)；增加了小鼠皮膚中Col I、ELN、HA 含量，有效抵抗真皮層細(xì)胞外基質(zhì)流失；同時(shí)TGF-β1、TGF-βR2、Smad2、Smad3 蛋白及mRNA表達(dá)增強(qiáng)，激活皮膚中TGF-β1/Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，復(fù)方膠原蛋白肽粉可有效改善小鼠皮膚慢性紫外線損傷，其機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)調(diào)控TGF-β1/Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加細(xì)胞外基質(zhì)合成有關(guān)。另一方面，通過和單一魚膠原蛋白肽的療效對(duì)比，發(fā)現(xiàn)復(fù)方膠原蛋白肽粉對(duì)皮膚慢性紫外線損傷的改善作用更加顯著，表明膠原蛋白肽和多種植物有效成分結(jié)合后產(chǎn)生協(xié)同增效作用。本研究為復(fù)方類膠原蛋白肽產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了創(chuàng)新思路與理論依據(jù)，但復(fù)方膠原蛋白肽粉改善皮膚慢性紫外線損傷的機(jī)制遠(yuǎn)不止于此，還有待于從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)向細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)拓展，進(jìn)一步明確其可調(diào)控的分子機(jī)制與途徑，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)逐步優(yōu)化其配方選擇。