JAK/STAT通路介導(dǎo)免疫缺陷大鼠CD4+T細(xì)胞分化的研究

謝小麗，張予晉，譚瑤，鄧玉霞，卜佑青，錢珍珍，巴玉琛，王軍文

〔摘要〕 目的 基于酪氨酸激酶/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription， JAK/STAT）信號(hào)通路與免疫缺陷性疾病中CD4+T細(xì)胞占比減少的相關(guān)性，探討免疫缺陷大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞分化的機(jī)制。方法 將SPF級(jí)SD大鼠48只，隨機(jī)分為正常大鼠（24只）和模型大鼠（24只），采用環(huán)孢素制備免疫缺陷模型。每組隨機(jī)選6只驗(yàn)證造模效果，將剩余36只大鼠分為正常組、低魯組、高魯組、模型組、模型低魯組、模型高魯組，每組6只。低魯組和模型低魯組分別注射1.75 mg·kg-1魯索利替尼，高魯組和模型高魯組分別注射3.5 mg·kg-1魯索利替尼，正常組和模型組注射1.75 mg·kg-1生理鹽水，隔日1次，共注射6次。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞百分比，計(jì)算大鼠脾臟和胸腺指數(shù)，HE染色法觀察脾臟和胸腺病理改變，ELISA檢測(cè)白細(xì)胞介素-2（interleukin-2， IL-2）、γ-干擾素（interferon-γ， IFN-γ）、白細(xì)胞介素-12（interleukin-12， IL-12）、白細(xì)胞介素-4（interleukin-4， IL-4）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10， IL-10）細(xì)胞因子表達(dá)量，Western blot檢測(cè)脾臟組織中酪氨酸激酶2（Janus kinase 2， JAK2）、Ｔ盒家族轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)蛋白（T-box family transcription factor expression protein， T-bet）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白4（signal transducer and activator of transcription 4， STAT4）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（signal transducer and activator of transcription 6， STAT6）和GATA結(jié)合蛋白-3（GATA-binding protein-3， GATA3）蛋白表達(dá)量。結(jié)果 模型組大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、胸腺指數(shù)較正常組明顯下降（P＜0.05）。與正常組比較，模型組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比減少（P＜0.05），IL-2、IFN-γ和IL-12表達(dá)量下降（P＜0.01），IL-10表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組相比，模型高魯組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、胸腺和脾臟指數(shù)、IL-2、IFN-γ顯著下降（P＜0.05），而GATA3、STAT6蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），IL-6、IL-10表達(dá)量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 免疫缺陷疾病以CD4+T淋巴細(xì)胞減少為主要特征，CD4+T細(xì)胞亞群失調(diào)與JAK/STAT信號(hào)通路表達(dá)失衡有關(guān)，其機(jī)制可能與IL-12/STAT4通路表達(dá)下調(diào)和IL-4/STAT6通路表達(dá)上調(diào)有關(guān)，CD4+T淋巴細(xì)胞分化由輔助性T細(xì)胞1（helper T cell 1， Th1）向輔助性T細(xì)胞2（helper T cell 2， Th2）漂移，造成Th1/Th2失衡，引發(fā)免疫缺陷。

〔關(guān)鍵詞〕 免疫缺陷；JAK/STAT信號(hào)通路；Th1/Th2；白細(xì)胞介素-12；白細(xì)胞介素-4；信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白4；信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6

〔中圖分類號(hào)〕R275? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.009

JAK/STAT pathway-mediated CD4+T cell differentiation

in immunodeficient rats

XIE Xiaoli1， ZHANG Yujin2， TAN Yao3， DENG Yuxia3， BU Youqing3， QIAN Zhenzhen3，

BA Yuchen3， WANG Junwen2，3*

1. Hunan Provincial Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine， Changsha， Hunan 410006， China;

2. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China;

3. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the mechanism of CD4+T lymphocyte differentiation in immunodeficient rats based on the correlation between Janus kinase/signal transducer and activator of transcription （JAK/STAT） signaling pathway and a low percentage of CD4+T lymphocytes in immunodeficiency diseases. Methods A total of 48 SPF SD rats were randomly divided into normal group （n=24） and modeling group （n=24）， and the immunodeficiency models were established using cyclosporine. Then 6 rats were randomly selected from each group to verify the modeling effects. After modeling， the remaining 18 normal rats were subdivided into normal group， low-， and high-dose ruxolitinib groups， while the remaining 18 model rats into model group， low- and high-dose ruxolitinib model groups， with 6 rats in each group. Low-dose ruxolitinib group and low-dose ruxolitinib model group were injected with 1.75 mg·kg-1 ruxolitinib， high-dose ruxolitinib group and high-dose ruxolitinib model group were injected with 3.5 mg·kg-1 ruxolitinib， while normal group and model group were injected with 1.75 mg·kg-1 normal saline， once every other day， with a total of 6 injections in each group. Then， the percentage of CD4+T and CD8+T lymphocytes was determined by flow cytometry; the spleen and thymus indexes of rats were calculated; the pathological changes of the spleen and thymus were observed by HE staining; the expression levels of interleukin-2 （IL-2）， interferon-γ （IFN-γ）， interleukin-12 （IL-12）， interleukin-4 （IL-4）， interleukin-6 （IL-6）， and interleukin-10 （IL-10） were examined by ELISA; Western blot was used to check the expression levels of Janus kinase 2 （JAK2）， T-box family transcription factor expression protein （T-bet）， signal transducer and activator of transcription 4 （STAT4）， signal transducer and activator of transcription 6 （STAT6）， and GA TA-binding protein-3 （GATA3） in the spleen. Results The percentage of CD4+T lymphocytes and the thymus index in model group were significantly lower than those in normal group （P<0.05）. Compared with normal group， the percentage of CD4+T lymphocytes in model group decreased （P<0.05）， so did the expression levels of IL-2， IFN-γ， and IL-12 （P<0.01）， but the expression level of IL-10 increased （P<0.05）. Compared with model group， the percentage of CD4+T lymphocytes， the thymus and spleen indexes， and the expression levels of IL-2 and IFN-γ in high-dose ruxolitinib model group were significantly lower （P<0.05）， while the expression levels of GATA3 and STAT6 proteins were higher （P<0.05） and those of IL-6 and IL-10 significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Immunodeficiency diseases are broadly characterized by reduction in CD4+T lymphocytes， and the dysregulation of CD4+T cell subsets is related to the imbalance of JAK/STAT signaling pathway expression， with the possible mechanism of down-regulation of IL-12/STAT4 pathway expression and up-regulation of IL-4/STAT6 pathway expression. In addition， CD4+T lymphocyte differentiation drifts from helper T cell 1 （Th1） to helper T cell 2 （Th2）， thus resulting in Th1/Th2 imbalance， which induces immunodeficiency.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 immunodeficiency; Janus kinase/signal transducer and activator of transcription signaling pathway; helper T cell 1/helper T cell 2; interleukin-12; interleukin-4; signal transducer and activator of transcription 4; signal transducer and activator of transcription 6

人體感染人類免疫缺陷病毒（human immunode？鄄ficiency virus， HIV）后通常會(huì)發(fā)生免疫系統(tǒng)功能缺陷，HIV主要損害的靶細(xì)胞為CD4+T淋巴細(xì)胞，可能會(huì)導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞的各項(xiàng)功能受到限制。CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)和治療效果的重要免疫學(xué)指標(biāo)之一[1]。CD4+T淋巴細(xì)胞是影響機(jī)體健康和疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[2]。研究表明[3-5]，HIV引起的免疫異常有CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、CD4+T淋巴細(xì)胞功能障礙和異常免疫激活。CD4+T淋巴細(xì)胞被激活后，在不同的分化途徑中具有不同的生物學(xué)功能。CD4+T細(xì)胞主要分為輔助性T細(xì)胞1（helper T cell 1， Th1）和輔助性T細(xì)胞2（helper T cell 2， Th2）細(xì)胞亞群，Th1細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-12（interleukin-12， IL-12）、γ-干擾素（interferon-γ， IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2， IL-2）等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫[6-7]；而Th2細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-4（interleukin-4， IL-4）、白細(xì)胞介素-5（interleukin-5， IL-5）等細(xì)胞因子介導(dǎo)機(jī)體體液免疫。酪氨酸激酶/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription， JAK/STAT）信號(hào)通路的持續(xù)激活與許多免疫性疾病、炎癥和腫瘤等密切相關(guān)[8-10]，不同STAT蛋白在參與細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有高度特異性，信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription， STAT）調(diào)控CD4+T細(xì)胞向Th1方向分化[11]，轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（signal transducer and activator of transcription 6， STAT6）調(diào)控CD4+T細(xì)胞向Th2方向分化[12]，轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白4（signal transducer and activator of transcription 4， STAT4）和STAT6介導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，都是通過JAK/STAT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。大量研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，JAK/STAT信號(hào)通路是由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及免疫調(diào)節(jié)等重要過程。

