原核漆酶的研究進展及其應(yīng)用

張馨，劉功良，白衛(wèi)東，梁景龍，劉 銳,

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，廣東廣州 510225；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，廣東廣州 510225）

漆酶（苯二酚：氧氧化還原酶，EC1.10.3.2）是一種多功能的氧化還原酶，能夠氧化多種酚類和非酚類化合物，同時伴隨四個氫質(zhì)子轉(zhuǎn)移，將氧分子轉(zhuǎn)化為水。第一種漆酶是1883 年在日本漆樹的滲透液中發(fā)現(xiàn)的，因此命名為漆酶[1]。漆酶在動物、植物、地衣、真菌和細菌中廣泛分布，不同來源的漆酶其性質(zhì)也存在差異，但在活性、催化反應(yīng)機制以及底物廣泛性上具有相似性。真菌漆酶氧化還原電位高，催化活性強，在多個領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。但真菌漆酶存在以下缺點：一、真菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶所需的時間較長，生產(chǎn)成本較高；二、適合在溫和和酸性條件下使用，在高溫、高堿和高鹽條件下不穩(wěn)定；三、真菌漆酶容易被金屬離子、有機溶劑等多種物質(zhì)抑制活性，上述的種種缺點阻礙了真菌漆酶的工業(yè)化應(yīng)用[2?3]。而原核漆酶可以在很大程度上彌補真菌漆酶的各種缺點，如在高溫和高堿條件下具有很好的穩(wěn)定性，對抑制劑的敏感性較低，對金屬離子的依賴性較低，并易于異源表達。與真菌相比，原核漆酶的缺點在其氧化還原電位較低，催化活性較弱。而這些缺點可以通過定向進化、蛋白質(zhì)工程改造等多種技術(shù)手段改善。因此近年來對原核漆酶的研究和應(yīng)用迅速增長[4]。同時，原核漆酶在工業(yè)應(yīng)用中具有發(fā)酵時間短、生產(chǎn)成本低、應(yīng)用廣泛和經(jīng)濟效益高等優(yōu)勢[5?6]。

原核漆酶可以用于食品工業(yè)[7]、環(huán)境保護和治理[8?9]、紡織染料脫色和降解[10]、紙漿和造紙工業(yè)[11]以及生物傳感器的開發(fā)[12]等領(lǐng)域。本文回顧了原核漆酶的來源、結(jié)構(gòu)、催化機制及其理化性質(zhì)并對原核漆酶的應(yīng)用及其最新進展進行了概述，以期可以為今后原核漆酶的應(yīng)用研究提供參考。

1 原核漆酶的來源

漆酶曾經(jīng)在很長的時間內(nèi)被認為只存在于真核生物中[13]。直到1993 年，Givaudan 等[14]才在水稻根瘤細菌的脂肪固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）中檢測到漆酶活性，這也是第一次在原核生物中發(fā)現(xiàn)漆酶活性。2000 年，Alexandre 等[15]通過生物信息學(xué)技術(shù)，提出漆酶也普遍存在于原核生物中。迄今為止，人們已經(jīng)在多種原核生物中發(fā)現(xiàn)了大量不同種類的漆酶。

原核漆酶的篩選主要是通過兩種方法。第一種方法是在自然環(huán)境中篩選具有產(chǎn)漆酶活性菌種的傳統(tǒng)方法。主要是利用漆酶可以將ABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、SGZ（丁香醛連氮）、愈創(chuàng)木酚等底物氧化成為有色產(chǎn)物的方式，快速地篩選鑒定具有產(chǎn)漆酶活性的菌種。目前采用這種方法已經(jīng)在自然界中篩選鑒定出多種產(chǎn)漆酶的原核微生物，包括假單胞菌屬（Pseudomonas）[16?17]、地衣芽孢桿菌屬（Geobacillus）[18]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[19]、海洋單胞菌（Marinomonas mediterranea）[20]、大腸桿菌（Escherichia coli）[21?22]等。這種方法帶來的主要問題有兩個，第一個問題是重復(fù)篩選，相同的微生物往往會具有幾乎相同特性的漆酶，由不同學(xué)者在不同時間，不同地點，相互獨立的篩選同種漆酶，從而造成大量的重復(fù)工作；第二問題是后續(xù)研究困難，由于產(chǎn)漆酶的天然菌種，其漆酶產(chǎn)量較低，在后續(xù)漆酶提純，基因克隆過程中困難重重，深入研究較為艱難。

篩選的第二種方法則是從基因庫中進行漆酶資源的挖掘。隨著基因測序技術(shù)的高速發(fā)展，各種基因數(shù)據(jù)庫和基因組數(shù)據(jù)中數(shù)據(jù)呈現(xiàn)指數(shù)般的快速增長。而通過漆酶結(jié)構(gòu)及其機理的研究，人們對漆酶的結(jié)構(gòu)特點具有了更深入的了解。根據(jù)漆酶基因的特點可以直接從基因庫獲得漆酶基因。Endo 等[23]在2002 年以基因庫中的同源序列作為探針，克隆了灰鏈霉菌的完整EpoA基因，并根據(jù)序列相似性和底物選擇性，預(yù)測EpoA 為漆酶氧化酶，并在2003 年對其進行了酶學(xué)性質(zhì)的研究[24]。Fang 等[25]在2010 年從南海海洋微生物宏基因組中獲得了一個1.32 kb的新的細菌漆酶基因，并根據(jù)漆酶和銅離子結(jié)合的保守序列設(shè)計引物，通過PCR 直接擴增出完整的漆酶基因，將其命名為lac15。并證實該酶具有對氯元素的良好耐受性，以及能降解多種染料。Henne 等[26]在2004 年從極端嗜熱菌Thermus thermophilus的基因組注釋中，根據(jù)漆酶的基因序列特點推測標(biāo)號為TTC1370 的閱讀框為漆酶，進行了漆酶標(biāo)注。在2005 年Miyazaki[27]證實TTC1370基因編碼蛋白是具有超級耐熱特性的漆酶。Fernandes 等[28]在2007 年從極端嗜熱菌Aquifex aeolicus中鑒別出McoA為漆酶基因，并成功地在大腸桿菌中進行了異源表達，證實該蛋白具有典型的漆酶活性。Uthandi等[29]在2010 年從極端嗜鹽菌（Haloferax volcanii）中鑒別出一個漆酶基因LccA，該基因含有小于7%的糖基化基團，對高鹽具有極好的耐受性，并在2012年成功地在大腸桿菌中進行了異源表達[30]。2021年Motamed 等[31]在皮革廠廢水中的宏基因組中，根據(jù)MeTarEnz、CDD 和Phyre2 等工具篩選出了一個PersiLac2的漆酶基因，并證實該漆酶具有良好的耐熱穩(wěn)定性和耐鹽穩(wěn)定性，能夠有效地去除多種染料。

