環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶合成AA-2G反應條件初探

何亞妹，劉振楊，鄭 婉，蘇瑞陽，吳華偉

（長江大學生命科學學院，湖北荊州 434025）

維生素C（Vitamin C，VC）廣泛存在于水果蔬菜中，是人類和少數生物體內不可或缺的營養(yǎng)元素。它能保護人體免受氧化劑傷害、預防疾病和治療壞血病等[1]。但VC在氧氣、pH、金屬和熱量中容易降解，難以長期保存[2]，故限制了其他領域的應用。為改善VC的穩(wěn)定性，許多VC衍生物被相繼合成，如VC金屬鹽，VC脂類和VC糖苷類等[3]。其中VC糖苷類是對VC的C2、C3、C5 和C6 原子上進行糖基化修飾后獲得的VC衍生物[4]。2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗壞血酸（Ascorbic acid 2-glucoside，AA-2G）是VC的C2 原子上連接了一個吡喃葡萄糖苷而形成的衍生物，在所有的VC糖苷類衍生物之中，以AA-2G的藥理學研究最多，應用也十分廣闊，因為AA-2G是最理想的VC衍生物，是VC最好的替代品[5]，市場需求量較大。它除了具有與VC相同的活性外[6]，還具有良好的穩(wěn)定性和安全性，優(yōu)異的抗氧化性，容易被人體吸收，可用于化妝品、醫(yī)藥、食品等領域[7]，具有巨大的開發(fā)價值。

目前，AA-2G 的合成以生物酶法為主，與化學法相比生物法更高效，反應條件溫和，可用于連續(xù)生產，更適合工業(yè)化生產[8]。用于合成AA-2G 的酶有α-葡萄糖苷酶[9]、環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶[10]（Cyclodextrin glucosyltransferase，CGTase）、淀粉酶[11]、蔗糖磷酸化酶[12]和α-異麥芽糖基葡萄糖形成酶[13]。其中，CGTase 是一種多功能酶，且作為一種工業(yè)用酶，因其具有底物特異性高和轉化率高等優(yōu)點，被認為是合成AA-2G 最高效的酶，是催化合成AA-2G 的酶中應用最廣、研究最多的一種酶，已被廣泛用于AA-2G 工業(yè)生產[14]。其合成原理是將糖基供體的糖苷鍵轉移至糖基受體的C2 位點上生成中間產物AA-2Gn（n≤6），然后添加糖化酶水解混合物產生AA-2G 和其他副產物[15]。CGTase 能將多種糖基供體用于AA-2G 的合成，但產量受糖基供體的影響較大[16]。目前CGTase 催化合成AA-2G 存在轉化率低、酶產量低等問題，導致AA-2G 的生產成本高，限制了其廣泛應用[17]。所以優(yōu)化AA-2G 的合成是目前研究的熱點，如利用分子半侶共表達[18]，增加異源蛋白的可溶性表達，從而提高合成產量；余磊等[19]用全細胞催化方法生產AA-2G，產量達到了35.7 g/L；郭嬌梅[20]對CGTase 進行固定化后制備AA-2G，使酶可以重復利用并增強其穩(wěn)定性；對CGTase 進行分子改造[21?26]，提高酶的熱穩(wěn)定性和對底物的特異性，提高合成產物的特異性和產量；為了提高AA-2G 作為抗氧化劑的有效性，Violaine 等[27]研究了AA-2G和輔助抗氧化劑的協同作用。此外，有研究表明環(huán)糊精為AA-2G 合成的最優(yōu)糖基供體[28]，但由于環(huán)糊精價格昂貴導致生產成本過高，不適于大規(guī)模的工業(yè)生產，故選擇成本低的糖基供體對AA-2G 的生產具有重要意義。