在艾滋病的研究中可以建立免疫缺陷動(dòng)物模型開展相關(guān)研究[16]。環(huán)孢素對(duì)大鼠免疫抑制的作用，以CD4+T淋巴細(xì)胞占比減少為主要特征性表現(xiàn)，這與感染HIV引起的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少和免疫異常有高度相似性，較好地模擬了機(jī)體免疫缺陷狀態(tài)，為該疾病的免疫相關(guān)研究提供了合適的動(dòng)物模型[17-19]。本研究通過使用環(huán)孢素誘導(dǎo)大鼠免疫缺陷模型，模擬艾滋病的免疫缺陷狀態(tài)，探討JAK/STAT信號(hào)通路與免疫缺陷大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞分化的相關(guān)性。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠48只，雄雌各半，體質(zhì)量120～150 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009，飼養(yǎng)條件：溫度22～26 ℃，濕度50%～70%。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：LLBH-202103230003。

1.2? 藥物

環(huán)孢素（杭州中美華東制藥有限公司，批號(hào)：H10960121）。魯索利替尼（美國Good Laboratory Practice Bioglence公司，批號(hào)：GC37575）。

1.3? 主要試劑

大鼠CD3抗體、大鼠CD8抗體、大鼠CD4抗體（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：70-AR00301-50、70-AR008A0205-50、70-AR00404-50）；大鼠IFN-γ、IL-2、IL-4、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10， IL-10）、白細(xì)胞介素-12（interleukin-12， IL-12）ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號(hào)分別為：JM-01605R、JM-01599R1、JM-01598R1、JM-01597R1、JM-01602R1、JM-01547R1）；JAK2（英國Abcam公司，批號(hào)：ab108596）；STAT6、STAT4、Ｔ盒家族轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)蛋白（T-box family transcription factor expression protein， T-bet）、GATA結(jié)合蛋白-3（GA-TA-binding protein-3， GATA3）、β-actin（美國Proteintech公司，批號(hào)分別為：51073-1-AP、51070-2-AP、13700-1-AP、10417-1-AP、66009-1-Ig）；烏來糖（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S11036）；無水乙醇、二甲苯、氨水、中性樹膠（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)分別為：100092683、10023418、10002118、10004160）；4%多聚甲醛（北京蘭杰柯科技有限公司，批號(hào)：BL539A）；二甲基亞砜（德國Biofroxx公司，批號(hào)：1084）；蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司，批號(hào)：583794）；蘇木精染液套裝（武漢谷歌生物有限公司，批號(hào)：G1005）；顯影液、定影液（上海佳信照相用品有限公司，批號(hào)分別為：BW-61、BW-62）；溶血素（蘇州百源基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：20220101）；細(xì)胞染色緩沖液（美國Biolegend公司，批號(hào)：420201）。

1.4? 主要儀器

水平低速離心機(jī)（美國Thermo公司，型號(hào)：75008800）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號(hào)：LSRFortessa）；脫水機(jī)、包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JJ-12J、JB-P5）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016）；組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器有限公司，型號(hào)：KD-P）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（中國湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）；旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：GL-88B）；普通冰箱（奧克斯集團(tuán)有限公司，型號(hào)：BCD-196A）；精密pH計(jì)（無錫雷磁儀器儀表有限公司，型號(hào)：PHS-3C）；電子天平（美國雙杰，型號(hào)：JJ224BC）；生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：BioPrep-24）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ChemiScope6100）；正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)[尼康映像儀器銷售（中國）有限公司，型號(hào)：Nikon Eclipse E100、Nikon DS-U3]。