另外可以在宏基因組中篩選漆酶基因，脫離菌種的局限性，直接在環(huán)境中進行篩選?？梢圆捎玫谝环N類似于傳統(tǒng)的菌種篩選方法，在構(gòu)建的可表達宏基因組庫中，添加漆酶氧化底物如ABTS、丁香醛連氮、愈創(chuàng)木酚等，使其在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直接篩選可以將漆酶底物氧化變色的陽性克隆。這種方法不需要對漆酶基因結(jié)構(gòu)有深入的了解，就可以在眾多的基因庫包括宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組中篩選漆酶基因。Yang 等[32]在2018 年從海洋宏基因組60000 個克隆里面篩選出一個可以將ABTS 氧化成為綠色陽性克隆，并將其攜帶的基因命名為lac1326。該漆酶具有較好的耐熱穩(wěn)定性和較高的有機溶劑耐受性等一系列的優(yōu)良特性。

2 原核漆酶的結(jié)構(gòu)特征

在2003 年Enguita 通過X 結(jié)晶衍射方法解析枯草芽孢桿菌CotA 漆酶[33]，這也是第一個被解析出具有四個銅離子的完整原核漆酶。在2004 年Enguita課題組又進一步解析出來含有催化底物ABTS 和氧氣分子的CotA 漆酶的完整漆酶[34]。截至到現(xiàn)在，在PDB 數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)可以檢索到包括鏈霉菌屬、枯草芽孢桿菌、片球菌屬、嗜熱棲熱菌甚至不可培養(yǎng)微生物等將近20 多種不同來源的漆酶的晶體結(jié)構(gòu)。

CotA 是芽孢桿菌形成的芽孢外膜的一種蛋白，具有漆酶活性，擁有極好的耐熱和熱穩(wěn)定性[35]。CotA是一種單體純蛋白酶，不需要進行額外的如糖基化等蛋白修飾。CotA 漆酶也是第一種被解析出三維結(jié)構(gòu)的原核漆酶。CotA 具有的這些良好性能，使其成為了研究氧化還原過程中質(zhì)子轉(zhuǎn)移機理的理想模型蛋白[36]。也是迄今為止研究的最為深入，理解最透徹的原核漆酶。

CotA 蛋白全長共含有513 個氨基酸殘基，分子量為65 kDa[35]。CotA 的整條蛋白鏈由三個同源的銅氧還蛋白結(jié)構(gòu)域組成，所有的結(jié)構(gòu)域幾乎都是由八個β折疊形式形成的桶狀結(jié)構(gòu)組成。結(jié)構(gòu)域1（氨基酸殘基2-176，圖1 中用青色表示）和結(jié)構(gòu)3 共同形成三核三角區(qū)的銅離子區(qū)域；結(jié)構(gòu)域2（殘基183-340，圖1 中用綠色表示）充當(dāng)結(jié)構(gòu)域1 和結(jié)構(gòu)域3 之間的橋梁。結(jié)構(gòu)域3（殘基369-501，圖1 中用灰色表示）包括單核銅中心，并且有助于形成位于結(jié)構(gòu)域1 和3 界面之間的三核三角區(qū)的銅中心結(jié)合位點。三個結(jié)構(gòu)域雖然同源，但是相似性較低，大約只有10%左右[37]。該蛋白的氨基酸序列含有多銅氧化酶所特有的四個氨基酸基序，分別為HXHG，HXH，HXXHXH 和HCHXXXHXXXXM/L/F（其 中X 表示氨基酸）[38]，四個基序中含有的10 個組氨酸，1 個半胱氨酸和1 個蛋氨酸都是漆酶中銅離子的結(jié)合氨基酸。CotA 蛋白的這些結(jié)構(gòu)特征是幾乎所有漆酶共同具有的結(jié)構(gòu)特征。

圖1 枯草芽孢桿菌CotA 三級結(jié)構(gòu)Fig.1 Tertiary structure of Bacillus subtilis CotA

CotA 酶的整體結(jié)構(gòu)符合Dwivedi 等[39]通過對比已知的所有漆酶（細菌、真菌和植物）而提出的結(jié)構(gòu)模型。漆酶由三個順序排列的銅氧還蛋白結(jié)構(gòu)域組成，銅結(jié)合基序在所有序列中都是高度保守的。在N-末端和C-末端，對應(yīng)于結(jié)構(gòu)域1 和3，相似性更加明顯，因為銅相互作用基序存在于結(jié)構(gòu)域1 和3，而不是結(jié)構(gòu)域2。這種保守結(jié)構(gòu)反映了這些酶中銅氧化和O2還原的共同反應(yīng)機制。

對CotA 蛋白的整體結(jié)構(gòu)進行分析，可以認為CotA 酶存在5 個重要的酶催化部位（如圖1 所示）。第一部分為結(jié)合口袋，即催化底物與酶結(jié)合的位置；第二部分為銅離子的單核中心；第三部分為由3 個銅離子組成的三核中心；第四部分是輔助催化底物氧氣由外面進入催化中心的氧氣通道；第五部分是唯一副產(chǎn)物水分子從催化中心排出到蛋白外的水分子通道。

2.1 結(jié)合口袋

根據(jù)Enguita 課題組[33]提出的CotA 酶的結(jié)構(gòu)模型，CotA 酶與其他漆酶相比，擁有一個碩大的底物結(jié)合口袋（圖1a），其結(jié)合表面積為468 ?2，結(jié)合體積高達508 ?3，而且在結(jié)合口袋上方具有一個獨特的蓋子形狀的結(jié)構(gòu)（如圖1a 所示紅色顯示部分）。CotA的結(jié)合口袋位于結(jié)構(gòu)域3 范圍內(nèi)[33]。底物ABTS位于蛋白酶的結(jié)合區(qū)域，整體呈現(xiàn)U 型形狀，ABTS的一半暴露在酶的外部空間，另外一部分埋在CotA結(jié)合口袋里面。包埋在CotA 內(nèi)部中的磺酸鹽部分非?？拷蒀ys-229 和Cys-322 之間形成的二硫鍵，同時磺酸鹽部分還和Gly-323 之間形成氫鍵。在U 型結(jié)構(gòu)中包埋在蛋白酶內(nèi)部的底物接近于T1 銅配體之一His-497 的芳香環(huán)。這種幾何形狀有利于電子從底物通過His-497 轉(zhuǎn)移到T1 銅中心[34]。