目前國內缺少可用于AA-2G 工業(yè)化生產的酶，市場上的兩種商品化CGTase 僅由國外提供，價格十分昂貴，特別是在化妝品領域中，AA-2G 大部分來源于日本林原國際有限公司，占據壟斷地位。因此需要挖掘和改造適合生產AA-2G 的CGTase，本實驗室以前期構建的重組表達菌株為研究對象，首次將其用于AA-2G 的合成，探究其合成效果，同時，對合成AA-2G 的反應條件進行單因素優(yōu)化，選擇合適且成本低的糖基供體，確定最適的合成條件，以提高AA-2G 的產量，為尋找合適的工業(yè)用酶，加快工業(yè)化生產提供參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組菌株pET-28a（+）-cgt-T1/BL21（DE3）為本實驗室構建保存[29]；4,6-亞乙基-對硝基苯-α-D-麥芽七糖苷（4,6-Ethylidene-p-nitrobenzene-α-D-maltopeptide，EPS）、異丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷（Isopropylbeta-D-thiogalactoside，IPTG）、AA-2G 和VC標準品 上海源葉生物科技有限公司；甲醇 色譜純，美國TEDDIA 公司；VC、可溶性淀粉和葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍R250、酚酞 天津天力化學試劑有限公司；α-環(huán)糊精（Cyclodextrin，α-CD）、β-環(huán)糊精（Cyclodextrin，β-CD）、γ-環(huán)糊精（Cyclodextrin，γ-CD）梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；α-葡萄糖苷酶、糖化酶（100 U/mg）、牛血清白蛋白北京索萊寶科技有限公司；硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate，Kana）、麥芽糊精、麥芽糖 上海麥克林生化科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨 英國OXOID 公司；所用無機試劑和有機溶劑均為國產分析純；LB 培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g 溶解到1 L 去離子水，使用NaOH 調節(jié)pH 至7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

TE3102S，TE124S 電子分析天平 德國賽多利斯公司；MJ-54A 高壓滅菌鍋 美國施都凱公司；TU1900 紫外分光光度計 北京普析公司；IS-RDS3恒溫搖床 美國Crystal 公司；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；5417R 超速冷凍離心機 德國Fritsch 公司；SCIENTZ-IID 超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；DYCZ-24DN 雙垂直電泳槽、DYY-8C 型電泳儀電源 北京市六一儀器廠；Gel Doc EZ 凝膠圖像儀 美國BIO-RAD 公司；Ni-NTA His Bind Resin 親和純化柱 上海七海復泰生物科技有限公司；Millipore 超濾離心管 上海羽令過濾器材有限公司；PB-10 pH計 德國賽多利斯公司；HH-4 水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；X-30R 離心機 美國Beckman 公司；Water e2695 HPLC 高效液相儀 美國Water 公司；Enspire 酶標儀 鉑金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌株誘導表達及粗酶純化 在前期研究中確定了最佳誘導條件[29]，把重組菌株接種至30 mL 含終濃度為50 μg/mL Kana 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 過夜培養(yǎng)，然后按1%接種量轉接至1 L 含終濃度為50 μg/mL Kana 的LB 液體培養(yǎng)基中，當菌體濃度OD600達到0.80 時，添加終濃度為0.30 mmol/L 的IPTG 溶液，25 ℃，200 r/min 條件下，培養(yǎng)10 h。在4 ℃，10000 r/min 離心5 min，用0.01 mol/L PBS 緩沖液懸浮細胞，得到菌懸液，冰浴中超聲破碎，參數設置75%功率（總功率500 W），工作3 s，間歇6 s，總時長35 min。4 ℃，10000 r/min離心15 min，收集上清，即為粗酶液。

使用Ni-NTA His Bind Resin 親和純化柱，參照七海生物產品說明書對粗酶液進行純化。然后將目的蛋白流出液置于超濾離心管中，4 ℃，5000 r/min，離心40 min，進行除鹽和蛋白濃縮，得到純化酶，于?20 ℃保存。用SDS-PAGE 分析純化酶，使用10%的分離膠和5%的濃縮膠，取適量純化酶加入上樣緩沖液，混勻，煮沸10 min，8000 r/min 離心6 min，取上清液10 μL 上樣，5 μL Marker，80 V 電泳25 min，調電壓至120 V，電泳1 h 左右，然后將凝膠用考馬斯亮藍R250 染色液染色，再用脫色液脫色，最后用凝膠圖像儀觀察結果。采用Bradford 法[30]測定純化酶濃度，用于后續(xù)比酶活的測定。

1.2.2 純化酶β-環(huán)化活性的測定 參考Tesfai 等[31]的方法，對其稍加修改，測定其酶活與比酶活。取0.10 mL 適當稀釋的純化酶液（0.01～0.03 mg/mL），加入1.00 mL 的4%（w/v）淀粉溶液（使用pH6.0 的10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液配置），混勻，65 ℃水浴反應10 min，加入3.50 mL 30 mmol/L NaOH 溶液終止反應，再向混合物中加入0.50 mL 0.02%（w/v）酚酞溶液，室溫靜置15 min，550 nm 處測量吸光度。以蒸餾水為空白調零，滅活酶液為對照。一個酶活單位（U）的定義為上述條件下每分鐘生成1 μmolβ-環(huán)糊精的酶量。