2 方法

2.1? 分組與給藥

SD大鼠48只，隨機(jī)分為正常大鼠（24只）和模型大鼠（24只）。造模方法和給藥劑量參照前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果和參考文獻(xiàn)[20-21]，根據(jù)人與動(dòng)物之間體表面積折算[22]而成，模型大鼠按照17.5 mg·kg-1的劑量腹腔注射環(huán)孢素，隔日1次，共注射3次。正常大鼠同步腹腔注射等量生理鹽水。每天定期觀察正常大鼠和模型大鼠的一般癥狀，在末次注射第2天隨機(jī)選取正常大鼠與模型大鼠各6只，分別檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群百分比、脾臟和胸腺臟器指數(shù)，根據(jù)一般癥狀和相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)判斷免疫缺陷模型構(gòu)建是否成功，當(dāng)大鼠逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少、反應(yīng)遲緩、毛發(fā)松散、毛發(fā)無光澤等表現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞亞群百分比下降時(shí)，提示免疫缺陷動(dòng)物模型建立成功[20-21]。在成功建立免疫缺陷模型當(dāng)天，將剩余18只正常大鼠和18只免疫缺陷大鼠分別重新分組，其中正常大鼠分為正常組、低魯組、高魯組，免疫缺陷大鼠分為模型組、模型低魯組、模型高魯組，每組6只。參照相關(guān)文獻(xiàn)[23]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，低魯組和模型低魯組按照1.75 mg·kg-1的劑量腹腔注射JAK抑制劑魯索利替尼，高魯組和模型高魯組按照3.5 mg·kg-1的劑量腹腔注射JAK抑制劑魯索利替尼，正常組和模型組同步腹腔注射1.75 mg·kg-1生理鹽水，隔日1次，共注射6次。

2.2? 標(biāo)本采集與指標(biāo)觀察

每只大鼠稱重后，用25%烏來糖腹腔注射麻醉，采集血液和胸腺、脾臟組織。

2.2.1? 一般表現(xiàn)? 造模過程中每天觀察正常大鼠與模型大鼠的進(jìn)食、飲水、精神狀態(tài)、毛發(fā)表現(xiàn)等一般表現(xiàn)。

2.2.2? 各組CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比測(cè)定? 取對(duì)應(yīng)數(shù)量流式管，在每管中加入CD3/CD4/CD8抗體各5 μL，然后加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的外周血100 μL，室溫避光孵育15 min。加入100 μL溶血素，室溫避光孵育10 min，然后加入1 mL去離子水，震蕩混勻，室溫避光孵育10 min。離心5 min，棄上清液，PBS洗滌細(xì)胞2～3次；加入500 μL細(xì)胞染色緩沖液，重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

2.2.3? 脾臟和胸腺指數(shù)檢測(cè)? 脾臟和胸腺組織稱重后分別計(jì)算臟器指數(shù)，計(jì)算公式為：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.2.4? HE染色觀察各組脾臟、胸腺組織學(xué)變化? 用4%多聚甲醛固定胸腺、脾臟組織，經(jīng)過石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀測(cè)胸腺、脾臟組織變化。

2.2.5? ELISA檢測(cè)大鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-6、IL-10的表達(dá)? 取出于-80 ℃保存的大鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別檢測(cè)IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-6、IL-10水平。

2.2.6? Western blot檢測(cè)脾臟組織中JAK2、T-bet、GATA3、STAT4、STAT6蛋白水平的表達(dá)? 取大鼠脾臟組織，加入預(yù)冷含PBS的RIPA裂解液提取蛋白，取200 μL蛋白上清液，加50 μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果電泳，按照分子量分別切膠后轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉90 min。一抗孵育4 ℃過夜，第2天室溫下放置30 min。4 ℃過夜后PBST洗3次，二抗孵育90 min后PBST洗3次，ECL顯色、曝光、顯影和觀察。

2.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，兩組間比較符合正態(tài)分布者用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者用秩和檢驗(yàn)；多組間比較符合正態(tài)分布及方差齊性者選用單因素方差分析，若方差齊，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Games-Howell檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布者，采用非參數(shù)Kruskal wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 造模評(píng)價(jià)

3.1.1? 一般表現(xiàn)? 與正常大鼠相比，模型大鼠逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少、反應(yīng)遲緩、毛發(fā)松散、毛發(fā)無光澤等表現(xiàn)，初步判斷免疫缺陷動(dòng)物模型建立成功。

3.1.2? CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比? 與正常大鼠比較，模型大鼠的CD4+T淋巴細(xì)胞百分比下降（P＜0.05），CD8+T淋巴細(xì)胞百分比上升（P＜0.05）。詳見表1。

3.1.3? 脾臟和胸腺指數(shù)? 與正常大鼠比較，模型大鼠的胸腺指數(shù)下降（P＜0.05），脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

3.2? 各組CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比比較

與正常組相比，高魯組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比下降（P＜0.05），而CD8+T淋巴細(xì)胞百分比上升（P＜0.05），模型組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比下降（P＜0.05）；與模型組比較，模型低魯組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比上升（P＜0.05），模型高魯組CD4+T淋巴細(xì)胞比例下調(diào)（P＜0.05）；與模型低魯組比較，模型高魯組CD4+T百分比降低（P＜0.05），CD8+T百分比升高（P＜0.05）。詳見表3、圖1。