Enguita 報道[34]的底物與酶的結(jié)合模型也在隨后的研究中有一定程度的證實。Gupta 等[40]根據(jù)Enguita 提出的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，對催化底物ABTS 附近6 ?以內(nèi)的19 個氨基酸進行隨機突變，最終篩選出了兩個可以強烈影響酶和底物結(jié)合的氨基酸殘基L386 和G417，G417L 和L386W 的雙重突變可以將CotA 酶與ABTS 的Km值由野生型CotA 的32.5 μmol/L降低到16.9 μmol/L，而將與丁香醛連氮（SGZ）的Km值由野生型的37 μmol/L 提高到84 μmol/L，說明這兩個氨基酸殘基會明顯影響酶活催化底物的結(jié)合。而這一結(jié)果進一步被Chen 等[41]證實，Chen 等通過對與CotA 酶高度相似的突變短小芽孢桿菌W3中相同的L386、G417 兩個氨基酸殘基進行定點誘變，得到L386W 和G417L 雙突變體，此雙突變體能改變酶和底物ABTS 的親和力，使其Km值由野生型漆酶中的0.252 mmol/L 降低到0.098 mmol/L。Enguita 報道[34]結(jié)合口袋里面位于227、208、418 和442 的氨基酸殘基也會影響底物與酶的親和力。Xu 等[42]對短小芽孢桿菌W3CotA 漆酶的S208G 和F227A 的雙重突變，提高ABTS 與酶的親和力，將Km值由0.241 mmol/L 降低到了0.073 mmol/L，進而提高催化效率；T418K/Q442A 的雙重突變可以降低ABTS 和燃料活性黑5 的Km值，提高催化效率[43]。

但是也有學(xué)者指出，上面由Enguita 等[34]提出的底物與酶的結(jié)合模型并不符合理論計算出的電子云的分布[44]。2016 年，Liu 等[45]也匯報了CotA 酶結(jié)合ABTS 的一個新的結(jié)合位點，Liu 等推測Enguita等[34]提出的結(jié)合口袋可能是底物氧化后的產(chǎn)物與酶結(jié)合的位點。利用酶的結(jié)合口袋預(yù)測網(wǎng)站[46]對CotA 酶的結(jié)合位點進行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示有兩個得分相等且最高的結(jié)合位點，而這兩個結(jié)合位點分別為Liu 等[45]和Enguita 報道[34]的結(jié)合位點。此外，用AutoDock-Vina 虛擬對接軟件[47]，在兩個結(jié)合位點上進行虛擬對接，結(jié)果顯示在兩個位點均能形成穩(wěn)定的結(jié)合形態(tài)。

由于漆酶能夠氧化各種不同性質(zhì)和大小的芳香族化合物，以及多種無機化合物，如低價金屬離子等。因此，漆酶往往缺乏獨特的底物結(jié)合方式，而具有廣闊的結(jié)合袋，其往往能夠容納一種以上的底物。酶和底物結(jié)合部位往往會靠近單核中心，底物會與單核中心銅結(jié)合的His 殘基中的咪唑環(huán)相互作用[48]。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)特點及定點誘變的實驗結(jié)果推測，Enguita 等[34]報道的結(jié)合口袋似乎更加合理。但是我們也注意到，Xu 等[42]證實的可以強烈影響底物與酶結(jié)合的207 和442 的兩個位點的氨基酸，并不處于Enguita 報道[34]ABTS 分子6?[40]以內(nèi)范圍。在Enguita 報道[34]的結(jié)合位點進行虛擬對接，模擬出來的ABTS 能量最低的分子構(gòu)象與報道的晶體結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象不同。所以CotA 與底物的具體結(jié)合形式仍然需要進一步的深入研究。

2.2 銅離子中心

一般情況下，漆酶中一個分子的蛋白會結(jié)合四個銅離子。而銅離子結(jié)合位點為多銅氧化酶類最保守的位置。根據(jù)銅離子結(jié)合位點可以將銅離子分成兩類。一類為單核中心，位于結(jié)構(gòu)域3 內(nèi)部，靠近底物氧化部位。一類為銅離子三核三角區(qū)，位于結(jié)構(gòu)域1 和結(jié)構(gòu)域3 的結(jié)合界面，是氧氣還原為水的催化部位[36]（圖1）。

2.2.1 單核中心 CotA 中的單核I 型銅位點具有其他多銅氧化酶在該位點的典型幾何結(jié)構(gòu)（圖1b），單核I 型銅離子與兩個組氨酸、一個半胱氨酸和一個蛋氨酸結(jié)合，呈現(xiàn)出扭曲的雙錐體幾何結(jié)構(gòu)，還有一個空置的軸向位點用于結(jié)合還原底物。其中半胱氨酸和銅原子之間形成配體-金屬的S（π）→Cu（dx2-dy2）電荷轉(zhuǎn)移，使得單核I 型銅離子在600 nm 左右具有一個的強烈吸收帶，賦予CotA 酶強烈的藍色，同時在電子順磁共振（EPR）光譜中具有一個狹窄的平行超精細分裂[A_=（43?90）×10?4cm?1][49]。這也是漆酶又被稱之為藍酶的原因。

而與銅離子結(jié)合較弱的軸向配體氨基酸，在CotA 中第502 號的氨基酸殘基的種類和周圍環(huán)境卻是決定該部位氧化還原電位的主要因素，且可以顯著地影響漆酶酶活。高的氧化還原電位有助于電子從底物向單核中心銅離子進行轉(zhuǎn)移，一般認為高的氧化還原電位可以提高漆酶活性[50]，但是其氧化還原電位的高低與催化能力又并非簡單的線性關(guān)系，如來自Myceliophthora thermophila的MtL 漆酶的氧化還原電位比來自Rhizoctonia solani的RsL 漆酶低250 mV，但是其轉(zhuǎn)化常數(shù)卻高8 倍以上[51]，這一現(xiàn)象在CotA 中也有所體現(xiàn)。Dur?o 等[52]將502 號位置的氨基酸進行了突變，研究此位點對氧化還原電位和催化能力的影響，結(jié)果證實M502L 和M502F 突變可以將單核中心銅離子的氧化還原電位提高100 mV左右，卻使CotA 酶的kcat 降低了2～4 倍。另外單核中心銅離子周圍氨基酸的疏水特性會大幅度地影響氧化還原電位的高低。Dur?o 等[53]研究附近微環(huán)境的疏水性對氧化還原電位的影響，通過將附近的疏水氨基酸386 位的亮氨酸和494 位的異亮氨酸突變成為親水性的丙氨酸，發(fā)現(xiàn)這種突變將會導(dǎo)致氧化還原電位分別下移約60～100 mV，并伴隨著該酶活的大幅下降。Koschorreck 等[54]對和CotA 同源且高度相似的地衣芽孢桿菌漆酶進行研究，發(fā)現(xiàn)緊挨軸向配體氨基酸的鄰近氨基酸的種類也會明顯影響漆酶酶活和表達量。Bu 等[55]通過易錯PCR 和定點突變對地衣芽孢桿菌的漆酶基因研究結(jié)果和Koschorreck等[54]的結(jié)論基本一致，相同位點的氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼岷?，酶活力、穩(wěn)定性和脫色能力均優(yōu)于野生型漆酶。