1.2.3 純化酶歧化活性的測定 參考Vanderveen 等[32]的方法，對其稍加修改，測定其酶活與比酶活。取1.00 mL 6 mmol/L 的EPS 和10 mmol/L 的 麥芽糖（用10 mmol/L pH6.0 磷酸鹽緩沖液配制）的混合底物，65 ℃預熱10 min 后，加入0.10 mL 適當稀釋的純化酶液（0.01～0.03 mg/mL），65 ℃反應10 min，取0.10 mL 混合反應物，加入20 μL 1.20 mol/L 的HCl溶液（4 ℃），60 ℃孵育10 min 失活，再加入20 μL 1.20 mol/L 的NaOH 溶液中和后，添加60 μLα-葡萄糖苷酶（1 U，使用10 mmol/L pH7.0 磷酸緩沖液溶解），37 ℃反應1 h，最后加入1.00 mL 1 mol/L Na2CO3溶液（調pH 至8 以上），401 nm 測定吸光度。以蒸餾水為空白調零，滅活酶液為對照。一個酶活單位（U）的定義為上述條件下每分鐘轉化1 μmol EPS 的酶量。

1.2.4 AA-2G 的酶法合成 參考韓瑞枝[33]的方法，將純化后的環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶用10 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH5.0）稀釋到蛋白質濃度為1.00 mg/mL，以5%（w/v）的純化酶液加入底物終濃度均為10 g/L 的VC和β-CD（糖基供體）的等比例（VC/糖基供體）混合的底物中（底物溶液使用10 mmol/L pH5.0 乙酸鈉緩沖液配制，VC溶液使用20% NaOH溶液調pH 至5.0），混合均勻，反應pH 為5.0。將混合物置于37 ℃（反應溫度）、黑暗、無氧的條件下恒溫反應24 h（反應時間）。最后將10 U 糖化酶（使用與配制底物相同的緩沖液進行配制）加入到反應混合物中，在60 ℃的條件下靜置24 h，使中間體AA-2Gn（其中n 是連接到L-抗壞血酸的糖基的數目）水解，最終得到AA-2G。

1.2.5 AA-2G 的標準曲線及定性與定量檢測 取5.00 mg AA-2G 標準品用pH2.5 的0.01 mmol/L 磷酸緩沖液定容至5 mL 容量瓶中，配制成1.00 g/L 的標準品溶液。再用標準品溶液和pH2.5 的0.01 mmol/L磷酸緩沖液配制濃度分別為0、0.025、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60 和0.80 g/L 的AA-2G 溶液。采用HPLC 色譜法檢測AA-2G[33]，色譜柱：Inertsil ODS-3 C18柱（5 μm，250×4.60 mm）；紫外檢測波長：238 nm；流動相：2%的甲醇和98% 0.01 mmol/L 磷酸緩沖液（85%磷酸調pH 至2.5）；流速：0.60 mL/min，進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃。HPLC 圖譜中AA-2G 的峰面積（uV·S）和濃度（g/L）成正比，以AA-2G 的峰面積為縱坐標，AA-2G 濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得到標準曲線公式：y=25901377x+24727，回歸系數R2=0.9994，可信度較高。

將反應結束后的反應混合物適當稀釋，8000 r/min，離心10 min，取上清液，并使用0.22 μm 濾膜過濾，得到反應液樣品，與AA-2G 和VC的標準品同時進行HPLC 檢測，參數同上。根據得到的色譜圖數據，對比標準品與反應液樣品出峰時間是否一致，對AA-2G 進行定性分析；將反應液樣品AA-2G 的峰面積代入標準曲線公式，得出AA-2G 的濃度，對AA-2G 進行定量分析。

1.2.6 AA-2G 的酶法合成條件初探 各因素的實驗水平設計均參考宋凱[34]的方法，對其稍加修改。

1.2.6.1 糖基供體對反應的影響 將AA-2G 酶法合成的糖基供體β-CD 分別更換為α-CD，β-CD，γ-CD，可溶性淀粉，麥芽糊精，麥芽糖和葡萄糖，其他條件與1.2.4 相同，反應產物使用HPLC 色譜法檢測AA-2G 的含量。