3.3? 各組脾臟和胸腺指數(shù)比較

模型組胸腺指數(shù)比正常組下降（P＜0.05）；與模型組比較，模型高魯組脾臟和胸腺指數(shù)均下降（P＜0.05）；與低魯組比較，模型低魯組胸腺指數(shù)明顯下降（P＜0.01）；與高魯組比較，模型高魯組脾臟和胸腺指數(shù)均下降（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表4。

3.4? 各組脾臟和胸腺病理形態(tài)學(xué)比較

3.4.1? 脾臟組織病理變化? 正常組大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)輪廓清晰，紅髓和白髓界限明顯，可見生發(fā)中心；與正常組比較，模型組、低魯組、高魯組紅髓和白髓界限稍欠清晰；模型低魯組結(jié)構(gòu)稍欠清晰，部分脾小結(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，但紅髓中性粒細(xì)胞未見明顯增多；模型高魯組脾臟組織結(jié)構(gòu)重度異常，大量脾小結(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，紅髓白髓邊界不清，紅髓中性粒細(xì)胞數(shù)量增多。詳見圖2。

3.4.2? 胸腺組織病理變化? 正常組大鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)正常，皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)界限不清，可見部分胸腺上皮細(xì)胞增生，髓質(zhì)內(nèi)見部分巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；低魯組和高魯組胸腺皮質(zhì)較正常組增厚；模型低魯組和模型高魯組皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)界限不清，其中模型高魯組皮質(zhì)區(qū)大量胸腺上皮細(xì)胞增生，血管上皮細(xì)胞增生，血管壁增厚，髓質(zhì)內(nèi)見大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見圖3。

3.5? 各組血清IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-6、IL-10表達(dá)比較

與正常組比較，低魯組IFN-γ表達(dá)下降（P＜0.05），高魯組、模型組IL-2、IFN-γ、IL-12表達(dá)均下降（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，模型高魯組IL-2、IFN-γ表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-12也有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低魯組比較，模型低魯組IL-2、IFN-γ、IL-12表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）；與高魯組比較，模型高魯組IL-2、IFN-γ、IL-12表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表5。

與正常組對(duì)比，低魯組IL-10表達(dá)量增加（P＜0.05），高魯組中IL-6、IL-10表達(dá)量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），模型組中IL-10表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），其中IL-4、IL-6也有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，模型低魯組IL-10表達(dá)量顯著上升（P＜0.01），模型高魯組IL-6、IL-10表達(dá)量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），其中IL-4也呈上升趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低魯組比，模型低魯組IL-4、IL-6、IL-10表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）；與高魯組比，模型高魯組IL-4、IL-6、IL-10表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表6。

3.6? 各組脾臟組織JAK2、T-bet、STAT4、GATA3、STAT6蛋白表達(dá)量水平比較

與正常組比較，低魯組和高魯組的T-bet蛋白表達(dá)量減少（P＜0.05），而STAT6蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05），模型組STAT6蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05）；與模型組比較，模型高魯組JAK2、T-bet、STAT4蛋白表達(dá)量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），GATA3和STAT6蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05）；與低魯組比較，模型低魯組GATA3和STAT6蛋白表達(dá)量增加（P＜0.01）；與高魯組比較，模型高魯組GATA3和STAT6蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖4、表7。

4 討論

環(huán)孢素通過影響T細(xì)胞接觸的表面分子表達(dá)和細(xì)胞因子分泌，誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)方向的改變[24]，它也能夠特異性抑制T細(xì)胞中CD4+T的活化，作用于不同的細(xì)胞因子，例如影響IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)[25]。環(huán)孢素誘導(dǎo)的免疫抑制大鼠，主要表現(xiàn)為CD4+T淋巴細(xì)胞占比減少，這與感染HIV引起的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少有高度相似性，較好地模擬了機(jī)體免疫缺陷狀態(tài)。