2.2.2 三核中心 銅離子三核三角區(qū)為氧氣還原成水的反應(yīng)部位。主要組成是三個銅離子呈現(xiàn)一個不等邊三角的平面結(jié)構(gòu)，三條邊的長度分別為4.7 ?、4.0 ?和3.7 ?。氧氣通過氧氣通道進入催化中心，分布在最長邊的中點附近的位置，在兩個銅離子之間起到一個橋接作用。兩個銅離子和氧氣的橋接配體結(jié)構(gòu)賦予反鐵磁耦合，因此在電子順磁共振（EPR）光譜中沒有信號，但是在330 nm 處存在一個顯著的特征吸收帶。氧分子中的一個氧原子靠近第三個銅離子。而第三個銅離子在光譜中無任何吸收帶，但是在電子順磁共振（EPR）光譜中表現(xiàn)出較一個較大的平行超正弦分裂[A_=（150?201）×10?4cm?1][49]。

在漆酶中存在的四個銅離子，根據(jù)他們的光譜特性將其分成三類。其中具有600 nm 吸收峰特征，并且賦予漆酶藍色的單核中心的銅離子為type1；而在三核三角區(qū)的銅離子，無任何吸收峰的銅離子為type2；而與氧分子進行橋接，且在330 nm 處有一個肩峰特性的兩個銅離子，為type3。三核三角區(qū)的三個銅離子和四個HXH 的序列基序中的8 個組氨酸相結(jié)合。在CotA 一級結(jié)構(gòu)的四個特征蛋白基序，都是漆酶中的銅離子結(jié)合特征。105～108 位置的HLHG基序中，H105 與type2 銅離子結(jié)合，而H107 與type3（1）銅離子結(jié)合；153～155 位置的HDH 基序，H153 與type3（1）銅離子結(jié)合，而H155 與type3（2）銅離子結(jié)合；419～424 位置的HPIHLH 基序，H419與type1 銅離子結(jié)合，H422 與type2 銅離子結(jié)合，H424 與type3（2）銅離子結(jié)合；491～502 位置的HCHILEHEDYDM，其中H491 與type3（2）銅離子結(jié)合，C492 與type1 銅離子結(jié)合，H493 與type3（1）銅離子結(jié)合，H497 與type1 銅離子結(jié)合，M502 與type1 銅離子結(jié)合。491～493 位置上的HCH 基序是連接type1 銅離子與三核三角區(qū)之間的一個電子連接橋。HCH 也是這類酶中最保守的序列，任何氨基酸的改變都將引起三核三角區(qū)的變形或者type1 銅離子的還原，進而導(dǎo)致酶活的喪失[56]。

2.3 通道

在CotA 酶中，存在兩個直接到達三核三角區(qū)的分子通道（如圖1 所示）。這兩個通道都充滿了溶劑分子。其中一個通道靠近type3 銅離子，被看作是氧氣通道（圖1d），通道內(nèi)被用氫鍵連接的3 個水分子占據(jù)，其中Asp501 位于蛋白表面，隨后是D499 和E498。最靠近蛋白表面的水分子同時與D501 和E498 形成氫鍵，中間的水分子與D499、A158 之間形成氫鍵，而在通道最內(nèi)部的水分子則可以和E498、S160 和H155 之間形成氫鍵，其中H155 同時與三核三角區(qū)連接。氧氣通過這個通道到三核三角區(qū)并在此處發(fā)生催化反應(yīng)而將氧氣還原成水分子。氧氣分子推測是采用擴散的方式通過通道到達銅離子的三核三角區(qū)[33]。水通道表面501 位氨基酸殘基種類可能會通過影響氫鍵的形成及蛋白質(zhì)折疊的方式，進而影響漆酶的催化活性及漆酶在大腸桿菌中的表達[57]。在氧氣通道底部的Glu498 可能參與了氫質(zhì)子的傳遞，此位置氨基酸的改變將直接導(dǎo)致漆酶活性喪失[36]。

另外一個通道靠近type2 銅離子，一般被認為是產(chǎn)物水分子排出蛋白質(zhì)內(nèi)部的通道（圖1e）。最靠近蛋白表面的水分子同時與L423 和V426 形成氫鍵，中間的水分子同時與H422、G108 和一個type3 銅離子之間形成氫鍵，而在通道最內(nèi)部的水分子則可以和 L425、D116 和 G109 之間形成氫鍵，其中 D116對漆酶酶活具有重要影響，雖然D116 是靠近三核三角區(qū)的第二個存在質(zhì)子化可能的氨基酸殘基，但是在反應(yīng)體系中并未被質(zhì)子化，沒有參與氫質(zhì)子的傳遞，而是通過改變?nèi)巳菂^(qū)的微環(huán)境進而調(diào)節(jié)Glu498的質(zhì)子化和TypeII 銅離子和羥基結(jié)合的方式而影響漆酶酶活性[58]。

3 原核漆酶的催化過程

漆酶催化反應(yīng)可以分為兩種方式，第一種是與其它酶類一樣的直接催化方式，底物和酶的催化中心結(jié)合，然后被酶直接氧化成為底物的氧化態(tài)，這樣的催化方式針對的是小分子底物，如各種酚類等。第二種是漆酶所特有的一種氧化方式，主要是漆酶通過化學(xué)介導(dǎo)物將一些因為體積太大無法接觸到酶活性中心的大分子物質(zhì)，或氧化還原電位高于漆酶本身的一些高氧化態(tài)底物進行氧化的方式。