1.2.6.2 底物濃度對反應的影響 將AA-2G 酶法合成的底物終濃度分別更換為10、30、50、70、90 和110 g/L 的VC和糖基供體（可溶性淀粉和麥芽糊精），其他條件與1.2.4 相同，反應產物使用HPLC 色譜法檢測AA-2G 的含量，計算AA-2G 生成率。由于底物濃度不同，無法進行AA-2G 含量的比較，故選用AA-2G 生成率作為此優(yōu)化因素的比較依據。

AA-2G 生成率計算公式：

式中：A：不同底物濃度下AA-2G 生成率，%；c：對應條件下生成AA-2G 的含量，g/L；a：對應條件下底物VC的含量，g/L。

1.2.6.3 pH 對反應的影響 在最適底物濃度下，將AA-2G 酶法合成的反應pH 分別更換為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0（用10 mmol/L 的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制底物溶液）6.0、6.5、7.0（用0.01 mmol/L 磷酸緩沖液配制底物溶液），其他條件與1.2.4 相同，反應產物使用HPLC 色譜法檢測AA-2G 的含量。

1.2.6.4 溫度對反應的影響 在最適底物濃度和pH下，將AA-2G 酶法合成的反應溫度分別更換為23、30、37、44 和51 ℃，其他條件與1.2.4 相同，反應產物使用HPLC 色譜法檢測AA-2G 的含量。

1.2.6.5 底物比例對反應的影響 在最適pH 和溫度下，將AA-2G 酶法合成的底物比例（VC/糖基供體）分別更換為1/5、2/4、3/3、4/2、5/1，其他條件與1.2.4相同，反應產物使用HPLC 色譜法檢測AA-2G 的含量。

1.2.6.6 蛋白濃度對反應的影響 在最適pH，溫度和底物比例下，將AA-2G 酶法合成的蛋白濃度分別更換為1.0、5.0、10.0、15.0 和20.0 mg/mL，其他條件與1.2.4 相同，反應產物使用HPLC 色譜法檢測AA-2G 的含量。

1.2.6.7 時間對反應的影響 在最適pH，溫度，底物比例和蛋白濃度下，將AA-2G 酶法合成的反應時間分別更換為0、6、12、18、24、30、36 和42 h,其他條件與1.2.4 相同，反應產物使用HPLC 色譜法檢測AA-2G 的含量。

1.2.7 AA-2G 的酶法合成動力學分析 將糖基供體的不同底物濃度（2.0、4.0、8.0、16.0 g/L）進行固定，測定其不同濃度下VC（4.0、8.0、16.0、20.0、32.0 g/L）合成AA-2G 的產量，在最適反應溫度和pH 下，反應6 h，根據下面的公式[33]，計算出合成AA-2G 的動力學參數。

乒乓反應機制：

式中：V：不同底物濃度下的反應速率（每毫克酶每小時催化生成AA-2G 的量），g/L/mg/h；Vmax：反應的最大速率，g/L/mg/h；a：受體（VC）的濃度，g/L；b：糖基供體（麥芽糊精/可溶性淀粉）的濃度，g/L；KmA：VC的親和常數；KmB，糖基供體的親和常數；KiB：底物糖基供體的抑制常數。

1.3 數據處理

酶活性測定實驗每個反應重復3 次，單因素優(yōu)化實驗每個反應設置2 個平行，數據以平均數±標準差（mean±SD）表示。利用Excel 2019 進行數據處理和繪圖，利用SPSS 19.0 軟件進行數據統計分析，顯著性水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 CGTase-T1 的純化

CGTase-T1 經純化和脫鹽濃縮后，得到了分子量為75 kDa 的單一條帶（圖1），與大多數CGTase 的分子量相符[35]，說明得到了純化的環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶。

圖1 純化CGTase-T1 的SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electropherogram of purified CGTase-T1