T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫中的主要效應(yīng)細(xì)胞[26]。研究發(fā)現(xiàn)[27]，細(xì)胞因子對(duì)CD4+T細(xì)胞分化有重要的調(diào)控作用。IL-12、IFN-γ可以誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，Th1主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-β、IL-12等參與機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過IL-4的誘導(dǎo)，CD4+T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞，Th2分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等參與機(jī)體體液免疫應(yīng)答。正常生理狀態(tài)下，Th1/Th2之間基本處于相對(duì)平衡狀態(tài)。當(dāng)CD4+T淋巴細(xì)胞分化出現(xiàn)偏移，向Th1漂移或Th2漂移，使得Th1/Th2之間的動(dòng)態(tài)平衡消失，導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答進(jìn)入病理狀態(tài)，從而影響相應(yīng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。此外，轉(zhuǎn)錄因子也是影響CD4+T細(xì)胞分化的重要因素之一，STAT轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化及其向細(xì)胞核的傳導(dǎo)是調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的重要步驟[28-29]。研究表明[30-32]，JAK/STAT信號(hào)通路與CD4+T淋巴細(xì)胞分化密切相關(guān)。因此，JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)檢測(cè)可以在一定程度上反映體內(nèi)和體外淋巴細(xì)胞亞群的功能性免疫反應(yīng)狀態(tài)[33]。

本研究結(jié)果顯示，模型組CD4+T淋巴細(xì)胞百分比較正常組下降，模型組大鼠胸腺指數(shù)下降、胸腺病理結(jié)構(gòu)異常，其脾臟結(jié)構(gòu)輕微異常。在免疫抑制劑的作用下，胸腺比脾臟更容易受到損害，出現(xiàn)明顯萎縮，胸腺功能障礙在器官特異性自身免疫的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[34]。魯索利替尼是JAK1/JAK2選擇性抑制劑[35]，通過魯索利替尼干預(yù)免疫缺陷大鼠，可以在一定程度上抑制JAK/STAT通路，抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明CD4+T細(xì)胞減少可能與JAK/STAT通路相關(guān)，因此，需進(jìn)一步深入探究該疾病中CD4+T淋巴細(xì)胞具體分化方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠IL-4激活STAT6后，引起Th2方向的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT6和IL-10細(xì)胞因子表達(dá)增加，相應(yīng)地抑制Th1方向中細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，導(dǎo)致Th1/Th2失衡，模型組大鼠CD4+T細(xì)胞向Th2漂移，導(dǎo)致免疫缺陷。與模型組比較，模型高魯組轉(zhuǎn)錄因子GATA3、STAT6蛋白持續(xù)高表達(dá)，相應(yīng)地抑制了轉(zhuǎn)錄因子T-bet、STAT4蛋白的表達(dá)；同時(shí)，模型高魯組IL-2、IFN-γ表達(dá)顯著降低；但I(xiàn)L-6、IL-10表達(dá)量明顯增加。這表明導(dǎo)致免疫缺陷的機(jī)制可能是IL-12/STAT4通路表達(dá)受抑制，而Th2相關(guān)的細(xì)胞因子和蛋白表達(dá)亢進(jìn)，使其具有向Th2亞型分化的優(yōu)勢(shì)，Th1/Th2失衡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該疾病以CD4+T淋巴細(xì)胞減少為主要特征，CD4+T細(xì)胞亞群失調(diào)與JAK/STAT信號(hào)通路表達(dá)失衡有關(guān)，其機(jī)制可能與IL-12/STAT4通路表達(dá)下調(diào)和IL-4/STAT6通路表達(dá)上調(diào)有關(guān)，CD4+T淋巴細(xì)胞分化由Th1向Th2漂移，造成Th1/Th2失衡引發(fā)免疫缺陷。人體Th1/Th2的免疫平衡，在中醫(yī)理論上即陰與陽平衡。陰與陽的對(duì)立制約、消長(zhǎng)平衡，維持其陰平陽秘，陰陽之間保持動(dòng)態(tài)平衡。在現(xiàn)代研究中，當(dāng)Th1與Th2之間維持相對(duì)平衡，則機(jī)體可以維持正常免疫應(yīng)答。尤如《素問·生氣通天論》中所述：“陰平陽秘，精神乃治，陰陽離絕，精氣乃絕?！标幣c陽兩者之間互相調(diào)節(jié)，陰陽平和，生命活動(dòng)正常。在治療方面，應(yīng)保持Th1/Th2的動(dòng)態(tài)平衡，從而調(diào)節(jié)免疫缺陷大鼠的免疫功能。因此，IL-4/STAT6與IL-12/STAT4通路可作為未來藥物治療的潛在靶點(diǎn)，以期糾正Th1/Th2失衡，改善免疫缺陷狀態(tài)。

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（本文編輯? 周? 旦）