3.1 對底物直接催化反應(yīng)過程

CotA 酶作為原核漆酶中研究最為透徹的一種漆酶，其催化反應(yīng)過程也較為清晰（見圖2）。一般可以認為底物ABTS 處于CotA 酶中的結(jié)合口袋中，其中的氨基酸殘基Gly323 通過氫鍵將底物ABTS 固定到催化位點（圖2）；然后電子將從底物出發(fā)，借助His497 傳遞給單核中心的銅離子；單核中心的銅離子又通過一個His-Cys-His 的電子橋?qū)㈦娮觽鬟f給固定在三核三角區(qū)內(nèi)的氧分子。氧氣還原過程中需要的氫質(zhì)子，可能來源于位于氧氣通道底部的被質(zhì)子化的氨基酸殘基Glu498[36]。在三核三角區(qū)附近，只有兩個氨基酸殘基存在提供氫質(zhì)子的可能性，一個是位于氧氣通道底部的Glu498，一個是位于水通道底部的Asp116。而這兩個氨基酸在反應(yīng)的體系中，只有Glu498 可以被質(zhì)子化，所以Glu498 可能是氫質(zhì)子的唯一提供者[36]。氧分子則是通過充滿溶劑的一個水溶性通道，從蛋白表面擴散到了三核三角區(qū)內(nèi)部的兩個type3 銅離子中間位置[59]，在那里氧氣經(jīng)過一系列的復(fù)雜反應(yīng)被還原為水分子[60?62]。生成水分子，將會被type2 銅離子帶入水分子通道，進而排出蛋白質(zhì)內(nèi)部[63]。

圖2 CotA 漆酶的反應(yīng)機制Fig.2 Reaction mechanism of CotA laccase

氧氣在三核三角區(qū)還原成水的反應(yīng)是一個復(fù)雜的反應(yīng)體系。現(xiàn)在推測其過程大概為，氧氣進入還原態(tài)的三核三角區(qū)兩個type3 銅離子之間，和兩個type3 的銅離子形成橋聯(lián)配體；兩個電子的傳入使得氧氣形成過氧化物中間物（Peroxide intermediate，PI）；再傳入兩個電子和兩個氫質(zhì)子后，該中間物將分裂為兩個羥基；其中一個羥基分子向水分子出口通道遷移，被質(zhì)子化后生成水進入水通道排出蛋白體外；另外一個羥基和兩個type3 銅離子連接形成所謂的本地中間物（Native intermediate，NI），本地中間物隨后遷移到type2 的銅離子上，被質(zhì)子化后生成水分子，最后作為第二個水分子被釋放，同時酶恢復(fù)到原始狀態(tài)[36,58?59,64?65]。

3.2 化學(xué)介導(dǎo)體系的催化機理

1990 年Bourbonnais 等[66]首先報道了在添加ABTS的情況下，可以利用漆酶氧化非酚類木質(zhì)素的實驗結(jié)果。在此基礎(chǔ)上發(fā)展建立了漆酶的化學(xué)介導(dǎo)反應(yīng)體系（Laccase mediator system，LMS）。LMS 體系極大地擴大了漆酶的作用范圍，也是漆酶最引人注意的特性之一。LMS 體系的催化機理迄今為止還不是十分清楚。但其催化反應(yīng)過程一般認為漆酶是單電子氧化還原酶，它催化底物機理表現(xiàn)在底物自由基的形成和漆酶分子中4 個銅離子的互相協(xié)同作用[67]。漆酶催化氧化多種酚類或者非酚類底物時，可以將其氧化成相應(yīng)的自由基[68]。這些形成自由基的化學(xué)物質(zhì)，成為重要的中間體，能夠從漆酶上面游離到反應(yīng)溶劑中，再與體積龐大或高氧化還原電位的底物相互作用[7]。天然及合成的介體物質(zhì)有100 多種，其中研究最多的介體是ABTS 和1-羥基苯并三唑（HBT）。在氧化過程中，ABTS 被氧化為ABTS+中間體；而HBT氧化為 HBT+，然后立即去質(zhì)子化形成 N-氧自由基[69]，ABTS+中間體和N-氧自由基進一步將底物氧化，中間體再次轉(zhuǎn)化為漆酶氧化底物。

4 原核漆酶的理化性質(zhì)

4.1 溫度

原核漆酶是一種可以在較為廣泛的溫度范圍下發(fā)揮作用的氧化酶。原核漆酶最適反應(yīng)溫度在40～92 ℃之間。部分原核漆酶可以在高溫條件下保留較高的酶活性。但不同種類原核漆酶的反應(yīng)最適溫度存在顯著差異，這與漆酶的不同來源有關(guān)。Lu等[70]從土壤中的地衣芽孢桿菌中分離純化出LS04漆酶。該漆酶的反應(yīng)最適溫度為60 ℃，在40～70 ℃維持較高活性，在60 ℃下放置10 h 仍有44.56%的酶活力，在70 ℃半衰期超過4 h，在80 ℃放置10 h仍保持約16%的活性。Xiao 等[71]首次從白蟻腸道分離出一株具有木質(zhì)纖維素分解活性的平流層芽孢桿菌BCMC2，從菌株中克隆了一個漆酶基因BaCotA，該漆酶基因在大腸桿菌中得到功能性高效表達，并對其進行酶學(xué)性質(zhì)的研究。實驗結(jié)果表明：其BaCotA漆酶最適反應(yīng)溫度為70 ℃，在50 ℃下的半衰期大約3 h。Sherif 等[72]對天藍色鏈霉菌的一種漆酶SLAC進行研究。SLAC 漆酶最適反應(yīng)溫度為60～70 ℃，在80 ℃半衰期超過10 h，90 ℃半衰期超過7 h，具有良好的熱穩(wěn)定性。Sonica 等[73]發(fā)現(xiàn)在龍舌蘭芽孢桿菌（Bacillus tequilensisSN4）中有一種新的胞外漆酶SN4LAC 具有較高的熱穩(wěn)定性，該酶的最適反應(yīng)溫度為85 ℃，在70 ℃下放置24 h 可以保持80%以上的活性，100 ℃的半衰期為24 h。來自極端嗜熱菌的Thermus thermophilus[27]的漆酶其最適反應(yīng)溫度為92 ℃，在80 ℃下的半衰期超過了14 h。從極端嗜熱菌Aquifex aeolicus[28]中鑒別出McoA 漆酶最適反應(yīng)溫度為75 ℃，在80 ℃下的半衰期將近15 h。大多數(shù)真菌漆酶的最適溫度在30～50 ℃之間，熱穩(wěn)定性較差，適宜在溫和的環(huán)境條件使用。然而，大多數(shù)工業(yè)操作是在極端條件下進行的，真菌漆酶通常無法在這些極端環(huán)境中工作，因此原核漆酶在工業(yè)應(yīng)用上有巨大的研究潛力。