2.2 酶活性測定

分別測定了純化酶的β-環(huán)化活性和歧化活性，測得純化酶的濃度為7.368 mg/mL，經計算得出其酶活與比酶活。如表1 所示，β-環(huán)化反應的酶活性最高，比酶活可達1169.40 U/mg。大多數的CGTase以環(huán)化反應為主活性，與本文結果相同，可能是由于CGTase 更喜歡吸附淀粉分子內部的α-1,4 鏈，然后轉移新形成的寡聚糖的還原端到自身的非還原端，產生α-1,4 環(huán)[36]。而且環(huán)化反應是CGTase 的特征反應，是一種分子內轉糖基反應，原理是將直鏈麥芽低聚糖上非還原末端的O-4 或C-4 轉移到同一直鏈上還原末端的C-1 或O-1 上，形成6-8 個糖基的環(huán)狀結構[37]。

表1 酶反應的環(huán)化和歧化反應的活性Table 1 Activity of cyclization and disproportionation reactions of enzymatic reactions

2.3 AA-2G 的定性與定量測定

使用HPLC 色譜法分析AA-2G 的含量，由于VC與AA-2G 的結構相似度較高，在238 nm 處均有吸光度，由圖2 所示，反應樣品AA-2G 和VC的出峰時間分別為9.6 min 和8.9 min，與標準品的出峰時間一致，表明CGTase-T1 具有合成AA-2G 的能力。根據AA-2G 標準曲線，計算所得反應樣品中AA-2G 含量為0.67 g/L，合成產量較低，剩余大量的VC未被消耗，說明糖基受體VC未得到來自糖基供體的糖苷鍵，未生成大量中間體合成產物。據報道，經反應條件優(yōu)化后，來源于Bacillus alkalophilus7-12[38]、Paenibacillussp.[39]、Bacillussp.SK 13.002[40]、Bacillus agaradhaerensY112[41]、Paenibacillus macerans154[42]、Anaerobranca gottschalkii[43]、Bacillus circulans251[43]和Thermoanaerobactersp.[44]的CGTase合成產量分別為0.095、2.98、5.50、10.60、17.50、28.90、35.70 和143.00 g/L，與大多用于合成AA-2G的CGTase 相比，CGTase-T1 的合成產量較低，所以對其反應條件進行優(yōu)化，探究其合成AA-2G 的潛力。

圖2 標準品和反應樣品的HPLC 圖Fig.2 HPLC profile of standard and reaction samples

2.4 AA-2G 酶法合成條件初探

2.4.1 糖基供體對反應的影響 CGTase 可與不同糖基供體生成AA-2G，故尋找合適的糖基供體可增加AA-2G 的產量。由圖3 所示，最適糖基供體為α-CD，其次為γ-CD、可溶性淀粉和麥芽糊精。據報道，可用于合成AA-2G 的大多數CGTase 的最適糖基供體為α-CD，它與CGTase 有著較高的專一性，致使其轉化率高于其他糖基供體[45]，而γ-CD 雖然有較高的溶解度和較大的空腔能包接較大的分子[36]，但當α-CD 和γ-CD 用于AA-2G 合成時，會導致生產成本過高，不利于AA-2G 的大規(guī)模工業(yè)生產。各組之間均存在顯著性差異，根據結果，為降低生產成本，故選用價格便宜的可溶性淀粉和麥芽糊精作為糖基供體，用于后續(xù)實驗。

圖3 不同糖基供體對合成反應的影響Fig.3 The effect of different glycosyl donors on the synthesis reaction

2.4.2 底物濃度對反應的影響 為考察底物濃度對AA-2G 合成的影響，選用了不同底物濃度用于AA-2G 的合成。由圖4 所示，當糖基供體為可溶性淀粉時，最適底物濃度為70 g/L，AA-2G 的生成率最高；當糖基供體為麥芽糊精時，最適底物濃度為30 g/L，AA-2G 的生成率最高。同時，發(fā)現在底物濃度過高，如麥芽糊精的濃度超過30 g/L 時,會抑制AA-2G 的合成，導致AA-2G 生成率下降，可能與底物抑制反應機制有關[33]。各組之間只有可溶性淀粉作為糖基供體時，110 g/L 組與30、90 g/L 兩組之間沒有顯著性差異，根據結果，最終選擇可溶性淀粉反應的最適底物濃度為70 g/L，麥芽糊精反應的最適底物濃度為30 g/L。

圖4 不同底物濃度對合成反應的影響Fig.4 Effects of different substrate concentrations on the synthesis reaction

2.4.3 pH 對反應的影響 為考察pH 對AA-2G 合成的影響，選用了不同pH 的緩沖液用于AA-2G 的合成。由圖5 所示，當可溶性淀粉為糖基供體時，最適pH 為4.5，當pH 大于4.5 之后，AA-2G 的產量近乎直線下降；當麥芽糊精為糖基供體時，最適pH 為5.0，當pH 大于5.0 之后，AA-2G 的產量減少到與pH4.5 時基本相同。結果表明，該酶是一種酸性CGTase，隨著pH 的增加，對AA-2G 的合成影響增大，與宋凱[34]的研究結果相一致?？赡苁荲C在高pH 下不穩(wěn)定[17]，在不同pH 條件下底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)不同，從而影響酶和底物的結合，影響酶的穩(wěn)定性[46],導致AA-2G 的產量變低。各組之間均存在顯著性差異，根據結果，最終選擇可溶性淀粉的最適反應pH 為4.5，麥芽糊精的最適反應pH 為5.0。

圖5 不同pH 對合成反應的影響Fig.5 The effect of different pH on the synthesis reaction

2.4.4 溫度對反應的影響 為考察溫度對AA-2G合成的影響，選用了不同溫度用于AA-2G 的合成。由圖6 所示，當可溶性淀粉和麥芽糊精為糖基供體時，最適溫度均為37 ℃。當溫度低于37 ℃時，AA-2G 產量隨溫度的上升而增加，而當溫度高于37 ℃時，AA-2G 的產量明顯下降?？赡苁菧囟冗^低不利于CGTase 的活性反應，而當溫度過高時VC會降解[17]，AA-2G 在高溫時也會容易分解[47]，均導致AA-2G 產量降低。而單麗媛等[48]以可溶性淀粉和VC為底物，其反應最適溫度為15 ℃，相比而言，其最適溫度較低，可能是由于酶的來源不同，在低溫下其活性較高。各組之間均存在顯著性差異，根據結果，最終選擇可溶性淀粉和麥芽糊精的最適反應溫度均為37 ℃。

圖6 不同溫度對合成反應的影響Fig.6 The effect of different temperatures on the synthesis reaction

2.4.5 底物比例對反應的影響 為考察底物比例對AA-2G 合成的影響，選用了不同底物比例用于AA-2G 的合成。由圖7 所示，當可溶性淀粉為糖基供體時，最適底物比例為3/3（VC/糖基供體，w/w），為等比比例；當麥芽糊精為糖基供體時，最適底物比例為4/2（VC/糖基供體，w/w），為倍比比例。結果表明，不同的糖基供體用于AA-2G 合成時，它們的底物比例會有所差異，可能是因為酶對底物的特異性不同，且底物比例過高或過低都容易造成低含量底物供應不足，而不利于AA-2G 的合成，與黃燕等[49]對底物比例優(yōu)化的結果一致。各組之間均存在顯著性差異，根據結果，最終選擇可溶性淀粉反應的最適底物比例為3/3，麥芽糊精反應的最適底物比例為4/2。

圖7 不同底物比例對合成反應的影響Fig.7 The effect of different substrate ratios on the synthesis reaction

2.4.6 蛋白濃度對反應的影響 為考察蛋白濃度對AA-2G 合成的影響，選用了不同蛋白濃度用于AA-2G 的合成。由圖8 所示，當可溶性淀粉和麥芽糊精為糖基供體時，最適蛋白濃度均為5.0 mg/mL。當蛋白濃度超過5.0 mg/mL 時，AA-2G 的產量逐漸下降，表明過高的蛋白濃度不利于AA-2G 的合成。隨著加酶量的增加，AA-2G 的產量并沒有增加，可能是因為CGTase 是一種多功能酶，可以催化4 種反應，其中歧化反應和耦合反應可以降解糖基供體產生小分子糖，隨著加酶量的增加，這2 種反應強度增強，小分子糖增多，而小分子糖的存在會使得該酶的耦合反應加劇，使小分子糖無法與受體結合，從而降低AA-2G 的產量[32]。各組之間均存在顯著性差異，根據結果，最終選擇可溶性淀粉和麥芽糊精反應的最適蛋白濃度均為5.0 mg/mL。

圖8 不同蛋白濃度對合成反應的影響Fig.8 The effect of different protein concentrations on the synthesis reaction