4.2 pH

在實際工業(yè)應(yīng)用中，環(huán)境pH 的范圍具有不確定性。為了在實際應(yīng)用中保證漆酶的有效性，確定漆酶的最適pH 和不同pH 條件下的穩(wěn)定性非常重要。Guan 等[74]從茴香蜂蜜樣品中分離出一株具有漆酶活性的枯草芽孢桿菌X1，并從中克隆出來漆酶基因，該基因可以在大腸桿菌中有效表達。結(jié)果表明：該漆酶顯示出在廣泛pH 范圍均具有較高的酶活，和在堿性pH 環(huán)境下的高穩(wěn)定性。該漆酶對不同底物反應(yīng)的pH 范圍不同，最適pH 也有所不同。該漆酶以ABTS、SGZ、2,6-DMP（2,6-二甲氧基苯酚）為底物反應(yīng)最適pH 分別為4.4、6.9、7.3。其穩(wěn)定性研究表明該酶在pH7.0 和pH9.0 下高度穩(wěn)定，37 ℃ 下放置10 d 后分別保留約 126% 和 163% 的初始活性。Lu等[70]研究來自地衣芽孢桿菌的LS04 漆酶，該酶以ABTS、SGZ、2,6-DMP 為底物最適pH 分別為4.2、6.6、7.4。在 30 ℃下放置10 d，該酶在 pH7.0 和 pH9.0條件下分別保有初始活力的123%和102%。說明該酶在中性和堿性條件下都具有較高的穩(wěn)定性。Singh 等[75]研究的耐堿性c-蛋白桿菌JB 漆酶在pH9.0（Tris-HCl，0.1 mol/L）、10.6（甘氨酸-氫氧化鈉，0.1 mol/L）和4.0（檸檬酸，0.1 mol/L）條件下，4 ℃放置60 d，分別可以保留初始酶活100%、60%和49%。原核漆酶的最適pH 通常是中性和堿性，而大多數(shù)真菌漆酶的最適pH 為2～5。在中性和堿性的環(huán)境下，相比于真菌漆酶，原核漆酶更加適用。

4.3 金屬離子

金屬離子是常見的環(huán)境污染物，很多金屬離子對酶的活性及其穩(wěn)定性有一定的影響。Xiao 等[71]研究了三種濃度（1、5、10 mmol/L）的金屬離子對BaCotA 漆酶活性的影響。BaCotA 漆酶在1 mmol/L濃度金屬離子下相對穩(wěn)定，在Ba2+、Ca2+、K+、Li2+、Mg2+、Mn2+、Na+和Zn2+存在時，25 ℃放置30 min能保持初始酶活的80%以上，5 mmol/L 和10 mmol/L濃度金屬離子則對漆酶活性具有明顯的抑制作用。Fe2+在任何濃度下對BaCotA 的都具有較強的抑制作用。據(jù)報道，Cu2+能夠提高漆酶活性[76]，然而該研究中Cu2+在所有受試濃度下都對漆酶活性有抑制作用。Javadzadeh 等[77]從白蟻腸道中分離的共生芽孢桿菌中分離純化了一種漆酶，命名為CF96。在60℃下將漆酶CF96 放置在1、5、10 mmol/L 濃度的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ba2+、Na+、Mg2+和Ni2+下1 h 后，發(fā)現(xiàn)氧化離子Cu2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+提高了漆酶活性，Ba2+、Na+、Mg2+和Ni2+降低了漆酶活性。Sonica 等[73]研究發(fā)現(xiàn)SN4LAC 漆酶在37 ℃、含有5 mmol/L Cu2+和Co2+的環(huán)境下酶活分別提高了126%和150%，在其他金屬離子Ca2+、Ni+、Li2+、Mg2+、Mn2+、Na+和Zn2+存在的情況下，SN4LAC 漆酶能保持初始酶活的70～80%活性。Hg2+和Fe2+對SN4LAC 漆酶活性有抑制作用，抑制率分別達到27%和40%。Zhang 等[78]從枯草芽孢桿菌 fmb-103 中純化了一種FMB-L103 漆酶。在37 ℃、Cu2+濃度在5 mmol/L 濃度下放置10 min，可以將FMBL103 漆酶酶活提高約60%；而金屬離子由Cu2+替換成了Ca2+、Mg2+和Mn2+時，漆酶活性只有少量提高，而換成Zn2+、Fe2+和K+時，酶活受到了抑制，其中Zn2+抑制作用最強。真菌漆酶會受到銅離子、鐵離子、錳離子等金屬離子的抑制從而降低活性[79]，而原核漆酶在這一方面有較好的表現(xiàn)。

4.4 有機溶劑及抑制劑

研究發(fā)現(xiàn)部分有機溶劑和抑制劑對漆酶活力有一定影響。原核漆酶在有機溶劑和抑制劑中有極大的穩(wěn)定性，在含有有機溶劑和抑制劑的惡劣環(huán)境下可以起到很大作用。Siroosi 等[80]從伊朗西北部的高鹽湖烏爾米亞湖中分離得到一株產(chǎn)漆酶的耐鹽芽孢桿菌WT，研究顯示：該漆酶在1 mmol/L 的NaN3中仍保持97.5%的酶活力，NaN3是有效的漆酶抑制劑。但漆酶在1 mmol/L 的L-半胱氨酸中受到抑制，喪失了87%的活力。Uthandi 等[29]從嗜鹽古細菌中分離得到一種耐熱、耐鹽、耐溶劑的LCCA 漆酶，對LCCA 漆酶進行重組并在其原生物體嗜鹽古細菌中高效表達，純化后的LCCA 漆酶在常用的水溶性有機溶劑甲醇和乙醇中反應(yīng)24 h 保持約75%的活性、在DMSO（二甲基亞砜）和DMF（二甲基甲酰胺）中反應(yīng)24 h 后仍保持50%以上的活性。1 mmol/L NaN3可以抑制50%的漆酶活性，0.1～1 mmol/L 的L-半胱氨酸和DTT（二硫蘇糖醇）都對LCCA 有強抑制作用。一般的螯合劑EDTA（乙二胺四乙酸）在50 mmol/L 對LCCA 活性無抑制作用，但過渡金屬螯合劑2,2-聯(lián)吡啶和1,10-菲洛啉在10 mmol/L 濃度下可抑制LCCA 活性，分別降低了25%和90%。馬小建[81]對大腸桿菌中的CueO-p 漆酶進行突變，突變體的酶活力都有所提高。對突變體進行有機溶劑和抑制劑的測定，在4 ℃放置30 min 測其酶活。CueO-p 漆酶在2.5 mmol/L 濃度的DTT 下仍保持68%的初始活性，NaN3和EDTA 都對其有強抑制作用，10 mmol/L 的NaN3抑制了漆酶97%左右的活性，2.5 mmol/L EDTA 降低了93%的酶活。CueO-p漆酶在常用有機溶劑甲醇和乙醇中保持了約90%的活性。在10%的丙酮和異丙酮中有較好的穩(wěn)定性。在30%的乙腈中受到抑制，損失了58%的初始活性。

5 原核漆酶的應(yīng)用

5.1 食品行業(yè)

5.1.1 葡萄酒穩(wěn)定 葡萄酒中含有高濃度的酚類化合物，如苯乙烯酸、肉桂酸衍生物、兒茶酚、花色素黃烷、香豆酸衍生物和花色素等。酚類物質(zhì)的存在對葡萄酒的質(zhì)量具有重要影響。Czyzowska 等[82]發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)的含量隨著葡萄酒釀造或儲存時間的延長而減少，從而改變葡萄酒的色澤。酚類物質(zhì)的氧化，也是導(dǎo)致葡萄酒質(zhì)量下降主要因素。傳統(tǒng)上采用交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮去除酚類物質(zhì)，但是這種方法缺少選擇性，不能較好地保留葡萄酒的風(fēng)味、色澤，還會增加工業(yè)廢水排放污染環(huán)境。采用漆酶進行多酚去除，可以達到選擇性的去除的效果，在提高產(chǎn)品質(zhì)量的同時，避免葡萄酒的感官特性發(fā)生不必要的改變，成為傳統(tǒng)工藝中有效的一種替代方案。在葡萄酒生產(chǎn)過程中添加適量的漆酶，其氧化酚類物質(zhì)后其產(chǎn)物會聚合并通過澄清工藝去除，進而起到穩(wěn)定葡萄酒的作用。在葡萄酒保存期間，可以添加漆酶選擇性地氧化分解酚類物質(zhì)，進而延長葡萄酒貨架期[83]。Conrad 等[84]還將嗜熱支原體的漆酶用于制備酒瓶的軟木塞。在這個過程中，漆酶氧化酚類物質(zhì)，釋放的苯氧基自由基進行非酶促均聚，避免了導(dǎo)致軟木味道的2,4,6-三氯苯甲醚的產(chǎn)生。這種氧化聚合還修飾了軟木塞的表面，增加了軟木塞的疏水性，降低了陳年瓶裝葡萄酒中經(jīng)常出現(xiàn)的軟木塞污染。而這種工藝已經(jīng)成功的商業(yè)化。

5.1.2 啤酒穩(wěn)定化 啤酒經(jīng)長期儲存后，里面的多酚物質(zhì)會發(fā)生聚合形成大顆粒，從而產(chǎn)生沉淀變得渾濁，影響啤酒品質(zhì)。啤酒的儲存期霧氣形成取決于多酚與蛋白質(zhì)含量、溫度和氧氣含量等因素，霧氣是由于自然產(chǎn)生的原花青素和多酚物質(zhì)和蛋白結(jié)合而生成的沉淀，這種霧氣通常是在冷卻過程中出現(xiàn)，在常溫或更高溫度下就會自動溶解[85]，Pezzella 等[86]在成品啤酒中通過加入微生物漆酶，去除酚類物質(zhì)的同時也可以達到去除多余的氧氣效果，防止生產(chǎn)異味產(chǎn)物反應(yīng)的發(fā)生，減少異味化合物如反式-2-壬烯醛的生產(chǎn)量，使啤酒達到長期儲存的效果。

5.1.3 果汁加工 從20 世紀30 年代開始，人們就研究通過酶制劑來澄清果汁。在研究中使用漆酶來去除由蛋白質(zhì)和多酚之間相互作用形成的渾濁和沉淀，從而達到澄清果汁的效果。除此之外，在儲藏過程中果汁會二次沉淀從而影響果汁的澄清度[87]。喬曉蘭等[88]在濃縮蘋果汁的酶解過程中加入漆酶利用其專一性除去酚類，并研究了漆酶的酶解溫度和時間以及漆酶的添加量對去除酚類物質(zhì)的影響。最近Huang 等[89]制備了一種基于銅離子和一磷酸腺苷的漆酶模擬酶（AMP-Cu 納米酶），采用這種漆酶模擬酶反應(yīng)5 h 時，對果汁中苯酚的去除率可以達到65%。結(jié)果表明：AMP-Cu 納米漆酶模擬酶可以有效去除果汁中的酚類物質(zhì)，有良好的應(yīng)用前景。

另外，漆酶還被研究用于烘焙行業(yè)，可以改善面團的稠度和可加工性[90]；合成止痛藥、鎮(zhèn)靜劑、消炎藥和抗生素[91]；通過模擬工業(yè)化生產(chǎn)的過程評估了漆酶對攪拌牛奶酸奶的影響[92]等。與真菌漆酶相比，原核漆酶更加穩(wěn)定，應(yīng)加大原核漆酶在食品應(yīng)用的研究，發(fā)揮原核漆酶的優(yōu)勢。

5.2 造紙行業(yè)

在紙的工業(yè)制備中，木漿中木質(zhì)素的分離和降解通常使用氯和氧基化學(xué)氧化劑，但是具有很高的危險性，并且會污染環(huán)境。Sondhi 等[93]探索了來自龍舌蘭芽孢桿菌（Tequilensis）SN4 的胞外熱堿穩(wěn)定漆酶用于紙漿生物漂白。在無N-羥基苯并三唑介體的情況下，紙張白度提高了7.6%，木質(zhì)素含量降低了28%；在介體的存在下，紙張白度提高了12%，木質(zhì)素含量降低了47%。Virk 等[94]研究表明，舊新聞紙可以通過物理方法和酶法（漆酶和木聚糖酶）相結(jié)合的方法進行回收，使紙張白度提高28.8%，ERIC 含量降低73.9%。鄭志強[95]從極端嗜熱細菌（Thermus thermophilus）HB27 菌株中分離出一株耐熱性胞內(nèi)Tth-laccase 漆酶，通過定點突變技術(shù)使漆酶活力提高了86 倍，并且首次在麥草漿生物漂白中應(yīng)用Tthlaccase 重組漆酶。結(jié)果表明：在最佳酶漂白條件下將紙漿處理1.5 h，紙漿白度增加3.3%，ISO 卡伯值降低了5.6，在不損傷紙漿纖維的情況下提高了麥草漿的漂白度。原核漆酶在造紙工業(yè)中的漂白應(yīng)用雖然得到關(guān)注和研究，但想再造紙工業(yè)中大規(guī)模實際應(yīng)用仍需努力。需要對原核漆酶的機理和對紙漿纖維的作用有更多更好的了解，改進工藝，使其在現(xiàn)有的操作條件下重復(fù)使用。也可以研究原核漆酶在造紙工業(yè)中更多的應(yīng)用，在生物制漿和生物漂白以及處理造紙廠廢水中有更多的創(chuàng)新解決方案。

5.3 紡織行業(yè)