2.4.7 時間對反應的影響 為考察時間對AA-2G合成的影響，選用了不同的反應時間合成AA-2G。由圖9 所示，AA-2G 的產量隨著反應時間的增加而逐漸增加。當可溶性淀粉為糖基供體時，反應42 h后AA-2G 的產量達到最高（12.68 g/L）；當麥芽糊精為糖基供體時，反應30 h 后AA-2G 的產量達到最高（4.96 g/L），它們分別是未優(yōu)化反應條件產量的18.93倍和7.40 倍。在反應初期處于消耗底物的快速反應期，6 h 后開始逐漸變得平緩，反應后期隨著底物和酶的消耗反應逐漸停止，可溶性淀粉作為糖基供體時，初始合成速度更快，合成產量更高，可能是由于不同糖基供體對酶的親和力不同而影響了反應的快慢和合成的產量[45]，而且較少的反應時間和較高的產量有利于降低生產成本，提高反應效率。各組之間均存在顯著性差異，根據結果，最終選擇可溶性淀粉的最適反應時間為42 h，麥芽糊精的最適反應時間為30 h。

圖9 不同反應時間對合成反應的影響Fig.9 The effect of different reaction times on the synthesis reaction

2.5 AA-2G 的酶法合成動力學分析

為考察CGTase-T1 合成AA-2G 的動力學，選用了不同濃度的底物用于AA-2G 的合成。經數據擬合后，得到CGTase-T1 合成AA-2G 反應的Lineweaver-Burk 曲線（圖10）。線性擬合結果符合底物抑制反應機制，表明底物會對AA-2G 的合成產生抑制作用。帶入其公式中，得到酶法合成AA-2G 的動力學參數，由表2 所示，可溶性淀粉的Kcat值高于麥芽糊精，表明可溶性淀粉合成AA-2G 反應中的催化效率較高，致使其合成AA-2G 的產量高于麥芽糊精。而且可溶性淀粉的KmA高于麥芽糊精，表明在不同糖基供體合成時，酶對不同底物的特異性不同，會影響CGTase-T1 與底物的親和力，可能與底物作用力有關[50]，故選用合適的糖基供體有利用AA-2G 的產量的增加。

表2 動力學參數Table 2 Kinetic parameters

圖10 麥芽糊精（a）和可溶性淀粉（b）合成AA-2G 反應的Lineweaver-Burk 曲線Fig.10 Lineweaver-Burk curve of maltodextrin (a) and soluble starch (b) synthesis of AA-2G

3 結論

本研究將異源表達的CGTase-T1 用于合成AA-2G，經高效液相色譜法分析后，得到含量為0.67 g/L的AA-2G，合成量較少。為增加CGTase-T1 合成AA-2G 的產量，依次對糖基供體、底物濃度、反應pH、反應溫度、底物比例、蛋白濃度和反應時間進行了單因素優(yōu)化。當糖基供體為可溶性淀粉時，AA-2G 最優(yōu)合成條件是：底物濃度70 g/L，反應pH4.5，反應溫度37 ℃，底物比例3/3（VC/糖基供體），蛋白濃度5.0 mg/mL，反應時間42 h；當糖基供體為麥芽糊精時，AA-2G 最優(yōu)合成條件是：底物濃度30 g/L，反應pH5.0，反應溫度37 ℃，底物比例4/2，蛋白濃度5.0 mg/mL，反應時間30 h。在最適條件下，AA-2G 的最高產量分別為12.68 g/L 和4.96 g/L，是未優(yōu)化反應條件下的18.93 倍和7.40 倍。同時，對其合成AA-2G 的動力學分析進行分析，發(fā)現糖基供體可溶性淀粉的催化效率高于麥芽糊精，致使其AA-2G 的產量較高，表明此酶對可溶性淀粉的特異性優(yōu)于麥芽糊精，可溶性淀粉更適合作為此酶的糖基供體合成AA-2G。

CGTase 是AA-2G 工業(yè)生產中主要用酶，但生產成本和轉化率限制了大規(guī)模AA-2G 的工業(yè)生產，導致其價格昂貴。而本研究以可溶性淀粉和麥芽糊精作為AA-2G 合成的底物，降低了生產成本，可為其AA-2G 的工業(yè)化生產提供參考。但本研究仍存在蛋白可溶性表達量不足，產物特異性差異大、底物轉化率低、合成產量不足等問題，后續(xù)可將CGTase-T1 進行分子改造，改善酶的穩(wěn)定性和底物特異性，進一步提高AA-2G 的產量。