紡織工業(yè)廢水造成了很嚴重的污染問題，并且需要用大量的水和化學(xué)品去除，而合成的染料很難脫色，漆酶能夠降解酚類、芳香胺、各種官能團的取代化合物以及非酚類化合物。因此，漆酶可以在紡織工業(yè)中用于去除紡織品中的染料和酚類物質(zhì)。因真菌漆酶有更大的氧化還原潛力而被廣泛用于降解紡織廢水中存在的染料。但由于原核漆酶具有產(chǎn)酶時間短、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，原核漆酶也被應(yīng)用于降解紡織染料。張應(yīng)玖等[96]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌ZXN4 中細菌漆酶CAH4 在工業(yè)染料脫色上有較高的實用價值，對偶氮類染料、靛藍類染料和三苯甲烷類染料有很強的脫色能力，容易實現(xiàn)工程化制備，有廣闊的應(yīng)用前景。Verma 等[10]使用熱鏈地桿菌MS5 的漆酶成功地脫色了紡織品染料，特別是溴酚藍和剛果紅，在不同的碳源中對商用的紡織品染料進行脫色，也有良好的脫色效果。Wang 等[97]研究表明：CotA 重組漆酶對模擬紡織廢水（STE）48 h 的脫色率為77.0%，在中性pH 緩沖條件下，純化后的CotA 漆酶比粗制CotA 漆酶的脫色率要高得多。Panwar 等[98]分離出一株耐熱、耐鹽、嗜酸的漆酶LACT，將其應(yīng)用于牛仔的漂白中。LACT 的牛仔漂白效果很好，其漂白效果明顯優(yōu)于已報道的其他漆酶[78,99]。LACT 對水溶性對健康有害的偶氮染料也有顯著的脫色效果，是一種很有前途的生物漂白和染料脫色劑。Liu 等[100]為了改善紡織染料的去除，通過氧化應(yīng)激增強短小芽孢桿菌ZB1 的生物活性，添加甲磺酸甲酯（MMS）進行誘導(dǎo)，促進了短小芽孢桿菌ZB1 的漆酶表達，并改善了漆酶對合成染料的脫色，可以實現(xiàn)對偶氮染料的有效降解。原核漆酶可以在高溫、高堿、含有機溶劑等極端環(huán)境的紡織廠廢水中進行生物修復(fù)，可以對原核漆酶在這一領(lǐng)域進行進一步的研究和創(chuàng)新，以開發(fā)快速生物降解技術(shù)。

5.4 降解污染物和生物傳感器

空氣、土壤和水等自然環(huán)境中都分布著污染物，漆酶參與生物降解主要是由于它的催化性能，細菌漆酶可以降解土壤中的外源化合物。劉銳等[101]發(fā)明公開了一種利用細菌漆酶降解有機磷農(nóng)藥的方法，主要是在25～35 ℃，pH8～10 條件下，在產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基中加入Cu2+和介體，分別加入濃度為0.2%左右的有機磷農(nóng)藥，包括樂果、敵敵畏、敵百蟲、毒死蜱、氧化樂果，在幾個小時內(nèi)有機磷農(nóng)藥降解率可高達15%以上。Cheng 等[102]克隆了枯草芽孢桿菌CotA漆酶基因，并在大腸桿菌中高效表達，以提高其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中修復(fù)孔雀石綠（MG）的濃度。CotA 漆酶能有效，安全地降解文蛤和羅非魚養(yǎng)殖廢水中的MG，并在淡水和鹽水條件脫色率高達90～94%。同時CotA 漆酶處理的MG 溶液在石斑魚鰭細胞上的脫色率達90%以上，且無細胞毒性，證實了其安全性。Murugesan 等[103]從造紙廠廢水中篩選出了一株芽孢桿菌屬的細菌漆酶PK4，它具有良好熱穩(wěn)定性，對其產(chǎn)量進行優(yōu)化。通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化，漆酶產(chǎn)量提高了11.8 倍，可以更有效地應(yīng)用于工業(yè)廢水的生物修復(fù)和廢水處理。氯酚是生產(chǎn)染料、防腐劑、農(nóng)藥和化學(xué)品的重要工業(yè)原料。然而，工業(yè)廢水中含有氯酚等難降解有機物，對環(huán)境和人體健康危害嚴重。漆酶介導(dǎo)的氯酚去除是一種低成本、環(huán)保、高效的生化法。Menaka 等[104]篩選出一株可以降解2,4-二氯苯酚的細菌漆酶并鑒定出其為枯草芽孢桿菌。該酶對外源化合物2,4-二氯苯酚有良好的降解能力，并且有酶處理周期短的優(yōu)點，在廢水降解方面有潛在用途。由于漆酶能夠催化直接電子轉(zhuǎn)移，多年來人們一直在研究漆酶在生物燃料電池和生物傳感器中的應(yīng)用[105]。在生物傳感器方面，漆酶將O2還原為H2O，然后生物傳感器記錄分析氧化過程中的耗氧量。漆酶基于傳感器已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)嘗試檢測果汁、葡萄酒和茶中的多酚，并量化葡萄汁中的真菌污染[106]。Chawla 等[107]將漆酶共價鍵固定在銀納米顆粒和氧化鋅納米顆粒的納米復(fù)合材料上，去除多酚物質(zhì)，并構(gòu)建了一種高敏感電流型生物傳感器，用于葡萄酒中總酚類化合物的測定。酶的生產(chǎn)成本是基于酶的生物質(zhì)降解過程中經(jīng)濟性的主要因素，取決于宿主細胞和純化方法。如果酶通過固定化在多個工藝循環(huán)中重復(fù)使用，這種成本可以降到最低。因此，可以將原核漆酶與固定化相結(jié)合，使原核漆酶可以應(yīng)用于開發(fā)具有成本效益的生物技術(shù)工藝。

6 展望

雖然現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了非常多的原核漆酶，但是關(guān)于原核漆酶的生理功能仍然不清楚。具體的生理功能有待于進一步研究。原核漆酶具有良好的性質(zhì)在工業(yè)上更有發(fā)展?jié)摿?，但在其?yīng)用方面的研究還有待加強。與真菌漆酶相比，原核漆酶大規(guī)模應(yīng)用的缺點是表達水平和催化活性較低，介體價格高、低成本生產(chǎn)大量高活性酶的能力不足。為了滿足工業(yè)化對高表達水平、高催化活性、高穩(wěn)定性和降低生產(chǎn)成本的需求，原核漆酶工程受到了眾多研究人員的關(guān)注。原核漆酶的未來研究方向可以考慮以下方面：一、挖掘新的原核漆酶基因或?qū)F(xiàn)有的漆酶轉(zhuǎn)化為新的酶；二、通過定點突變提高原核漆酶的功能表達和催化效率，降低成本；三、使用易于重復(fù)使用和回收的新型環(huán)保納米材料開發(fā)固定化漆酶，提高原核漆酶穩(wěn)定性和活力。